Browsing by Author "Gatica Miranda, Marcell Alejandra"
Now showing 1 - 2 of 2
Results Per Page
Sort Options
Item Análisis de la estructura cuaternaria del transportador de ácido ascórbico SVCT2(Universidad de Concepción., 2016) Gatica Miranda, Marcell Alejandra; Rivas Rocco, CoraliaLa forma reducida de la vitamina C, el ácido ascórbico (AA), es transportado al interior de las células por la familia de cotransportadores de sodio-ascorbato SVCT, con 2 formas funcionalmente activas, SVCT1 y SVCT2. Se ha propuesto un modelo funcional para el ciclo de transporte de ambos SVCTs, en el cual el transportador presenta un sitio de unión para el sustrato AA, al menos dos sitios de unión para Na+ y un sitio de unión Ca2+ y Mg2+. Durante el ciclo de transporte ambos sitios de unión a sodio interactúan entre ellos y además interaccionan con el sitio de unión a AA, el cual a su vez afectaría recíprocamente la interacción entre ambos sitios de unión a sodio. De igual manera el sitio de unión a cationes divalentes interacciona con el sitio de unión a AA ya que se ha visto que en ausencia de cationes divalentes el transportador es inactivo. Aunque existen numerosos estudios acerca de los aspectos cinéticos y funcionales de SVCT2, no existe información estructural disponible para este transportador. Análisis de hidrofobicidad revelaron que los SVCTs son altamente hidrofóbicos y están compuestas por 12 hélices de transmembrana unidas entre sí por lazos ricos en aminoácidos hidrofílicos y con los extremos amino y carboxilo-terminal orientados hacia la cara citoplasmática de la célula. Sin embargo hasta la fecha, no se tienen antecedentes acerca de la estructura 3D de SVCT2 ni del estado de oligomerización de este transportador en la membrana celular. Por otro lado, existe evidencia que indica que la oligomerización es una característica esencial para la estructura y función de los transportadores de membrana. Cristalización de diferentes transportadores de membrana bacterianos junto a diversos estudios utilizando técnicas alternativas a la cristalización, como ensayos de entrecruzamiento, transferencia de energía de resonancia de Föster (FRET), coinmunoprecipitación, entre otras, han llevado a proponer que aproximadamente el 70% de los transportadores están formando oligómeros en la membrana plasmática, por ejemplo, transportadores que usan el gradiente electroquímico como energía para catalizar la translocación de su sustrato, existen como oligómeros de alto orden, dímeros (vSGLT y LeuTA), trímeros (AcrB, GltpH y BetP) o tetrámeros (GLUT1)), aunque evidencia de monómeros (Mhp1) también fue reportada. Recientes estudios de microscopía electrónica en hSVCT1 expresado en ovocito, reveló la presencia de dos poblaciones de partículas con distinta forma y estructura a baja resolución lo que sugiere la presencia de monómeros y dímeros del transportador. Por otro lado, ensayos de entrecruzamiento químico confirmaron la presencia de dímeros en membranas aisladas de estos ovocitos, aunque a concentraciones menores comparadas con el monómero de hSVCT1. La información estructural es importante para comprender el mecanismo de estos transportadores a nivel molecular. Por lo que el propósito de esta tesis fue determinar la estructura cuaternaria de hSVCT2. Ensayos de entrecruzamiento químico de hSVCT2 seguido de inmunomarcaje con anticuerpos específicos sugieren que hSVCT2 existe como dímero. Además, realizamos ensayos de transporte de AA para comprender la significancia funcional de la oligomerización de hSVCT2 y así poder determinar la unidad mínima funcional de este transportador de membrana. Dentro de estos ensayos realizamos estudios funcionales de co-expresión del transportador activo (nativo) y una mutante inactiva de hSVCT2 (H109Q), que revelaron que hSVCT2 nativo no restauró la capacidad de transporte de la mutante inactiva, ni esta última suprimió la capacidad de transporte del transportador nativo. Por otro lado, al coexpresar el transportador nativo junto a una mutante (C113S o C160S) que presenta características cinéticas alteradas (Km aparente de transporte, al menos 5 veces superior a la del transportador nativo), revelaron que a todas las razones moleculares ensayadas se detectó un único componente cinético que corresponde a la proteína que se expresa en mayor proporción. A partir de estos resultados, podemos proponer que hSVCT2 forma dímeros en membrana celular, que la unidad mínima de transporte dentro del dímero de hSVCT2 podría ser el monómero y que los monómeros dentro del dímero son capaces de interactuar entre ellos modulando sus propiedades cinéticas.Item Identificación y caracterización estructural y funcional de aminoácidos que forman parte del bolsillo endofacial de unión a ácido ascórbico en el transportador AVCT2.(Universidad de Concepción., 2009) Gatica Miranda, Marcell Alejandra; Vera Cárcamo, Juan CarlosLa forma reducida de la vitamina C, el ácido ascórbico, es transportada al interior celular por la familia de cotransportadores de sodio-ascorbato SVCT, con 2 isoformas, SVCT1 y SVCT2, los que pertenecen a la superfamilia de facilitadores principales (MFS), la que cuenta con más de 1000 miembros. Solamente tres transportadores de esta familia han sido cristalizados a alta resolución, la lactosa permeasa (LacY), el transportador de glicerol-3-fosfato (GlpT) y el transportador de multidrogas (EmrD). Aunque los transportadores pertenecientes a la MFS poseen un bajo porcentaje de identidad a nivel de estructura primaria (< 14%), las proteínas hasta ahora cristalizadas muestran un modelo de plegamiento 3D extraordinariamente similar, lo que ha llevado a la propuesta de que todos los miembros de esta familia poseerían un plegamiento 3D común con una disposición espacial similar de sus segmentos transmembrana. Otro aspecto común a esta familia de transportadores es que el mecanismo de transporte se caracteriza por la exposición alternante del sitio de unión del sustrato entre dos estados conformacionales de la proteína, endofacial y exofacial, con un vestíbulo accesible intracelularmente en la conformación endofacial o extracelularmente en la conformación exofacial. Además, un aspecto central del modelo es que los cambios conformacionales inducidos por la unión del sustrato y que llevan a su translocación a través del transportador, son favorecidos por la presencia de cosustratos o moléculas activadoras. SVCT2 corresponde a un cotransportador de sodio ácido ascórbico en el cual el ión sodio activa en forma cooperativa el transporte de ácido ascórbico disminuyendo marcadamente la Km de transporte, mientras el ácido ascórbico a su vez afecta el efecto cooperativo del ión sodio. En esta Tesis nos propusimos utilizar la estructura cristalina de LacY como molde 2 molecular para construir un modelo 3D del transportador de ácido ascórbico SVCT2, con el fin de identificar aquellos residuos de aminoácidos importantes para el transporte de ácido ascórbico por homología estructural con LacY, en base a los siguientes antecedentes: i) LacY es un cotransportador de H+ -lactosa perteneciente a la superfamilia MFS y posee un mecanismo de transporte similar al de SVCT2, ii) LacY ha sido cristalizado por lo que se dispone de un modelo 3D de alta resolución, iii) estudios de mutagénesis sitio dirigida y de dinámica molecular han permitido identificar los residuos de aminoácidos implicados en la unión y el transporte de lactosa en LacY y correlacionarlos con la estructura 3D, iv) los miembros de la superfamilia MFS parecen tener una estructura 3D altamente conservada, v) existe un número importante de transportadores SVCT secuenciados en diversas especies, lo que permite un análisis filogenético de conservación de secuencia en la familia completa de los SVCTs para identificar residuos de aminoácidos altamente conservados importantes funcionalmente, y vi) existe evidencia indicando que es posible generar un modelo 3D de un transportador por homología estructural con otro miembro de la misma familia. El estudio de homología estructural entre SVCT2 y LacY permitió identificar 9 residuos de aminoácidos, Gln108, His109, Ile229, His269, Ile277, Thr434, Gly437, Ser440 y Ser441, los que de acuerdo a su conservación y localización en el modelo 3D de SVCT2 deberían ser claves para la unión endofacial de ácido ascórbico. Estos residuos fueron reemplazados por mutagénesis sitio-dirigida, llevando a cabo reemplazos conservativos y no conservativos, y las respectivas mutantes de SVCT2 fueron transfectadas y expresadas en células HEK-293, determinando su nivel y sitio de expresión celular por microscopía confocal, analizando su capacidad para transportar ácido ascórbico, las propiedades funcionales y cinéticas asociadas al transporte y el efecto sobre la activación por sodio. La 3 hipótesis central de esta Tesis es que si estos residuos de aminoácidos son parte del sitio endofacial de unión de ácido ascórbico en SVCT2, su reemplazo debería afectar marcadamente la capacidad de SVCT2 para transportar ácido ascórbico, alterando tanto el valor de las constantes cinéticas de transporte como el efecto activador del sodio. Los resultados de este estudio permitieron identificar cuatro grupos de mutaciones introducidas en 9 residuos de aminoácidos distintos, los que se encuentran localizados endofacialmente en tres dominios transmembrana no continuos en la secuencia de SVCT2, y cuyo reemplazo afecta la localización y las propiedades funcionales del transportador: i) mutaciones tipo I, que inactivan totalmente el transportador con pérdida de la capacidad de transporte; ii) mutaciones tipo II, que producen marcados cambios en la Km y en la Vmax de transporte de ácido ascórbico, con conservación del efecto de activación cooperativa por Na+; iii) mutaciones tipo III, que producen marcados cambios en la Km y en la Vmax de transporte de ácido ascórbico asociado a una pérdida del efecto de activación cooperativa por Na+ ; y iv) mutaciones tipo IV, que alteran la localización celular de SVCT2, el que queda retenido intracelularmente con ausencia de expresión a nivel de la membrana plasmática. En conjunto con el modelo 3D del transportador, los resultados funcionales permiten concluir que estos tres grupos de aminoácidos serían parte del sitio de unión endofacial de ácido ascórbico y son fundamentales en definir las características funcionales y cinéticas de SVCT2.