Ambiente genético del gen bla CTX-M2 en cepas de klebsiella pneumoniae subsp. pneumonieae aisladas en hospitales chilenos.

Abstract

Las enzimas del grupo CTX-M forman una familia de - β de espectro extendido (BLEE) de rápido crecimiento, distribuidas en diversas áreas geográficas y en un amplio rango de bacterias clínicas, en particular, miembros de la familia Enterobacteriaceae como Klebsiella pneumoniae. Estas enzimas hidrolizan preferentemente cefotaxima, y su prevalencia en Chile es de 40,2%, en cepas de K pneumoniae subsp pneumoniae productoras de BLEE. Según lo indicado por diversos estudios, en la movilización de genes blaCTX-M estarían involucrados elementos genéticos, como por ejemplo la secuencia ISCR1 e integrones de clase 1. Estos últimos elementos han sido los más estudiados y caracterizados, principalmente por su alta diseminación y, además, porque han sido encontrados en cepas aisladas en hospitales. La organización general de los integrones clase 1 consiste de un extremo 5’ conservado (5’CS), donde se encuentra el gen intI1, el que codifica para una proteína denominada integrasa y que corresponde a una recombinasa sitio específica. Además, posee un extremo 3’ conservado (3’CS) con los genes qacEΔ1, sul1 y orf5 que codifican resistencia a compuestos de amonio cuaternario, bromuro de etidio, sulfonamidas y a una proteína de función desconocida, respectivamente. Entre los extremos 5’CS y 3’CS se encuentra una zona variable con presencia o ausencia de cassettes genéticos de resistencia. Recientemente se informó la presencia de integrones clase 1 complejos(ejemplos, In35 e InS21, descritos en Argentina), los cuales presentan una duplicación parcial o completa del extremo 3’CS. En este caso los cassettes genéticos se ubican entre el 5’-CS y la primera copia del 3’CS, tal como en un integrón clase 1 tradicional. Entre el segundo 3’CS se halla una región conservada de 2.100 pb, que incluye la secuencia ISCR1 y una segunda región variable adyacente, donde se han encontrado insertos genes blaCTX-M. La secuencia ISCR1 contiene un únic marco de lectura, orf513, que codifica para una recombinasa putativa.vi Hasta el momento no existen publicaciones en Chile que asocien la presencia del gen blaCTX-M-2 a este tipo de estructuras genéticas, por lo cual, el Objetivo General de esta Tesis fue caracterizar el ambiente genético del gen blaCTX-M-2 presente en cepas de K. pneumoniae subsp. pneumoniae aisladas en hospitales chilenos. En este estudio se incluyeron 6 cepas de K. pneumoniae subsp. pneumoniae (K143, K283, K288, K291, K292, y K296) multirresistentes productoras de la BLEE CTX-M2, y también la cepa transconjugante K283tr. Se caracterizó, mediante PCR, la zona variable del integrón clase 1 presente en estas cepas, como también la duplicación del extremo 3’ CS del integrón clase 1 complejo, utilizando combinaciones de partidores específicos descritos en la literatura internacional, y se comparó los resultados con los obtenidos en la cepa control UC244 (In35+). De acuerdo a los resultados de los experimentos anteriores, y de un estudio de clonalidad de las cepas, se secuenció losproductos de amplificación del ambiente genético del gen blaCTX-M2 de la cepa K283. Para el ensamblaje y análisis comparativo de las secuencias nucleotídicas se utilizaron diversos programas computacionales.Los resultados revelaron que, en todas las cepas estudiadas, incluyendo la cepa K283tr , el gen blaCTX-M2 se encuentra inserto en un integrón clase 1 complejo, asociado a la presencia de la secuencia ISCR1. La arquitectura de este integrón es similar a los integrones clase 1 complejos detectados en Argentina y Uruguay. Se determinó que la zona variable del integrón clase 1 contiene el siguiente ordenamiento de cassettes genéticos: aac(6’)-Ib, blaOXA2 y orfD.Corriente abajo del primer extremo 3’CS, se encontró una zona de 2.985 pb que posee un 95% de identidad con los primeros integrones clase 1 complejos descritos, In6 e In7, e incluye la secuencia ISCR1. Al hacer el alineamiento múltiple de la secuencia codificante de orf513, se determinó que comparte 100% de identidad con aquella descritas para los integrones In35 e InK13, descritos en Argentina y Uruguay, respectivamente. Corriente abajo de esta secuencia, se vii encontró ubicado el gen blaCTX-M2, que comparte un 98% de identidad con blaKLUA-1 de Kluyvera ascorbata. La secuencia corriente abajo del gen blaCTX-M2 se puede dividir en dos partes: una región homóloga a blakluA-1, la secuencia ORF3 (88% homóloga con la de K. ascorbata) y el gen posee un qacEΔ1, el cual es el primer componente de la duplicación del extremo 3’ del integrón clase 1 complejo.Se concluye que el gen blaCTX-M2 presente en cepas hospitalarias de K. pneumoniae subsp. pneumoniae se encuentra en un integrón clase 1 complejo, denominado InK283, adyacente a la secuencia ISCR1, y de igual arquitectura que aquellos integrones descritos en Argentina y Uruguay. Este integrón clase 1 complejo se encuentra ubicado en un plásmido conjugativo, que podría estar movilizándose entre las cepas chilenas