Superresolución en microscopía por iluminación estructurada

Abstract

El trabajo presentado en esta tesis contempla explicar el desarrollo experimental y de los algoritmos necesarios para implementar un sistema de microscopía por iluminación estructurada. Esta técnica, mediante el efecto Moiré, permite ingresar al sistema optico, información de frecuencias espaciales mas allá de las que el límite de resolución clásico establece. El texto comienza con una descripción del formalismo de sistemas lineales para lograr una descripción matemática de un sistema formador de imágenes. A continuación, y debido a que la información experimental se adquiere mediante un sensor CCD, se presenta el teorema de muestreo bidimensional de Wittaker-Shannon, esto con el fín de asegurar que las imágenes que se capturen, posean toda la información espacial con que salen desde el microscopio. Posteriormente, se presentar a la función de transferencia optica para sistemas que operan con luz incoherente. La extensión de esta función en el espacio de frecuencias, determina la resolución límite del sistema optico. Ya tratados los elementos anteriores, se presenta la teoría que fundamenta el uso del efecto Moiré para la modulación de frecuencias por sobre el límite de resolución del sistema optico. Aquí , se expone la manera de extraer esta información, desde los patrones de Moiré que la muestra y el patrón de luz estructurado forman. Posteriormente, se detallan los distintos aspectos de la implementaci on de un algoritmo para la simulación de microscopía por iluminación estructurada (SIM). Esto es, primero, simular las imágenes que el sistema optico genera de un objeto que se ha iluminado con un patrón periódico de luz. Y segundo, utilizando la teoría de SIM, resolver los sistemas de ecuaciones que permiten extraer la información de altas frecuencias, para posteriormente, reordenar esta información y generar una imagen final con información por sobre el límite de resolución del sistema. Se presentan los diagramas de bloque de la simulación en dos secciones: uno para simular las imágenes formadas por un sistema optico, y otro para aplicar la técnica de SIM. Estos ultimos algoritmos son los que se utilizar an para la verificación experimental de la técnica. A continuación, se muestra el desarrollo experimental de la técnica, con especial enfasis en la puesta a punto del modulador espacial de luz con el que se generan y controlan los patrones de iluminación. Finalmente, se presenta una verificación de la técnica, reconstruyendo imágenes de micro esferas fluorescentes, cuyo diámetro se encuentra bajo el límite de resolución del sistema optico.