Browsing by Author "Fuente Contreras, Mery Jessi de la"
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Item Desarrollo de una biopelícula antagónica para el control de flavobacterium psychrophilum.(Universidad de Concepción, 2013) Fuente Contreras, Mery Jessi de laChile se ha convertido en uno de los principales productores de salmones a nivel mundial; sin embargo, las enfermedades infecciosas han surgido con desastrosas consecuencias económicas para el sector. Entre las enfermedades infecciosas, la flavobacteriosis producida por Flavobacterium psychrophilum, destaca como una enfermedad de alto impacto en el cultivo de salmón. Se conoce poco de la patogénesis de F. psychrophilum, pero la adherencia a agallas e intestino es probablemente el paso inicial de la infección. La adherencia a superficies es también el primer paso para la formación de biopelículas, que corresponden a comunidades microbianas naturales que viven adheridas a superficies como estanques y biofiltros, y protegidas dentro de una matriz orgánica sintetizada por ellas mismas, expresando un repertorio de genes que en muchos casos incrementa su virulencia y las hace persistir en el ambiente. El tratamiento contra F. psychrophilum se basa en el uso de antibióticos; sin embargo, en el último tiempo, la excesiva utilización de estos compuestos ha sido cuestionada tanto por los efectos ambientales y toxicológicos como por la resistencia que presentan los microorganismos y la baja susceptibilidad cuando se encuentran en el estado de biopelículas. La aplicación de relaciones antagónicas microbianas se presenta como un método alternativo de control eficiente de patógenos y a la vez amigable con el ambiente. Se conoce que entre los principales mecanismos de antagonismo se encuentran la producción de antibióticos y/o bacteriocinas, la producción de peróxidos y la de sideróforos. Estos mecanismos se han estudiado principalmente sobre células en estado planctónico y se conoce poco sobre su efecto en biopelículas. El mecanismo más estudiado en biopelículas involucra la interferencia en el sistema de señalización celular conocido como Quórum Sensing (QS), que también puede evitar la expresión de ciertos genes de virulencia. En acuicultura, el antagonismo bacteriano es la base para el desarrollo de probióticos y estos ya están siendo utilizados en el cultivo de peces y camarones y pueden ser aplicados en el alimento o al tanque de cultivo con el fin de evitar infecciones con bacterias patógenas y mejorar el crecimiento y desarrollo de estos organismos. Sin embargo, actualmente no existe un tratamiento probiótico comercial indicado para el control de F. psychrophilum y no se conoce qué efecto puede tener una bacteria antagonista sobre la formación de biopelículas de F. psychrophilum. Los probióticos tienen la desventaja que no son capaces de mantenerse en el ambiente y necesitan ser re-aplicados regularmente y en altas concentraciones, por este motivo un tipo de biocontrolador podría ser el diseño de biopelículas antagónicas, las cuales se depositen sobre una superficie con el fin de evitar la adherencia de microorganismos no deseados, sistema que podría ser de utilidad para el control de patógenos en acuicultura. Usando F. psychrophilum como patógeno modelo, en esta tesis se desarrolló una biopelícula antagónica para controlar la adherencia de patógenos bacterianos de peces en superficies de piscicultura. Se analizaron 88 cepas bacterianas aisladas de pisciculturas chilenas las que fueron sometidas a un ensayo de antagonismo contra F. psychrophilum mediante el método de difusión en agar y a un ensayo de bloqueo quórum sensing mediante el uso de cepas reporteras. Se evaluó la actividad de cada sobrenadante obtenido desde las cepas antagonistas que resultaron positivas en los ensayos anteriores y el efecto de los sobrenadantes con mayor actividad se evaluó sobre la formación de biopelículas de F. psychrophilum. En una segunda etapa se realizó una caracterización preliminar de las moléculas presentes en los sobrenadantes y se realizó la detección de sideróforos, peróxidos y moléculas autoinductoras. Finalmente, en una tercera etapa, se estudió el efecto de la biopelícula del antagonista sobre la formación de biopelículas de F. psychrophilum en un sistema quimiostato, cuantificando las células adheridas de cada especie mediante PCR tiempo real. Los resultados mostraron que 10,2% de las cepas tuvieron actividad inhibitoria del crecimiento, mostrando 7 de ellas actividad en el sobrenadante. De las 88 cepas, 4 cepas tuvieron actividad anti-QS teniendo sólo una cepa actividad en el sobrenadante ensayado en placas de agar. Los sobrenadantes con mayor actividad fueron los provenientes de cultivos de las cepas FF48, FF16, F6 y FE14 y de estos sobrenadantes los que permitieron la menor formación de biopelículas de F. psychrophilum fueron los de las cepas FF48 y FF16. En el caso del sobrenadante FF48 se detectaron sideróforos y un compuesto de tipo proteico; en cambio, en FF16 sólo se detectó sideróforos. FF16 correspondió a Pseudomonas putida y FF48 a Pseudomonas fluorescens. En una etapa posterior los resultados indicaron que al formar previamente la biopelícula antagónica es posible evitar la formación de biopelículas de F. psychrophilum, pero no se logra el mismo efecto cuando ambas biopelículas son formadas simultáneamente. De acuerdo a los resultados obtenidos en este trabajo se concluye que la biopelícula antagónica de la cepa FF48 de P. fluorescens fue capaz de evitar la formación de biopelículas de F. psychrophilum.Item Mutaciones en los genes codificantes de topoisomerasa IV y su rol en la resistencia a fluoroquinolonas en cepas clínicas de bacilos gram negativos.(Universidad de Concepción, 2007) Fuente Contreras, Mery Jessi de la; González Rocha, Gerardo EnriqueLas quinolonas son un grupo de antibióticos sintéticos que han sido usados por más de 40 años en el tratamiento de infecciones hospitalarias y de la comunidad. El masivo uso de estos compuestos ha seleccionado bacterias resistentes a ellos y el principal mecanismo de resistencia corresponde a mutaciones en los genes que codifican para las subunidades de las enzimas blanco ADN girasa y topoisomerasa IV. El objetivo de esta tesis fue detectar mutaciones en los genes codificantes de topoisomerasa IV en cepas hospitalarias resistentes y susceptibles a fluoroquinolonas. Se incluyeron 89 cepas de las especies Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii y Pseudomonas aeruginosa, resistentes a ácido nalidíxico, aisladas entre los años 1990 y 2003, en diferentes hospitales chilenos. Además, se disponía de información acerca de la concentración de mínima inhibitoria (CMI) de fluoroquinolonas. Se realizó la amplificación de la región determinante de resistencia a las quinolonas, ubicada en los genes codificantes de topoisomerasa IV, mediante PCR. Posteriormente, se realizó la digestión de los productos de PCR con enzimas de restricción que poseían un sitio de corte cercano a los codones en los que se ha descrito mutaciones con mayor frecuencia. Además, se realizó la secuenciación de los productos de PCR de algunas cepas, seleccionadas por sus distintos patrones de restricción.