Estudio de la Función de Gαi2 sobre la Polaridad Celular y Dinámica de los Microtúbulos Durante la Migración Colectiva en Células de la Cresta Neural Craneal de Xenopus.

Abstract

La dinámica de los microtúbulos es esencial para la mantención de la polaridad celular durante la migración, ya que intervienen en el tráfico y destino de las proteínas requeridas para establecer una correcta polaridad antero-posterior. Sin embargo, cambios en la estabilidad de los microtúbulos podrían contribuir a la pérdida de esta polaridad, a la disrupción del desensamblaje de las adhesiones focales, a un cambio severo en el nivel de polimerización del citoesqueleto de actina, en resumen, afectar la migración celular colectiva. Análisis previos en nuestro laboratorio muestran que la proteína G heterotrimérica, específicamente Gαi2, regula la migración de las células de la Cresta Neural Craneal (CNC), ya que la pérdida de función de Gαi2 se traduce en la inhibición de la migración de estas células y deslocalización de proteínas de polaridad celular como Par3 y ζPKC, resultados que se apoyan con estudios de otros investigadores en células del sistema inmune, donde también la ausencia de Gαi2 inhibe la migración de los linfocitos T y macrófagos hacia los sitios de inflamación. Adicionalmente, también se ha reportado en C. elegans que Gαi controla la polaridad celular durante la división asimétrica, a través de la regulación de las fuerzas de los microtúbulos para orientar correctamente el huso mitótico. Por lo tanto, con el fin de indagar en el mecanismo funcional de la subunidad Gαi2 durante la migración celular, y con ello su posible contribución a regular los microtúbulos y la polaridad celular, en esta tesis se investigó el papel de la subunidad Gαi2 de la proteína G heterotrimérica en la CNC, una población embrionaria que migra extensivamente y colectivamente a lo largo del embrión con el fin de formar otros tejidos. Nuestros resultados muestran que Gαi2 se localiza en toda la célula, pero en la corteza celular se localiza cercana a la red de microtúbulos, posiblemente controlando la dinámica de éstos. La disminución de la expresión de Gαi2 a través de un morfolino específico, redujo fuertemente la despolimerización de los microtúbulos aumentando su estabilidad, afectando la polimerización del citoesqueleto de actina a través del aumento del tamaño de las protrusiones y el área de las adhesiones focales en el tiempo. También observamos un aumento en la actividad de Rac1 en el borde libre y en el contacto célula-célula, cambiando la localización de RhoA hacia el borde director, lo que en conclusión afecta la migración de la CNC. Este efecto pudo ser rescatado con bajas concentraciones de nocodazol como droga despolimerizante de los microtúbulos, y sólo parcialmente por inhibición de Rac1. Además, encontramos que Gαi2 interacciona con EB1, EB3, tubulina, α5-integrina y ζPKC, como se muestra por co-immunoprecipitación, lo que apoya el papel crítico de Gαi2 en la dinámica de los microtúbulos, el desensamblaje de las adhesiones focales y la polaridad celular. Por lo tanto, nuestros resultados nos permiten proponer a Gαi2 como un regulador maestro de la polaridad, morfología y dinámica de la adhesión célula-matriz, a través del control de la dinámica de los microtúbulos, y con ello, de la conversación cruzada entre los citoesqueletos de actina y tubulina, permitiendo de esta forma la correcta migración colectiva de las células de la CNC.

The microtubule dynamics is essential for the maintenance of cell polarity during migration. They are involved in the trafficking and destination of the required proteins to establish a correct antero-posterior polarity. Neverthless, changes in the stability of microtubules could contribute to the loss of this polarity, the disruption of the focal adhesion disassembly, severe changes in actin polymerization level, in summary to affect collective cell migration. Previous analyzes in our laboratory have shown that the heterotrimeric G protein, specifically Gαi2, regulates the Cranial Neural Crest (CNC) cells migration. The loss of function of Gαi2 inhibits the migration of these cells and promote the misslocalization of polarity proteins such as Par3 and ζPKC, results supported by other studies in immune system where the loss of function of Gαi2 also inhibits the migration of macrophages and T lymphocytes towards the inflammation sites. Addicionally, studies in C. elegans have described that Gαi2 control de microtubules pulling forces to orientate the spindle correctly during asymmetric cell division. Therefore, in order to investigate the functional mechanism of the Gαi2 subunit during cell migration, and its possible contribution to regulating microtubules dynamics and cell polarity, in this thesis we investigated the role of the Gαi2 subunit of the heterotrimeric G protein in the CNC cells, an embryonic population that extensively and collectively migrates throughout the embryo, in order to generate other tissues. Our results have shown that Gαi2 is localized throughout the cell, but in the cell cortex it is localized close to the microtubules network, possibly controlling microtubules dynamics. The Gαi2 expression was reduced through a specific morpholino, that strongly reduced the depolymerization of the microtubules, increasing their stability, affecting the actin polymerization increasing the protrusions size and the focal adhesions area. Also, Gαi2 loss of function resulted in an increase of the Rac1 activity in the free edge and in the cell-cell contact, a changing in the location of RhoA towards the leading edge, which in conclusion affect CNC migration. These effects were restored by low concentrations of nocodazole treatment, as microtubule depolymerizing drug, but partially rescued by Rac1 inhibition. In addition, we found that Gαi2 interacts with EB1, EB3, tubulin, α5-integrin and ζPKC, as shown by co-immunoprecipitation, supporting a critical role for Gαi2 in microtubule dynamics, focal adhesions disassembly and cell polarity. Therefore, our results together, allow us to propose to Gαi2 as a master regulator of, cell polarity, morphology and cell-matrix adhesion dynamics, through the control of microtubule dynamics, contributing to the crosstalk between both cytoskeletons (actin and tubulin), thus allowing the correct collective migration of CNC cells.