Análisis del efecto de las quimioquinas CXCL9 y CXCL10 sobre la diferenciación in vitro de linfocitos B a células plasmáticas.

Abstract

La investigación sobre la producción de anticuerpos durante la infección por SARS-CoV-2 ha revelado diferencias en los niveles de IgG dependiendo de la gravedad de los síntomas. En pacientes chilenos, se observaron altos niveles de IgG anti-SARS-CoV-2 en aquellos experimentaron una forma grave de la enfermedad, caracterizada por el síndrome de distrés respiratorio agudo severo y la presencia de secuelas pulmonares estructurales tras la infección por COVID-19. Además, se ha observado que las citoquinas y quimioquinas desempeñan un papel relevante en la infección. En particular, CXCL9 y CXCL10 están elevadas en pacientes severos en lo que se conoce como la "tormenta de citoquinas". Datos preliminares sugieren una correlación positiva entre los niveles circulantes de CXCL9 y CXCL10 y los niveles de IgG anti-SARS-CoV-2. Sin embargo, no está claro si estas quimioquinas podrían estar contribuyendo a la exacerbación de la respuesta de anticuerpos observada en estos pacientes. Es importante destacar que CXCL9 y CXCL10 también se han encontrado en muchas otras enfermedades inflamatorias, y se ha demostrado que su receptor (CXCR3) se expresa en linfocitos B y en linfocitos TCD4+ que desempeñan un papel en la respuesta de anticuerpos dependiente de células T. El objetivo general de este proyecto es analizar el efecto in vitro de las quimioquinas CXCL9 y CXCL10 sobre la respuesta inmune humoral en linfocitos B y T helper provenientes de individuos sanos. Se implementó un sistema de cultivo de tres fases optimizado para la diferenciación de los linfocitos B in vitro que se evaluó en ausencia y presencia de CXCL9 o CXCL10, al igual que la activación in vitro de linfocitos T helper. Los cambios fenotípicos en ambas poblaciones se analizaron mediante citometría de flujo, mientras que producción de anticuerpos IgG totales se evaluó al término de protocolo mediante ELISA. La activación de las células B se confirmó con la regulación positiva de CD86 y CD25, mientras que la diferenciación de las células plasmáticas se confirmó con la presencia de células CD38hiCD27hi y CD138+. La expresión de CXCR3 también se reguló positivamente con el cóctel de activación utilizado en la fase 1 y se mantuvo durante la fase 2 y 3. En cuanto a la expresión de CD86, solo CXCL9 aumentó la expresión de este marcador, mientras que la presencia de CXCL9 y CXCL10 aumentó significativamente el porcentaje de células CD38hiCD27hi, células CD138+ y secreción de IgG. Finalmente, dentro del contexto de la inducción del cambio de clase de la célula B, observamos que CXCL9 también aumentó la expresión de CD40L en las células TCD4+. En resumen, demostramos que CXCL9 y CXCL10 podrían ser claves en la modulación de la respuesta humoral. A futuro, sería interesante determinar qué rutas de señalización utilizan estas quimioquinas para producir dicho efecto.

Current investigations about antibody production during SARS-CoV-2 infection has revealed variations in IgG levels depending on severity. In Chilean patients, high levels of IgG antibodies against SARS-CoV-2 were observed in those who experienced a severe form of the disease, characterized by severe acute respiratory distress syndrome and the presence of lung sequelae following COVID-19 infection. Additionally, cytokines and chemokines have been found to play a significant role in the infection. Specifically, CXCL9 and CXCL10 are elevated in severe patients, a phenomenon known as the "cytokine storm." Preliminary data suggests a positive correlation between circulating levels of CXCL9 and CXCL10 and IgG antibodies against SARS-CoV-2. However, it remains unclear whether these chemokines may contribute to the exacerbation of the antibody response observed in these patients. CXCL9 and CXCL10 have also been detected in various other inflammatory diseases, and their receptor (CXCR3) have been shown to be expressed in B cells and CD4+ T helper cells involved in T cell-dependent antibody responses. The general aim of this project was to analyze the in vitro effect of CXCL9 and CXCL10 chemokines on the humoral immune response in B and T helper lymphocytes from healthy individuals. A three-phase culture system optimized for in vitro B cell differentiation was implemented and evaluated in the absence and presence of CXCL9 or CXCL10. In vitro activation of T helper lymphocytes was also assessed. Phenotypic changes in both cell populations were analyzed using flow cytometry, while the production of total IgG antibodies was assessed at the end of the protocol using ELISA. B cell activation was confirmed by the upregulation of CD86 and CD25, and the differentiation of plasma cells was confirmed by the presence of CD38hiCD27hi, and CD138+ cells. The expression of CXCR3 was also upregulated with the activation cocktail used in phase 1 and remained consistent during phases 2 and 3. Regarding CD86 expression, only CXCL9 increased its expression, whereas the presence of CXCL9 and CXCL10 significantly increased the percentage of CD38hiCD27hi cells, CD138+ cells, and IgG secretion. Finally, in the context of B cell class switch induction, it was observed that CXCL9 also increased CD40L expression in CD4+ T cells. In summary, this study demonstrated that CXCL9 and CXCL10 may play a crucial role in modulating the humoral response. In the future, it would be interesting to determine the signaling pathways through which these chemokines produce this effect.