Browsing by Author "Meza Franco, Catherine Denisse"
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Item Caracterización de un modelo celular in vitro de glándula mamaria de cabra para su uso como biorreactor.(Universidad de Concepción, 2012) Meza Franco, Catherine Denisse; Toledo Alonso, Jorge Roberto; Martínez, AndreaLa glándula mamaria ha resultado una alternativa apropiada para la producción de proteínas recombinantes de interés biofarmacéutico o industrial, pues se demostró que las células epiteliales productoras de leche tienen un alto nivel de expresión y procesamiento de proteínas complejas y glicosiladas. Además, estas células poseen la capacidad de expresar estas proteínas con modificaciones post-traduccionales similares a las que se producen en humanos. La expresión de biofármacos en la glándula mamaria de rumiantes permite la producción de proteínas recombinantes a niveles de gramos/litro diarios, sin embargo, el proceso de transformación genética de mamíferos como biorreactores resulta complicado, costoso y de un largo tiempo. Es por esta razón, que resulta importante disponer de un modelo celular de glándula mamaria que permita evaluar las capacidades de transformación genética de dichas células y la expresión de glicoproteínas complejas in vitro, simulando condiciones del proceso in vivo. Para la obtención de un modelo celular de glándula mamaria, se dispuso de un explante de tejido mamario de una cabra (Capra hircus) de 105 días de lactancia. El cultivo celular primario se generó mediante la técnica de digestión enzimática con colagenasa y posterior siembra en placas de cultivo celular adherente. Mediante un tratamiento de tripsinización selectiva, se obtuvo un cultivo enriquecido en células epiteliales mamarias con capacidad de división celular estable. A partir del pase 12, se realizaron los ensayos para caracterizar el modelo mediante microscopia confocal y evaluación inmuno-citoquímica para marcadores celulares distintivos (E-cadherina, N-cadherina, vimentina). Se obtuvo una caracterización positiva para células epiteliales y se corroboró la capacidad de división del cultivo celular hasta 32 pases en placas de cultivo adherente. El modelo celular de glándula mamaria de cabra obtenido, resultó positivo a la capacidad de transformación genética tanto con vectores adenovirales como lentivirales. Además, se obtuvo la expresión y secreción de la glicoproteína FSH recombinante en el medio de cultivo de las células después de la transducción genética adenoviral. También, se demostró que este modelo celular responde favorablemente a la inducción con hormonas lactogénicas aumentando su supervivencia durante 30 días en ausencia de suero fetal y la expresión de proteínas recombinantes. El presente trabajo permite disponer de un modelo celular de glándula mamaria de cabra, mayoritariamente compuesto de células epiteliales que responden a inducción hormonal, con capacidad de transducción genética con vectores virales y con potencialidad para la expresión y secreción de glicoproteínas recombinantes de interés biofarmacéutico durante al menos un mes de cultivo continuo.Item Modulación de la respuesta inmune contra el autoantígeno humano MUC16 mediante la co-activación con el ligando del receptor CD40.(Universidad de Concepción, 2021) Meza Franco, Catherine Denisse; Toledo Alonso, Jorge RobertoEl estudio de las patologías asociadas al desarrollo y progresión de tumores malignos tiene un componente inmunológico relevante. La literatura pertinente ha crecido en forma exponencial desde 1970 hasta la fecha, tanto en el enfoque experimental como en el clínico. La sospecha de que los organismos vivos intentan de alguna manera defenderse de un proceso maligno ha encontrado apoyo en numerosos hechos experimentales y clínicos que hoy en día sustentan la teoría de la inmunoedición del cáncer, dando paso al desarrollo de tratamientos basados en inmunoterapia. Estas terapias aprovechan las características del sistema inmune para tratar o prevenir enfermedades. A grandes rasgos, significa estimular o atenuar biológicamente el sistema inmune de los pacientes para lograr una reacción dirigida contra tumores o patógenos que provocan una enfermedad determinada o bien la tolerancia de células inmunes hacía lo propio. La tolerancia inmunológica representa una problemática en la búsqueda de alternativas terapéuticas contra el cáncer, debido en parte, a que la mayoría de los antígenos expresados por las células tumorales no son exclusivos de él, sino que corresponden a antígenos de diferenciación de tejidos que también se expresan en células normales. Estos son conocidos como auto-antígenos, y están bajo el control de la auto-tolerancia inmunológica. Ejemplo de lo anterior es la mucina 16 (MUC16), una proteína altamente glicosilada que se expresa normalmente en el epitelio de diversos órganos y cuya función primaria es hidratar, proteger y lubricar estas superficies. Sin embargo, esta proteína también se ha encontrado sobreexpresada en diversos tipos de cáncer, donde cumple una función como antígeno asociado a tumor y como oncoproteína, favoreciendo el crecimiento de células tumorales, la motilidad y la invasión celular. Hasta la fecha se han desarrollado múltiples inmunoterapias dirigidas contra MUC16. La efectividad terapéutica antitumoral observada con estos tratamientos y los efectos secundarios, generalmente leves, asociados al bloqueo de esta proteína, mantienen abierta la posibilidad de continuar investigando en otras estrategias de inmunoterapia antígeno-específica contra esta mucina. Una aproximación que podría romper la barrera de la inmunotolerancia es la inmunoterapia dirigida a la co-activación de células dendríticas (CDs), debido a la dualidad de estas células de activar tanto el sistema inmune innato como el adaptativo. Una estrategia para ello sería orientar antígenos tumorales a receptores expresados en CDs, como el CD40. Este receptor participa en la inducción de la maduración de CDs, en la activación de linfocitos T y en la inducción de la respuesta tipo TH1, siendo estos, procesos esenciales para superar la barrera de inmunotolerancia y así, regular la progresión tumoral. En base a lo anterior, el objetivo del presente trabajo de tesis fue la generación de una formulación vacunal que permitiera incrementar significativamente el nivel y persistencia de la respuesta inmune contra el autoantígeno MUC16 humano. Para ello se construyeron candidatos vacunales quiméricos, basados en el autoantígeno MUC16 y la molécula co-estimulatoria CD40 ligando (CD154), estos se expresaron en cultivos celulares de mamíferos mediante transducción con vectores adenovirales. Las proteínas recombinantes producidas fueron utilizadas para inocular ratones C57bl6 que generaron tumores con expresión de antígeno MUC16 mediante tratamiento profiláctico y tratamiento terapéutico. Mediante este análisis se logró determinar que el candidato vacunal quimérico proveniente del antígeno tumoral humano MUC16 y de la molécula co estimuladora CD154 producido en un modelo de carcinoma cervicouterino (células SiHa), y cuya utilización fue eficientemente demostrada en modelos de ratones bajo un esquema de tratamiento preventivo, promueve una asociación sinérgica, que incrementa significativamente el nivel efector de la respuesta inmune contra el antígeno MUC16.