Comparación del cultivo de células de peces en 2D y crecimiento en andamios de durvillaea antarctica con futura aplicación en carne in vitro.

Abstract

En la actualidad, los alimentos de origen marino como pescados proporcionan un componente importante dentro de las dietas mundiales, especialmente en el aporte de proteínas. Inicialmente las actividades de pesca por captura y acuicultura son las fuentes convencionales de proteína de origen marino, pero tomando en consideración el panorama actual de dichas fuentes sobre el agotamiento de los recursos por parte de la pesca es que se emplea una alternativa sobre cubrir la demanda a partir de carne cultivada a base de células, en lugar de criar animales. Los métodos para producir carne in vitro requieren del aislamiento de células musculares además de innovaciones y estudios sobre la elaboración de andamios para imitar las características biológicas y físicas in vivo. Por lo tanto, este trabajo presenta un avance sobre el aislamiento de células asociadas al músculo esquelético del pez cebra (Danio rerio) como modelo de estudio para que pueda ser llevado a otros peces de interés comercial y poder compararlas con otras líneas celulares; una línea celular de salmón (CHSE-214) y una línea celular de mioblastos de ratón (C2C12) en 2D. Obteniendo resultados comparativos entre dichas fuentes celulares como el índice de viabilidad mediante ensayo de reducción con alamarBlue, que mide el poder reductor de las mitocondrias celulares frente al reactivo de alamarBlue® . En base a las comparaciones basadas en el tiempo de duplicación se observa que las tasas de crecimiento de las C2C12 tienen un tiempo de duplicación mayor respecto a las células de salmón y que las de pez cebra, esperable al ser un linaje de mamífero con un metabolismo mayor, con un Td de 23,8 h < 30,8 h < 331,8 h respectivamente. Siendo este último tiempo mayor al resto, lo que implica que las células asociadas al músculo esquelético del cultivo primario, en vez de duplicarse se mantienen en cultivo. A partir de estos resultados, se descarta el uso de este tipo de cultivo para su evaluación en el crecimiento de biorreactores que contienen los andamios debido al requerimiento de siembra inicial que debe superar los 10 x 106 células/ml. Debido a la baja cantidad de células obtenidas del cultivo primario de Danio rerio es que se utilizaron las C2C12 a modo de reemplazo de células asociadas al músculo para ser utilizadas en andamios de Durvillaea antarctica (cochayuyo) pertenecientes a LUYEF Biotechnologies como estructuras de adhesión y ser comparadas con las células CHSE-214. Dichos andamios fueron recubiertos con gelatina de piel de cerdo seleccionado por ensayos preliminares con alamarBlue en 2D, identificando los mejores tipos de matrices para aumentar la proliferación y adherencia celular. A pesar de que el recubrimiento con colágeno I fue óptimo, el descarte de esta opción se basa exclusivamente en el análisis técnico económico, considerando los intereses de la industria y de los propios consumidores es que se eligió la gelatina antes que el colágeno. Aunque el crecimiento en 2D vs 3D pudo ser comparable, también se logró evidenciar que ambas líneas celulares C2C12 y CHSE-214 crecen y se adhieren a los andamios de LUYEF, lo que nos permite concluir que existe un potencial de multiespecificidad dado que tipos celulares distintos pudieron perfundir y crecer en estas estructuras tridimensionales.

At present, foods of marine origin such as fish provide an important component in world diets, especially in the contribution of proteins. Initially, the activities of capture fishing and aquaculture are the conventional sources of protein of marine origin but considering the current scenery of these sources on the depletion of resources by fishing, an alternative is used to cover the demand from cell-based cultured meat, instead of raising animals. Methods to produce meat in vitro require the isolation of muscle cells as well as innovations and studies on the construction of scaffolds to mimic the biological and physical characteristics in vivo. Therefore, this work presents an advance on the isolation of cells associated with the skeletal muscle of zebrafish (Danio rerio) as a study model so that it can be taken to other fish of commercial interest and be able to compare them with other cell lines; a salmon cell line (CHSE-214) and mouse myoblast cell line (C2C12) in 2D. Obtaining comparative results between said cell sources such as the viability index by means of a reduction assay with alamarBlue, which measures the reducing power of cellular mitochondria against the alamarBlue® reagent. Based on the comparisons based on the doubling time it is observed that the growth rates of C2C12 have a longer doubling time compared to salmon cells and those of zebrafish, which is to be expected as it’s mammalian lineage with a metabolism greater, with a Td of 23.8h < 30.8h < 331.8h, respectively. This last time being longer than the rest, which implies that the cells associated with the skeletal muscle of the primary culture, instead of duplicating, are maintained in culture. Based on these results, the use of type of culture for its evaluation in the growth of bioreactors containing the scaffolds is ruled out due to the initial seeding requirement that must exceed 10 x 106 cells/ml. Due to the low amount of cells obtained from the primary culture of Danio rerio, C2C12 was used as a replacement for muscle associated cells to be used in Durvillaea antarctica (cochayuyo) scaffolds belonging to LUYEF Biotechnologies as adhesion structures and be compared to CHSE-214 cells. Said scaffolds were coated with pig skin gelatin selected by preliminary tests with 2D assay of alamarBlue, identifying the best types of matrixes to increase cell proliferation and adhesion. Even though the coating with collagen I was optimal, the discarding of this option is based exclusively on the economic technical analysis, considering the interests of the industry and of the consumers themselves, because gelatin was chosen over collagen. Although the growth in 2D vs 3D could be comparable, it was also possible to show that both C2C2 and CHSE-214 cell lines grow and adhere to the LUYEF scaffolds, which allows us to conclude that there is a potencial for multispecificity since different cell types they were able to perfuse and grow into these three-dimensional structures.