Efecto de la transferencia artificial de mitocondrias obtenidas desde línea celular hsc-3 sobre el fenotipo y metabolismo de linfocitos t cd4+.

Abstract

El carcinoma oral de células escamosas (OSCC) es el tipo de cáncer oral más frecuente en Chile y el mundo. Se ha reportado que el microambiente tumoral del OSCC induce una alteración del linfocito T, promoviendo un fenotipo exhausto y una reprogramación metabólica. El organelo principal del metabolismo es la mitocondria y en los últimos años se ha indicado que diversas células tienen la capacidad de transferir mitocondrias, incluyendo la cancerosa. Sin embargo, a la fecha no se ha evaluado si la transferencia de mitocondrias desde células cancerosas hacia los linfocitos T promueve un fenotipo exhausto en el linfocito T helper. El objetivo de este trabajo fue analizar el fenotipo exhausto junto con cambios metabólicos en linfocitos TCD4+ post transferencia artificial de mitocondrias (MitoCeption) obtenidas desde la línea celular de cáncer oral HSC-3. La metodología se basó en la estandarización de la transferencia mitocondrial artificial utilizando mitocondrias aisladas y marcadas con MitoTrackerGreen desde células de cáncer oral hacia linfocitos T CD4+ a través de MitoCeption. Luego, se analizó la expresión de moléculas de superficie, proliferación y secreción de citoquinas mediada por transferencia mitocondrial tumoral a través de citometría de flujo para así analizar el fenotipo exhausto. Además, se analizó el metaboloma, la producción de superóxido y el metabolismo de la glucosa como lo es la captación y consumo de glucosa y concentración de lactato. En los resultados se observó que los linfocitos TCD4+ que adquirieron mitocondrias presentaron un alza en la expresión de 2 proteínas inhibidoras (TIGIT y CTLA4) y 3 asociadas con fenotipo exhausto (PD-1, PLD-1 y LAG3), en comparación con el grupo control. Además, los linfocitos mitoceptados exhibieron una disminución significativa en la proliferación en comparación con las células control, no mitoceptadas. Para el análisis de citoquinas, se observó una disminución significativa en el grupo mitoceptado en la secreción de IFN-gamma, TNF-alpha, IL-10 e IL-4, citoquinas de la vía TH1 y TH2 en comparación con el control. Los análisis metabolómicos mostraron una reducción del cofactor de la piruvato deshidrogenasa denominado Vitamina B1 o tiamina y un aumento en la producción de superóxido mitocondrial en el grupo mitoceptado versus el control. También se observó un mayor consumo y captación de glucosa en los linfocitos TCD4+ mitoceptados con mitocondria tumoral, además de una mayor concentración de lactato en el sobrenadante de estas células a diferencia del control. Por lo tanto, la adquisición de mitocondrias aisladas desde células cancerosas HSC-3 por el linfocito T CD4+ induce estrés oxidativo mitocondrial en la célula receptora y una posible reducción del ciclo de Krebs, mediada por la baja de tiamina. Este efecto promueve un metabolismo glicolítico de rescate y un cambio en la funcionalidad del linfocito, promoviendo un fenotipo exhausto y una célula TCD4+ disfuncional, afectando así la respuesta anti-tumoral.

Oral squamous cell carcinoma (OSCC) is the most frequent type of oral cancer in Chile and the world. Has been reported that the OSCC tumour microenvironment (TME) induces impaired T cell responses, promoting an exhausted phenotype and metabolic reprogramming. The mitochondria is the main metabolic organelle and in recent years it has been shown that several cells have the capacity to transfer mitochondria, including cancer cells. However, to date, it has not been evaluated whether mitochondrias transfer from cancer cells to T lymphocytes promotes an exhausted phenotype in T helper cells. The aim of this work was to analyse the exhausted phenotype with metabolic changes in TCD4+ lymphocytes after artificial transfer of mitochondria (MitoCeption) obtained from the oral cancer cell line HSC-3. The methodology was based on the standardization of artificial mitochondrial transfer using isolated mitochondria and labelled with MitoTrackerGreen from oral cáncer cells to CD4+ T lymphocytes through MitoCeption. Then, surface molecule expression, proliferation and cytokine secretion mediated by tumor mitochondrial transfer were analyzed by flow cytometry in order to analysed the exhausted phenotype. Also, it was analysed the metabolome, the production of superoxide and glucose metabolism such as the catchment and consumption of glucose and concentration of lactate. The results showed that TCD4+ lymphocytes that acquired mitochondria had increased expression of 2 inhibitory proteins (TIGIT and CTLA4) and 3 proteins associated with exhausted phenotype (PD-1, PLD-1 and LAG3), compared to the control group. In addition, the mitocepted lymphocytes exhibited a significant decrease in proliferation compared to the control, non-mitocepted cells. For cytokine analysis, a significant decrease was observed in the mitocepted group in the secretion of IFN-gamma, TNF-alpha, IL-10, and IL-4, TH1 and TH2 pathway cytokines compared to control. Metabolomic analysis showed a reduction in the pyruvate dehydrogenase cofactor called Vitamin B1 or thiamine and an increase in mitochondrial superoxide production in the mitocepted group versus the control. Also, its observed a high catchment and consumption of glucose in mitocepted CD4+ lymphocyte with tumoral mitochondria, in addition of a higher concentration of lactate in supernatant of this cells unlike the control. Therefore, the acquisition of isolated mitochondria from HSC-3 cancer cells by CD4+ T lymphocyte induces mitochondrial oxidative stress in the recipient cell and a possible reduction of the Krebs cycle, mediated by low thiamine. This effect promotes a salvage glycolytic metabolism and a change in lymphocyte functionality, promoting an exhausted phenotype and a dysfunctional TCD4+ cell, thus affecting the anti-tumor response.