Caracterización química localizada de pulpas lignocelulósicas mediante técnicas microscópicas y análisis multivariado aplicado a imágenes

Abstract

El rendimiento en el proceso de obtención de etanol mediante sacarificación y fermentación de material lignocelulósico, depende en gran medida de la interacción de las enzimas con la fibra de celulosa, donde la presencia de lignina y hemicelulosas suponen una barrera para la accesibilidad enzimática, fenómeno conocido como recalcitrancia. La mayoría de los métodos analíticos existentes estudian la composición química de la madera a través de técnicas destructivas. Para estudiar más de cerca el fenómeno de la recalcitrancia es necesario desarrollar una estrategia que permita el análisis cualitativo y cuantitativo en la superficie misma de la fibra lignocelulósica. La visualización de la distribución espacial de los principales componentes químicos presentes en la fibra es posible mediante obtención de imágenes espectrales a través de micro-espectroscopía FT-IR, donde se obtiene un espectro infrarrojo desde cada píxel de la imagen microscópica. Debido a la gran cantidad de datos obtenidos desde una imagen espectral, es útil la utilización de diferentes técnicas de análisis multivariado, a fin extraer matemáticamente la información relevante que permita la separación e identificación de los diferentes componentes de la matriz. En este trabajo se analizaron por FT-IR de imágenes fibras pre-tratadas de material lignocelulósico. Las imágenes espectrales obtenidas fueron sometidas a análisis de componentes principales (PCA), resolución multivariada de curvas con mínimos cuadrados alternantes (MCR-ALS) y regresión por mínimos cuadrados parciales (PLS). La reconstrucción quimiométrica de las imágenes espectrales obtenidas permitió identificar in situ los diferentes compuestos químicos presentes en la fibra, así como describir su distribución. Además, se desarrollaron diferentes estrategias para análisis cuantitativo en imágenes espectrales, permitiendo cuantificar glucanos, lignina y hemicelulosa directamente desde la superficie de la fibra. Se aplicaron otras técnicas microscópicas, como microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía laser confocal (CLSM) como métodos complementarios para el estudio de la ultraestructura de la fibra lignocelulósica. CLSM permitió la obtención de imágenes espectrales usando el espectro de emisión de compuestos auto-fluorescentes presentes en la madera. Mediante esta técnica fue posible identificar lignina y celulosa en la pared celular de fibras pre-tratadas y describir los patrones de distribución sin necesidad de métodos de marcaje molecular. Con las estrategias analíticas desarrolladas se observó que diferentes pre-tratamientos producen diferentes patrones de relocalización de lignina y que no es necesariamente el contenido total de lignina lo que afecta la accesibilidad enzimática, sino que la distribución en que ésta se encuentra en la pared celular. La plataforma analítica desarrollada permite el estudio químico micro-localizado, selectivo y no destructivo para matrices reales complejas y de estructura irregular, lo que proporcionaría una herramienta avanzada para el estudio del fenómeno de recalcitrancia. Este tipo de análisis tendría una aplicación transversal en el estudio de ambientes químicos en matrices microscópicas, por lo que su proyección en otras áreas del conocimiento constituye otra ventaja relativa a su desarrollo.