La forma oxidada de vitamina C, ácido deshidroascórbico, regula la necroptosis neuronal durante un periodo de isquemia y reperfusión cerebral.

Abstract

La vitamina C es encontrada en dos estados, el estado reducido ácido ascórbico (AA), y su estado oxidado ácido deshidroascórbico (DHA). Bajo condiciones fisiológicas, el AA es el principal antioxidante del sistema nervioso central. Sin embargo, bajo condiciones fisiopatológicas como el infarto cerebral, el AA es oxidado hasta DHA. De manera interesante, el infarto cerebral induce un tipo de muerte particular llamado necroptosis, y hasta la fecha se desconocen los mecanismos iniciadores de la necroptosis en contextos fisiopatológicos. Al mismo tiempo, en diversos modelos celulares se ha propuesto que la acumulación de DHA se encuentra asociado a procesos de muerte con características necróticas. De esta forma, en esta tesis propusimos evaluar si la acumulación intracelular de DHA en la neurona podría inducir muerte por necroptosis. Con el objetivo de poner a prueba nuestra hipótesis, generamos nuestro propio modelo de infarto in vitro, debido a que los modelos convencionales inducen muerte por apoptosis. Nuestro modelo de estudio fue validado inhibiendo la apoptosis, la necroptosis, la fisión mitocondrial y la generación de especies reactivas de oxígeno. Para analizar las características de desintegración celular, utilizamos microscopía confocal espectral de célula viva 4D con 5 canales donde se analizó de manera simultánea la morfología celular, actividad mitocondrial, integridad del núcleo y la integridad de la membrana plasmática. Estos experimentos, fueron un elemento clave para poder determinar el proceso de muerte inducido por la acumulación intracelular de DHA. Los estudios de microscopía de célula viva fueron complementados con análisis morfológicos, utilizando reconstrucciones 3D y cuantificaciones 3D especializadas con el software Imaris, de las células en proceso de muerte. Reforzando estos experimentos, mediante microscopía de super resolución SIM, analizamos en detalle el tamaño y la morfología mitocondrial en condiciones de estrés oxidativo y de acumulación intracelular de DHA. De manera interesante, las reconstrucciones 3D mostraron patrones de distribución no descritos hasta la fecha en respuesta al tratamiento con AA o a la acumulación de DHA, que involucran a los transportadores de vitamina C y a proteínas claves de la necroptosis. Por otra parte, para determinar la participación del AA en el proceso de muerte sobre expresamos, de manera estable mediante infección lentiviral, el transportador de AA SVCT2; y por otro lado, generamos clones KO para SVCT2 a partir de cell sorting de célula única y la tecnología de CRISPR/Cas9, estableciendo la primera línea celular neuronal delecionada para SVCT2 descrita hasta la fecha. Sorprendentemente, encontramos que la acumulación intracelular de DHA en la neurona induce drásticos cambios morfológicos que corresponden a características de desintegración necroptótica. Mas aún, mediante la tecnología de CRISPR/Cas9 delecionamos la proteína ejecutora de la necroptosis, validando de esta forma que DHA puede inducir muerte específicamente por necroptosis. Usando la microscopía de resolución súper SIM para analizar el tamaño y la morfología mitocondrial en condiciones de estrés oxidativo y acumulación de DHA intracelular, encontramos que la oxidación de DHA favorece la fragmentación mitocondrial. Sin embargo, nuestros resultados sugieren que el daño mitocondrial no estaría involucrado en el proceso de muerte. Por lo tanto, nuestro trabajo propone a DHA como una molécula multifacética que podría tener implicaciones en los procesos de muerte no apoptóticos, regulando la necroptosis neuronal en períodos de estrés oxidativo agudo, como el generado durante el accidente cerebrovascular. Finalmente, proponemos que el DHA es un desafío para la comunidad científica para desarrollar nuevos conceptos con importantes implicaciones terapéuticas.