Resumen:
La industria de la salmonicultura en Chile ha utilizado en forma intensiva
antibacterianos, entre los que se encuentra trimetoprim y sulfisoxazol, durante el
proceso de cultivo. Existe evidencia que estos agentes antimicrobianos se acumulan en
estos ambientes durante los tratamientos, llegando a cambiar la composición bacteriana
autóctona y, por lo tanto, es esperable la selección de bacterias resistentes a estos
antibacterianos. Estos microorganismos serán portadores de diferentes determinantes
genéticos de resistencia, y que debido a su posible codificación extracromosomal,
pueden ser diseminados a otras bacterias susceptibles en diversos ambientes.
En consecuencia, esta práctica estaría creando reservorios ambientales de genes de
resistencia a antibióticos transferible en los sistemas de cultivo en Chile, con
importantes efectos ambientales y riesgos potenciales para la salud humana y animal.
Esto hace necesario evaluar el rol de estos sistemas como reservorios y medio de
diseminación de genes de resistencia a antimicrobianos.
Debido a lo anterior, el objetivo de esta investigación fue determinar la participación
de los genes sul y dfr, en la resistencia a sulfonamidas y trimetoprim, en cepas de
bacilos Gram negativos aislados desde pisciculturas y centros de cultivo de salmones y
su relación con integrones.
En este estudio se incluyeron 99 cepas bacterianas resistentes a sulfonamidas y/o
trimetoprim obtenidas de muestras de agua superficial, sedimento, contenido intestinal,
mucus de salmones en cultivo y alimento extruido. De las 99 cepas, 22 provenían en
pisciculturas (P) y 77 de centros de cultivos (CC) de la VIII Región y X Región de Chile.
Se determinó el nivel de resistencia a sulfisoxazol y trimetoprim y se investigó la
presencia y variedad de genes sul y dfr. También se pesquisaron integrones de la clase
1, 2, y los cassettes genéticos de resistencia asociados a estas estructuras genéticas
para relacionar su presencia con la resistencia a sulfonamidas y trimetoprim en las
cepas seleccionadas.
Los resultados indicaron que las cepas estudiadas presentaban elevados niveles de
resistencia a ambos antibacterianos en estudio; para trimetoprim los valores de CMI
fluctuaron entre 4 y > 2.048 μg/mL, siendo la CMI50 2.048 μg/mL y la CMI90 > 2.048 μg/mL. La CMI de sulfisoxazol varió entre <8 y >4.096 μg/mL, con una CMI50 de 2.048
μg/mL y CMI90 >4.096 μg/mL.
Al analizar los mecanismos de resistencia, se encontró una mayor presencia de
genes dfr y sul en cepas inhibidas con elevadas concentraciones de los antibióticos en
estudio. Sólo se detectaron los genes dfrA1, dfrA12 y dfrA14, distribuidos en un total de
12 de las 99 cepas, siendo el gen dfrA12 el más frecuente (8/12 cepas). La distribución
de los genes dfr fue similar en cepas provenientes de pisciculturas (13,6%) y de centros
de cultivo (11,7%). Con respecto a genes sul, el gen suI1 se encontró en 25 de las 99
cepas ensayadas (8/22 (36,4%) de pisciculturas (P) y 17/77 (22,1%) de centros de
cultivo (CC)), sul2 en 4 cepas (una cepa de P y 3 cepas de CC) y los genes sul1 y sul2,
simultáneamente, en 3 cepas, una de ella aislada en P y 2 en CC. No se encontró el
gen suI3.
Por otra parte, se detectó 21 cepas con integrones clase 1, y una cepa con integrón
clase 1 y 2, simultáneamente. Esta estructura genética se presentó tanto en cepas
aisladas en pisciculturas (6/22; 27,3%) como en centros de cultivo (19/77; 20,8%). De
las cepas con integrón clase 1, en 4 de ellas no se logró amplificar de extremo 3’CS y
17 presentaron el extremo 3’CS con el gen sul1 adyacente al gen qacΔE, de las cuales
4 portaban un gen qacΔE alterado. Al igual que los genes dfr y sul, se observó que los
integrones clase 1 y 2 se concentraban en cepas con elevado nivel de resistencia a
trimetoprim y sulfisoxazol.
En integrones clase 1 se reveló 7 zonas variables distintas, conteniendo 1 a 3
cassettes genéticos. Las zonas variables con un sólo cassette contenían los genes
aadA1 (5 cepas), aadA2 (1 cepa) y aadA9 (1 cepa). En cepas con 2 cassettes insertos
en su zona variable, éstos correspondieron a los genes blaOXA-101 - aac(6’)-Ib (1 cepa) y
aadA2-cmLA (4 cepas). Por último, 3 cepas presentaron una zona variable compuesta
de 3 cassettes, 2 cepas con los cassettes dfrA12-orf-aadA2 y 1 cepa con los cassettes
dfrA12-orf-aadA2a. La zona variable del integrón clase 2 contenía los genes dfrA1, sat y
aadA1, ubicados correlativamente.
Para los genes dfr se apreciaron dos situaciones: mayor presencia de genes dfr en
cepas con integrones, pero no asociados a estas estructuras, y presencia de más de un
gen dfr por cepa (asociado y no asociado a integrón). En el caso de los genes sul, éstos xii
se encontraron, principalmente, asociados a integrones clase 1, con el gen sul1 como
parte estructural de esta clase de integrón, y el gen sul 2 no vinculado a integrones
como cassette, sino más bien a otras estructuras. Al igual que los genes dfr, los genes
sul se presentaron simultáneamente en algunas cepas.
En resumen, esta investigación pone de manifiesto la presencia de genes dfr y sul en
cepas resistentes a trimetoprim y/o sulfisoxazol, vinculados a los mayores niveles de
resistencia, aunque claramente no como único mecanismo de resistencia. Además,
evidencia la presencia más frecuente de integrones en estas mismas cepas; sin
embargo la relación de genes dfr como cassette genético en estas estructuras fue baja,
en comparación con otros cassettes genéticos, como aadA y cmLA. La relación de
genes sul con integrones clase 1 fue la esperada, con sul1 asociado al extremo 3’CS,
en la mayoría de los casos, y sul2 no asociado a integrones, sino a un contexto
genético diferente.
Es importante destacar la presencia de cepas con más de un gen dfr y sul, lo que
estaría indicando la tendencia a la conservación estos genes, ya sea por otorgar un
bajo costo de fitness y/o por coselección de resistencia, al estar involucrados con otros
genes de resistencia a antibióticos. Esto es de gran trascendencia debido a que la
interrupción del uso de trimetoprim y sulfonamidas en el cultivo de salmón no implica,
necesariamente, la pérdida de los genes de resistencia a estos compuestos, los que,
además, pueden estar seleccionando estructuras genéticas que porten genes de
resistencia a antibióticos de uso habitual en salmonicultura.
Estudios como el realizado permiten ampliar el conocimiento y comprensión de la
resistencia a antimicrobianos y los mecanismos que utilizan las bacterias para
adaptarse y sobrevivir en medios hostiles generados por la presión selectiva ejercida por los agentes antibacterianos.