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Title: RIV-8 : un nuevo GEF con estructura tipo "armadillo".
Authors: Olate Aravena, Juan, supervisor de grado
Figueroa Yévenes, Maximiliano Francisco
Keywords: RIC-8;Proteínas G.
Issue Date: 2010
Publisher: Universidad de Concepción, Facultad de Ciencias Biológicas, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular.
Abstract: RIC-8 es una proteína altamente conservada (63 Kda) e identificada inicialmente en C. elegans como un factor esencial en la liberación de neurotransmisores y en la división asimétrica. Dos isoformas han sido descritas en mamíferos, RIC-8A y RIC-8B; y cada una posee actividad intercambiadora de nucleótidos (GEF) sobre proteínas G heterotriméricas, pero con diferente especificidad de subunidad G. Para llegar a comprender el mecanismo involucrado en las funciones celulares de RIC-8 es esencial obtener alguna información acerca de su estructura. De este modo, el objetivo de esta tesis es estudiar la relación entre la estructura y la función de RIC-8, usando como modelo de estudio RIC-8 de X. laevis. Un análisis de su estructura primaria no entregan información acerca de la función de xRIC-8, y las proteínas RIC-8 mostraron ser una familia única sin similitud con otras proteínas. Por esta razón, para obtener un modelo 3D de xRIC-8 se usaron diferentes aproximaciones bioinformáticas, incluyendo predicción de plegamientos. El modelo 3D propuesto para xRIC-8 presenta 10 dominios armadillo en tandem, organizados en una estructura super helicoidal de giro a la derecha. Para sustentar experimentalmente el modelo, xRIC-8 fue expresada en E. coli y purificada por cromatografía de afinidad e intercambio iónico, para luego ser analizada mediante dicroismo circular (CD) y estudios de termo estabilidad. Utilizando el modelo propuesto y la información obtenida al comparar las proteínas RIC-8 entre sí, la cual muestra una alta conservación hacia la región carboxilo, se crearon mutantes de deleción que eliminan los 3 últimos dominios armadillos en búsqueda de una pérdida de función GEF. Las mutantes no pudieron ser expresadas en bacterias para estudios in vitro, pero su expresión en cultivos celulares mostraron que todas ellas conservaron su actividad GEF. Estudios de microscopía confocal mostraron que todas las mutantes translocan a la membrana plasmática bajo el estimulo de isoproterenol, y tienen la capacidad de interactuar con Gs. Los resultados de esta tesis han permitido generar el primer modelo 3D para una proteína RIC-8, así como también clasificar a RIC-8 como un nuevo miembro de la familia de proteínas con repeticiones armadillo. Funcionalmente, la región carboxilo terminal, la más conservada entre RIC-8, no mostró albergar la actividad GEF, ni alterar su comportamiento en cultivos de células HEK293T al ser estimuladas con isoproterenol.
Description: Tesis para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas, área Biología Celular y Molecular.
URI: http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/4843
metadata.dc.source.uri: http://ezpbibliotecas.udec.cl/login?url=http://tesisencap.udec.cl/concepcion/sala-chile/figueroa_y_m/index.html
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