Efecto de nicotinamida sobre la diferenciación de células C2C12 a osteoblastos.

Abstract

Los osteoblastos forman parte importante del sistema esquelético, son los encargados de generar la matriz del tejido óseo y provienen de células mesenquimales osteoprogenitoras que responden frente a diversos factores de crecimiento. Uno de los principales factores de crecimiento es la proteína morfogénica del hueso 2 (Bone Morphogenic Protein 2, BMP-2), la cual gatilla la diferenciación de las células progenitoras a osteoblastos. La mutación de un residuo de Arginina por uno de Histidina en la posición 206 (R206H) del receptor tipo I de BMP (ACVR1) genera una activación constitutiva del receptor, lo que desemboca finalmente en la osificación de los tejidos blandos. Esta grave patología llamada Fibrodisplasia Osificante Progresiva se caracteriza por la formación progresiva de hueso en lugares extraesqueléticos. Se han realizado distintos tratamientos para combatir la enfermedad, sin embargo hasta la fecha ninguno ha resultado exitoso. Mediante un tratamiento pionero en nuestro país se ha administrado nicotinamida a pacientes que presentan esta enfermedad. Los resultados indican que se ha logrado atenuar el avance de la osificación muscular. Estudios in vitro han demostrado que nicotinamida inhibe la osteblastogénesis. Sin embargo, existen pocos reportes con respecto al efecto en la expresión de genes que regulan la diferenciación a osteoblastos, así como del mecanismo de acción por el cual nicotinamida disminuye el avance de la diferenciación ósea. Es por ello que surge la interrogante de conocer a través de un estudio transcriptómico, los genes que están siendo afectados en el proceso de inhibición de la diferenciación osteoblástica en células tratadas con nicotinamida. La hipótesis de trabajo es que el tratamiento con nicotinamida inhibe la expresión de los genes involucrados en la vía de señalización por BMP dependiente de Smad. Para poder evaluar esta hipótesis, nos propusimos como objetivo general: “Caracterizar un mecanismo molecular basado en los análisis de abundancia de transcritos por el cual nicotinamida inhibe la diferenciación osteogénica”. Los objetivos específicos de este trabajo son: 1) “Identificar los genes involucrados en la inhibición de la osteoblastogénesis y las vías de señalización alteradas en respuesta al tratamiento con nnicotinamida” y 2) “Cuantificar los niveles de expresión de genes involucrados en la vía de señalización por BMP dependiente de Smad”. Para la realización de este estudio se utilizó como modelo la línea celular C2C12 de origen mesenquimal murino, la que se puede diferenciar a mioblastos o diferenciar a osteoblastos en presencia del factor de crecimiento BMP-2. Por tanto, se constituye como un buen modelo para estudiar el efecto de nicotinamida en el proceso de diferenciación osteoblastogénica. Estas células fueron cultivadas en presencia de nicotinamida y/o BMP-2 a distintos tiempos. Posteriormente se extrajo el ARN para realizar los estudios de expresión tanto por RT-qPCR como por secuenciación masiva y obtener el transcriptoma. Adicionalmente se extrajo proteínas para estudios por inmuno-ensayo por western blot para la determinación de los niveles de Smad1/5/8 fosforilados. Los resultados obtenidos muestran que nicotinamida es capaz de inhibir la diferenciación osteoblástica de manera dosis y tiempo dependiente. Se evidenció que, la expresión génica tanto del receptor ACVR1 como del factor maestro de la regulación osteogénica Runx2 es independiente del tratamiento con nicotinamida, por lo tanto el mecanismo de inhibición de la osteoblastogénesis no es a través de la disminución de la expresión de estos genes. Al evaluar el efecto de nicotinamida sobre la activación de la vía Smad dependiente de BMP se pudo observar que en presencia de nicotinamida disminuyen los niveles de fosforilación del complejo Smad 1/5/8 a partir de las 0,5 hrs post-tratamiento. Esto indica que el mecanismo de inhibición de la osteogénesis es a través de una disminución en la activación de la vía Smad, particularmente en la reducción de la activación del complejo Smad 1/5/8. Del análisis del estudio transcriptómico mediante RNA-Seq, al comparar los distintos grupos en estudio mediante análisis multivariante se pudo determinar que los componentes del grupo tratados con nicotinamida+BMP presentan mayor similitud con el grupo control y con el grupo nicotinamida que con el grupo tratado solo con BMP-2. Adicionalmente, se pudo determinar mediante análisis de ontología génica que BMP-2 induce la activación de procesos osteogénicos, mientras que en presencia de nicotinamida, estos xiii procesos se ven infra representados, produciendo un efecto en las vías de PPARgamma y de NF-kappaB .