Remodelación estructural y funcional en la respuesta transcriptómica de salmón del Atlántico frente a patógenos que afectan a la salmonicultura.

Abstract

La salmonicultura, como una de las actividades económicas más importante en Chile, se enfrenta a desafíos constantes enfrenta desafíos como las enfermedades infecciosas y el impacto ambiental generado por los tratamientos. Dentro de las principales enfermedades que afectan el cultivo del salmón del Atlántico se encuentran la caligidosis y la septicemia rickettsial salmonídea (SRS). El uso de vacunas como estrategia de inmuno-estimulación activa en el salmón del Atlántico, es una solución prometedora para prevenir enfermedades y reducir la contaminación. Comprender cómo el salmón del Atlántico responde a nivel molecular a estos estímulos o a la presencia de patógenos, es crucial para desarrollar estrategias de manejo y control eficaces. En este sentido, la tecnología de secuenciación del transcriptoma de RNA (RNA-seq) ha contribuido en gran medida a comprender los cambios moleculares y funcionales que ocurren en un organismo en presencia de una estimulación, los cuales conllevan a una remodelación estructural y funcional de su respuesta transcriptómica como mecanismo de defensa. En este contexto, la presente tesis doctoral tiene como objetivo evaluar los mecanismos de remodelación transcriptómica, estructural y funcional de la respuesta del salmón del Atlántico frente a diferentes estímulos inmunológicos, ya sean infecciones patógenas o procesos de vacunación. Para ello, se utilizaron diferentes modelos de estudio in vitro e in vivo, para evaluar los diferentes mecanismos potenciales de remodelación de la respuesta inmune de salmón del Atlántico frente a diferentes estímulos inmunomoduladores. Como primera etapa, se comparó la respuesta transcriptómica de la línea celular SHK-1 estimulada con la proteína recombinante Cr-catepsina de Caligus rogercresseyi y el riñón anterior de salmones del Atlántico inyectados con la misma proteína. Los resultados de este estudio evidenciaron una diferenciación entre los perfiles transcriptómicos de ambos modelos de estudio, sin embargó un 24,15% de la respuesta transcriptómica fue compartida, la cual estuvo asociada fundamentalmente a la estimulación con el antígeno. Tanto en las células SHK-1 como en el riñón anterior se identificaron vías enriquecidas relacionadas con el sistema inmune y la transducción de señales en ambos tejidos, destacando la vía de señalización de las MAP quinasas, señalización de receptores tipo Toll, melanogenesis, entre otras. Además, un análisis de expresión de lncRNAs reveló un patrón de transcripción específico para cada modelo, donde los principales lncRNA compartidos se encontraron altamente correlacionados con varios transcritos involucrados en la respuesta inmune, la homeostasis del hierro, la respuesta inflamatoria y la apoptosis, evidenciando una posible remodelación funcional a través de los lncRNA ocasionada por la estimulación la proteína recombinante Cr-catepsina. A su vez, este estudio permitió demostrar que es posible utilizar las líneas celulares para la detección inicial de antígenos para desarrollar vacunas contra el piojo de mar, reduciendo el consumo de tiempo asociado con la selección del antígeno. Como segunda etapa del estudio se exploró la remodelación transcriptómica, basada en el splicing alternativo (AS), de estos dos modelos de estudio frente a una infección con Psicirickettsia salmonis. Para ello, se infectaron las células SHK-1 con la bacteria y se tomaron muestras a los 0, 7- y 14-días después de la infección (dpi) para la secuenciación del transcriptoma. Por otro lado, se utilizaron conjuntos de datos de RNA-Seq de riñones anterior de salmón del Atlántico infectados con la misma cepa de P. salmonis. Para ambos modelos de estudio, el mayor número de eventos de splicing alternativo diferencial (DAS) se observó a los 7 dpi. En células SHK-1 infectadas con P. salmonis se observó una alta presencia de genes DAS relacionados con el metabolismo de nucleótidos, evidenciando la competencia de la bacteria por estos micronutrientes. Por lo cual las células aumentarían su capacidad de producción para suplir el déficit de nucleótidos, donde los procesos de AS jugarían un papel fundamental. Por el contrario, el riñón anterior de salmón exhibió muchos términos GO asociados con la respuesta inmune, indicando la importancia funcional del AS en la remodelación funcional de procesos complejos contra la infección bacteriana. Como tercera etapa de este estudio, se evaluó la respuesta transcriptómica en las células sanguíneas del salmón del Atlántico frente a una vacunación y exposición a dos patógenos marinos, C. rogercresseyi y P. salmonis. Para ello se diseñaron cuatro grupos experimentales que incluyeron la vacunación con la quimera recombinante IpathÒ y dos vacunas comerciales contra P. salmonis: BlueGuard + Livac, BlueGuard + Livac + IpathÒ, IpathÒ y Control (PBS adyuvado). Cada grupo fue expuesto a una infestación con C. rogercresseyi y pasados 25 dpi se infectaron con P. salmonis. Las células sanguíneas de los peces de cada grupo experimental fueron extraídas a los 12 dpi y fueron utilizadas para la secuenciación del transcriptoma. En este trabajo, los patrones globales transcriptómicos de las células sanguíneas de salmón del Atlántico de los cuatro grupos experimentales mostraron niveles de expresión diferenciales. El grupo experimental vacunado con IpathÒ mostró una mayor respuesta transcriptómica en comparación con las vacunas comerciales empleadas. Notoriamente, las anotaciones de los genes diferencialmente expresados (DEGs) compartidos por los tres grupos experimentales mostraron un enriquecimiento de genes relacionados con homeostasis y metabolismo del hierro. Adicionalmente, se analizó el comportamiento de distintas rutas de señalización y su posible remodelación transcriptómica en cada grupo experimental, siendo el grupo vacunado con IpathÒ el más representado en todas las rutas, en términos de DEGs. La vía de señalización de HIF-1 y ferroptosis fueron activadas significativamente, lo cual podría predecir que la vacunación con IpathÒ podría estar regulando una hipoxia por déficit de hierro, o la muerte celular por ferroptosis, que podrían ocurrir en el salmón del Atlántico durante la exposición a C. rogercresseyi y P. salmonis. El presente estudio reveló la remodelación transcriptómica como respuesta a diferentes inmuno-estimulaciones, permitiendo profundizar en los mecanismos moleculares implicados en la respuesta inmune del salmón del Atlántico. Este enfoque permitió explorar en detalle los cambios en la expresión génica y el splicing alternativo que ocurren en diferentes tejidos, proporcionando información valiosa sobre la respuesta inmune adaptativa y la plasticidad del sistema inmunológico del salmón del Atlántico. Además, resalta la importancia de integrar diferentes modelos de estudio para obtener una visión integral de la respuesta inmune en diferentes niveles y contextos. Este trabajo proporciona información valiosa para contribuir al desarrollo de estrategias de manejo de enfermedades en la salmonicultura, incluyendo la identificación de marcadores moleculares de respuesta inmune, la selección de cepas resistentes y el diseño de vacunas más efectivas.

Salmon farming, as one of the most important economic activities in Chile, faces constant challenges such as infectious diseases and the environmental impact generated by treatments. Among the main diseases affecting Atlantic salmon farming are caligidosis and rickettsial salmonid septicemia. The use of vaccines as an active immunostimulation strategy in Atlantic salmon is a promising solution to prevent diseases and reduce pollution. Understanding how Atlantic salmon responds at the molecular level to these stimuli or the presence of pathogens is crucial for developing effective management and control strategies. In this regard, RNA transcriptome sequencing technology (RNA-seq) has greatly contributed to understanding the molecular and functional changes that occur in an organism in the presence of stimulation, leading to a structural and functional remodeling of its transcriptomic response as a defense mechanism. In this context, this doctoral thesis aims to evaluate the transcriptomic, structural, and functional remodeling mechanisms of the response of Atlantic salmon to different immunological stimuli, whether pathogenic infections or vaccination processes. For this, in vitro and in vivo study models were used to evaluate the different potential mechanisms of remodeling the immune response of Atlantic salmon against different immunomodulatory stimuli. As a first stage, the transcriptomic response of the SHK-1 cell line stimulated with the recombinant protein Cr-cathepsin from Caligus rogercresseyi and the Atlantic salmon head kidney injected with the same protein were compared. The results of this study showed a differential transcriptomic profile of both study models, however, 24.15% of the transcriptomic response was shared, which was mainly associated with antigen stimulation. Enriched pathways related to the immune system and signal transduction were identified in both tissues, highlighting the MAPK signaling pathway, Toll-like receptor signaling, and melanogenesis, among others. In addition, expression analysis of lncRNAs revealed a specific transcription pattern for each model, where the main shared lncRNAs were found to be highly correlated with various transcripts involved in the immune response, iron homeostasis, the inflammatory response, and apoptosis, evidencing a possible functional remodeling through lncRNA caused by stimulation of the recombinant protein Cr-cathepsin. In turn, this study demonstrates that it is possible to use cell lines for the initial detection of antigens to develop vaccines against sea lice, reducing the time consumption associated with antigen selection. As a second stage of the study, the transcriptomic remodeling, based on alternative splicing (AS), of these two study models against infection with Psicirickettsia salmonis was explored. For this, SHK-1 cells were infected with the bacterium, and samples were taken at 0, 7 and 14 days after infection (dpi) for transcriptome sequencing. On the other hand, RNA-Seq data sets from Atlantic salmon head kidney infected with the same P. salmonis strain was used. For both study models, the highest number of differential alternative splicing (DAS) events was observed at 7 dpi. In SHK 1 cells infected with P. salmonis, a high presence of DAS genes related to nucleotide metabolism was observed, evidencing the competition of the bacteria for these micronutrients. Therefore, the cells would increase their production capacity to supply the nucleotide deficit, where AS processes would play a fundamental role. In contrast, the salmon head kidney exhibited many GO terms associated with the immune response, indicating the functional importance of AS in the functional remodeling of complex processes against bacterial infection. As a third stage of this study, the transcriptomic response in Atlantic salmon blood cells to vaccination and exposure to C. rogercresseyi and P. salmonis was evaluated. Four experimental groups were designed that included vaccination with the recombinant IpathÒ chimera and two commercial vaccines against P. salmonis: BlueGuard + Livac, BlueGuard + Livac + IpathÒ, IpathÒ and Control (adjuvanted PBS). Each group was infested with C. rogercresseyi, and after 25 dpi was infected with P. salmonis. Fish blood cells from each group were extracted at 12 dpi and used for transcriptome sequencing. In this work, the global transcriptomic patterns of Atlantic salmon blood cells from the four experimental groups showed differential expression levels. The experimental group vaccinated with IpathÒ showed a higher transcriptomic response compared to the commercial vaccines used. Notably, the annotations of the differentially expressed genes (DEGs) shared by the three experimental groups showed an enrichment of genes related to iron homeostasis and metabolism. Additionally, the behavior of different signaling pathways and their possible transcriptomic remodeling in each experimental group were analyzed, with the group vaccinated with IpathÒ being the most represented in all pathways, in terms of DEGs. The HIF-1 signaling pathway and ferroptosis were significantly activated, which could predict that vaccination with IpathÒ could be regulating hypoxia due to iron deficiency, or cell death due to ferroptosis, which could occur in Atlantic salmon during a C. rogercresseyi and P. salmonis exposition. The present study revealed transcriptomic remodeling in response to different immunostimulations, allowing us to delve into the molecular mechanisms involved in the immune response of Atlantic salmon. This approach explores in detail the changes in gene expression and AS that occur in different tissues, providing valuable information on the adaptive immune response and plasticity of the Atlantic salmon immune system. In addition, it highlights the importance of integrating different study models to obtain a comprehensive view of the immune response at different levels and contexts. This work provides valuable information to contribute to the development of disease management strategies in salmon farming, including the identification of molecular markers of immune response, the selection of resistant strains, and the design of more effective vaccines.