Reprogramación de células somáticas de güiña (Leopardus guigna) mediante transferencia nuclear heteroespecífica utilizando ovocitos maduros de gata doméstica (Felis silvestris catus).

Abstract

Actualmente existe un aumento en los trabajos de investigación relacionados al desarrollo de técnicas de reproducción asistida en el gato doméstico con el propósito de implementar estas técnicas en especies de felinos amenazados. La güiña (Leopardus guigna) es una especie endémica de Chile, clasificada como vulnerable según la lista roja de la IUCN (International Union for Conservation of Nature). Debido a esto, la transferencia nuclear somática heteroespecífica (TNSh) podría ser una potencial herramienta para generar embriones de güiña utilizando ovocitos enucleados de gata doméstica y de esta manera a ayudar a su conservación. Sin embargo, los embriones generados por TNSh presentan un bajo potencial de desarrollo principalmente debido a una ineficiente reprogramación nuclear. Por lo cual la hipótesis de esta tesis fue “la transferencia de células somáticas de guiña a ovocitos de gata doméstica genera embriones clonados con similar morfología y expresión génica a los embriones clonados utilizando células de gato doméstico”. De acuerdo a los resultados obtenidos, se demostró que el tratamiento con 200 UI de eCG mejoró la calidad morfológica y el patrón de expresión génica de los complejos cúmulo-ovocito (CCOs) colectados. Por lo cual este protocolo fue seleccionado para la posterior generación de embriones. En cuanto a la sincronización del ciclo celular, se demostró que tanto los fibroblastos de gato doméstico como de güiña pueden sincronizarse en la fase G0/G1 por medio de los métodos de privación de suero e inhibición por contacto. Sin embargo, en el caso de los fibroblastos de güiña la exposición a estos tratamientos por más de tres días genera un efecto negativo sobre la viabilidad celular. Por lo cual, se eligió la privación de suero por no más de tres días para la sincronización celular. Adicionalmente, fue posible demostrar que los embriones de gato doméstico generados por FIV utilizando el tratamiento con eCG son capaces de desarrollarse tanto in vitro como in vivo, con la generación de crías vivas. Además, se demostró que la remoción de la zona pelúcida no afecta el potencial de desarrollo in vitro de los embriones de gato. Finalmente, se demostró que en los embriones de gato doméstico generados por TNS la agregación embrionaria mejora el potencial de desarrollo in vitro aumentando la tasa de blastocistos. En el caso de los embriones de güiña generados por TNSh, solo los xix embriones cultivados en agregado lograron alcanzar el estadio de blastocisto en un bajo porcentaje. Al realizar el análisis de expresión génica, se observó que los blastocistos clonados de gato doméstico presentaban una menor expresión de OCT4 en comparación a los blastocistos generados por FIV. Por otro lado, solo uno de los embriones de güiña generados expresó OCT4, sin expresar ninguno de los otros genes de pluripotencia y diferenciación evaluados. De acuerdo a los resultados obtenidos se puede concluir que el ovocito de gata doméstica es capaz de reprogramar las células somáticas de güiña a través de la TNSh. Sin embargo, la mayoría de los embriones clonados de güiña quedan detenidos en el estadio de mórula y solo un bajo porcentaje de estos logran alcanzar el estadio de blastocisto al ser cultivados en agregado. Lo cual se podría deber a una ineficiente reprogramación nuclear