Desarrollo de un test de penetración espermática múltiple en zonas pelúcidas intactas conservadas en soluciones salinas hipertónicas en bovinos.

Abstract

El test de penetración espermática múltiple de zonas pelúcidas se basa en la inactivación de oocitos mediante la solución hipertónica STORE-UDEC, que aumenta el espacio perivitelino y neutraliza la reacción de zona, permitiendo cuantificar espermatozoides en el espacio perivitelino y aumentar la sensibilidad de los estudios destinados a evaluar la fertilidad potencial de machos y eyaculados. Zonas pelúcidas obtenidas de oocitos madurados in vitro, fueron coincubadas con espermatozoides expuestos a condiciones de capacitación y dejados interactuar por 18 horas a 38,5ºC y 5 %CO2 en aire. Luego las zonas fueron limpiadas mecánicamente, de espermatozoides adheridos y aquellos que penetraron el espacio perivitelino fueron cuantificados rotándolas en un portaobjeto excavado bajo microscopía de contraste de fase diferencial. Se evaluó el efecto del tiempo de incubación de zonas pelúcidas (0,6 y 18 horas), la concentración de heparina en la incubación (0, 10, 25, 50 y 100 g/mL) y el grado de maduración de los oocitos (VG, MI y MII) sobre la eficiencia de penetración espermática. La evaluación de la eficiencia de penetración espermática se hizo en términos de tasas de penetración espermática y número de espermatozoides en el espacio perivitelino (spz en EPV); el tiempo de incubación de zonas pelúcidas mostró diferencias significativas (P0,05) entre 0 hr=60% (3,8 spz en EPV) v/s 6 hrs=97,1% (9 spz en EPV) y 18 hrs=100% (7,9 spz en EPV). La heparina en diferentes concentraciones no incide en la eficiencia de la penetración espermática 0g/mL=81,3% (4,7 spz en EPV), 10g/mL=79,5% (5,6 spz en EPV), 25g/mL=90,5% (4,9 spz en EPV), 50g/mL=83,6% (5,3 spz en EPV), 100g/mL=83,6% (5,3 spz en EPV), y en la evaluación individual de toros se obtuvo similares resultados. En la evaluación del grado de maduración de oocito se evidenció el efecto de la maduración in vitro en términos de espermatozoides en el espacio perivitelino VG=78,5% (5,8 spz en EPV), MI=73,3% (6,6 spz en EPV) y MII=97,6% (9,1 spz en EPV).