Desarrollo de una plataforma científica tecnológica para estudiar el proceso de clarificación de vinos orientada a disminuir la prevalencia de agentes clarificantes con potencial alergénico.

Abstract

La caseína y la ovoalbúmina son usadas habitualmente como agentes clarificantes durante el proceso de elaboración del vino, con el objetivo de promover interacciones con compuestos no deseados como algunos polifenoles y taninos. Este tipo de proteínas pueden desencadenar reacciones alérgicas en individuos susceptibles, por tanto su presencia en vinos puede ser un riesgo para la salud humana, especialmente cuando su presencia no está reportada o indicada en la etiqueta. Es por esto que la Unión Europea estableció a través de su Directiva 2003/89/EC, actualizada en el año 2012 Directiva 2012/579/EC que las concentraciones mayores a 0.25 mg L-1 deben ser declaradas en la etiqueta. De ahí la necesidad de contar con técnicas con un alto poder de resolución que proporcionen la información necesaria para el análisis de estas proteínas en vino. En la presente tesis doctoral se demuestra el enorme poder que tiene la cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masa para la identificación y cuantificación de péptidos de caseína y ovoalbúmina en vinos. La extracción de las proteínas desde la matriz vino se realizó combinando el uso de membranas de ultracentrifugación y precipitación con solventes orgánicos. En particular el análisis se desarrolló a partir de la estrategia de trabajo bottom-up. El paso limitante de esta metodología son los largos tiempos de digestión enzimática que se requieren (12-24 horas). Debido a que varios factores (tiempo, temperatura, relación concentración enzima:proteína, etc) pueden afectar el rendimiento de la digestión tríptica la estrategia más eficiente es aplicar herramientas qumiométricas para su optimización. Se empleó un Diseño Central Compuesto para optimizar la digestión con tripsina aplicando una temperatura de 37oC y energías del infrarrojo, microondas y ultrasonido. Cada método fue evaluado a partir de SDS-PAGE y del % de sequence coverage (SQ) arrojado por la base de datos Mascot. En todos los casos fue posible disminuir los tiempos de digestión y aumentar su rendimiento. Para la determinación de los péptidos resultantes fue desarrollado, implementado y validado un método UHPLC-DAD-ESI-MS/MS el cual en conjunto con la comparación de los resultados teóricos arrojados por las bases de datos Swiss-Prot y Mascot permitió la identificación y cuantificación de un péptido marcador para la -caseína, -caseína y la ovoalbúmina en 60 muestras comerciales de vinos chilenos, empleando como estándar interno un péptido marcado isotópicamente. De las muestras analizadas 17 presentaron concentraciones de estas proteínas en un valor cercano o superior a lo regulado por la OIV, por consiguiente se hace necesario establecer normativas que normalicen su uso en Chile. Con la finalidad de lograr una mayor identificación de péptidos marcadores de caseína y ovoalbúmina en los vinos se desarrolló un método UHPLC-ESI-Q/TOF, identificándose y cuantificándose 5 péptidos para -caseína, 4 para -caseína, uno para -caseína y 3 para ovoalbúmina. Esto evidencia las ventajas de emplear analizadores de masa híbridos de alta resolución en los análisis proteómicos. La separación e identificación de los péptidos marcadores en vinos se realizó también mediante HPTLC-ESI-MS. El uso de esta herramienta analítica, permitió detectar de manera rápida dos bandas características de la -caseína y ovoalbúmina. Explorando alternativas para reducir o evitar el uso de estos clarificantes se realizó un estudio químico-analítico utilizando bentonita, tierras de diatomea, caseína y ovoalbúmina.Se evaluó su influencia sobre el color, turbidez, antocianinas y polifenoles del vino. En aras de no añadir al vino agentes exógenos se evaluó también la capacidad de eliminar caseína y ovoalbúmina por una membrana de ultracentrifugación con flujo cruzado y tamaño de poro de 10kDa. En vinos tratados con estas proteínas no se encontraron péptidos característicos luego de ser sometidos al proceso de filtración.