Browsing by Author "Moraga Cid, Gustavo Alonso"
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Item Control de la Conductancia del Receptor GABAA por Residuos Intracelulares: Implicancias en la Regulación del Canal por Fosforilación.(Universidad de Concepción, 2023) Fraig Lobos, David Esteban; Moraga Cid, Gustavo AlonsoLos receptores de ácido -aminobutírico tipo A (GABAARs) son los principales responsables de la neurotransmisión inhibitoria en el sistema nervioso central (SNC) en mamíferos. Estos receptores pertenecen a la familia de canales iónicos pentaméricos activados por ligando (pLGICs). Cada subunidad que forma el pentámero, presenta una arquitectura común entre todos los miembros de la familia, con el extremo N-terminal (ECD) expuesto hacia el exterior de la membrana, conteniendo el sitio ortostérico, un dominio transmembrana (TMD) compuesto por 4 hélices alfa (TM1-TM4), de los cuales el dominio TM1 está unido al dominio N-terminal, el dominio TM2 delimita el poro central y los dominios TM3-TM4 se encuentran unidos por una larga asa localizada en el dominio intracelular (ICD). En un contexto funcional, el ICD de los GABAARs es blanco de acción de diversas proteínas quinasas, como PKA y PKC, las cuales regulan la función, el tráfico y expresión de los GABAARs. Diversos mecanismos moleculares han sido propuestos para explicar la modulación alostérica ejercida por eventos de fosforilación. Estos mecanismos proponen un aumento en la tasa de internalización luego de un evento de fosforilación. Además, se ha propuesto que la fosforilación de residuos en el ICD impacta sobre la estructura del ECD, afectado la afinidad del receptor por su agonista. Sin embargo, aun cuando estos mecanismos parecen plausibles, la posibilidad de que los eventos de fosforilación afecten propiedades intrínsecas del canal, como la probabilidad de apertura o su conductancia no han sido estudiados de forma extensiva. En esta línea, un trabajo reciente en otro miembro de la familia, el receptor de glicina alfa 3 (GlyR 3), ha propuesto que la fosforilación del residuo serina 346, localizado en el ICD, reduce de forma significativa la conductancia del canal. Usando registros de canal único en GlyR 3 que portan una mutación fosfomimética (S346E), los autores reportaron una reducción significativa de las corrientes unitarias, sin cambios en la distribución del receptor en la superficie de la membrana plasmática. En este contexto, debido a la estrecha relación, en términos de estructura, función y farmacología que existe entre los receptores GABAARs y GlyRs es posible sugerir que los efectos inhibitorios en las corrientes unitarias mediadas por la fosforilación del residuo S346 en el receptor GlyR 3 pueden constituir un mecanismo de acción conservado en los miembros de la familia. Basados en estos antecedentes, en el presente trabajo proponemos que “La introducción de una mutación fosfomimética en el residuo S410 en el ICD de la subunidad 2 del receptor GABAA altera la sensibilidad a GABA y la conductancia unitaria del receptor”. Usando registros electrofisiológicos en la modalidad de célula completa o de canal único se evaluó el efecto de la introducción de una mutación fosfomimética (S410E) en la actividad del receptor GABAAR 12. Los estudios de la respuesta macroscópica a concentraciones crecientes de GABA, mostraron que la introducción de la mutación S410E no tuvo impacto sobre los parámetros de afinidad aparente (EC50), corrientes máximas (Imax) o densidad de corriente (J). De manera interesante, los análisis de canal único mostraron que la introducción de la mutación S410E tuvo un impacto significativo en las corrientes unitarias del canal. Este efecto no fue observado cuando se introdujo una mutación no fosfomimética (S410A), indicando un efecto específico del residuo cargado negativamente. De esta forma, el presente trabajo propone que los efectos de una fosforilación en residuos localizados en el ICD pueden ser explicados por una reducción en la conductancia unitaria del canal, el cual es un mecanismo molecular conservado en al menos, dos miembros de la familia pLGICs.Item Desarrollo de sulfonamidas como moduladores alostéricos positivos del receptor de glicina α3 fosforilado: una alternativa terapéutica potencial para el tratamiento del dolor crónico.(Universidad de Concepción, 2025) Pacheco Paternina, Laura Cristina; Ramírez Sánchez, David Mauricio; Moraga Cid, Gustavo Alonso; López Villa, Jhon JairoGlycine receptor modulation has emerged as a promising strategy for developing safer and more effective therapeutic alternatives for chronic pain treatment. This study evaluated the potential of sulfonamides containing tetrahydroquinoline rings as positive allosteric modulators (PAMs) of the glycine receptor α3 (GlyRα3). Phosphorylation of GlyRα3 at serine 346, mediated by protein kinase A (PKA), inhibits glycinergic currents and contributes to pain sensitization. To counteract this effect, sulfonamide derivatives with tetrahydroquinoline (THQs) rings for GlyRα3 were computationally designed and evaluated. Through molecular dynamics simulations and binding free energy (∆GBind) calculations, the most stable and high-affinity compounds were selected. Subsequently, electrophysiological recordings were used to assess their ability to modulate glycinergic currents in both wild-type GlyRα3 and its phosphomimetic mutant S346E. The results demonstrated that JL-02 and CO2-1 establish stable interactions with GlyRα3, exhibiting improved stability and specificity compared to AM-3607. Notably, CO2-1 significantly enhanced glycinergic currents in GlyRα3 S346E, positioning it as a promising candidate for novel pain therapies. This study provides a strong foundation for the development of allosteric modulators targeting phosphorylated GlyRα3, with potential applications in chronic pain treatment.Item Determinación de la interacción entre el dominio intracelular de receptor de glicina α3 y la proteína del complejo de exocitosis SEC8.(Universidad de Concepción, 2024) Soto Ortega, Paul Francisco; Moraga Cid, Gustavo AlonsoEl receptor de glicina (GlyR), es un canal iónico pentamerico activado por ligando (pLGIC), crucial para regular la excitabilidad neuronal, y está implicado en afecciones como la hiperekplexia, el dolor crónico y la epilepsia. GlyR, que comprende cuatro subunidades alfa y una subunidad beta, puede existir en configuraciones homopentamérica (solo α) o heteropentamérica (α y β en una proporción de 4:1). Aunque los moduladores alostéricos históricamente se dirigieron a los dominios extracelular (ECD) y transmembrana (TMD), estudios recientes sugieren una modulación a través del dominio intracelular (ICD) que históricamente estuvo relacionado con la agrupación sináptica. Se descubrió que las proteínas intracelulares Gbeta-gamma mejoran su función. En particular, se identificó una nueva interacción del ICD GlyR α3 con la proteína SEC8, que influye en el transporte y tráfico axonal sin claridad sobre el impacto funcional. Este estudio investiga el efecto funcional de la interacción GlyR-SEC8 utilizando métodos bioquímicos, inmunohistoquímicos y electrofisiológicos. Nuestros resultados revelan un desplazamiento a la izquierda en la curva dosis-respuesta, lo que indica una mayor tasa de desensibilización sin alterar la expresión en la membrana o las corrientes máximas. Estos hallazgos abren nuevas vías para explorar la regulación de GlyR por componentes intracelulares.Item Identificación de residuos localizados en el dominio citoplasmático entre las regiones TM3 y TM4 críticos para la modulación alostérica de receptores de glicina y GABAa por propofol y etanol.(Universidad de Concepción, 2009) Moraga Cid, Gustavo Alonso; Aguayo Hernández, Luis GerardoA pesar de los extensos estudios realizados a lo largo de casi un siglo, los mecanismos involucrados en los efectos ejercidos por etanol y anestésicos generales sobre la función del SNC permanecen poco entendidos. En contraste a lo que ocurre con otras clases de drogas, los efectos de etanol y anestésicos generales fuéron por largo tiempo atribuidos a la acción en múltiples sitios inespecíficos localizados a nivel de la membrana plasmática. Sin embargo, a partir de la década de 1980 comenzó a cobrar vigor la hipótesis que propone a proteínas como blancos específicos de estos fármacos. En este contexto, los receptores para los neurotransmisores glicina (RGli) y acido γ-aminobutirico (RGABAA) han surgido como los blancos moleculares más importantes para los efectos ejercidos por etanol y anestésicos generales. La hipótesis actualmente aceptada para explicar los mecanismos moleculares por los cuales ocurren estos fenómenos de modulación, propone la existencia de potenciales sitios de interacción usados tanto por etanol como por anestésicos generales. Los residuos que componen estos potenciales sitios se encuentran localizados en las regiones transmembrana (TMs) del receptor, ubicación que les permite formar bolsillos o cavidades capaces de reconocer, con muy baja selectividad, una serie de moduladores estructuralmente divergentes. Por otra parte, evidencia reciente ha permitido generar una hipótesis alternativa. Ésta propone que la modulación del RGli está intrínsicamente ligada al grado de activación de las proteínas G. Estudios realizados en nuestro laboratorio permitieron sugerir que ésta modulación es producto de la interacción del heterodímero Gβγ con un grupo de residuos (316RFRRK320 y 385KK386) localizados en el dominio citoplasmático entre el TM3 y TM4 del RGli. Basados en estas observaciones, surgen una serie de interrogantes que necesitan ser respondidas, como por ejemplo, ¿Son estos sitios compartidos por otros moduladores alostéricos del RGli? o ¿Posee también este dominio intracelular residuos aminoacídicos determinantes para la sensibilidad del RGli a otros moduladores? ¿Existen residuos homólogos en la región citoplasmática de otros miembros de la superfamilia LGICs que cumplan un rol similar?De esta forma, el trabajo realizado en ésta tesis generó información que permitió contestar algunas de estas importantes interrogantes. Primero, abordamos el grado de selectividad de estos nuevos sitios descritos como críticos para etanol en términos de la sensibilidad a otros moduladores del RGli. Nuestros datos muestran que la mutación de estos residuos redujo significativamente la sensibilidad del RGli a etanol, sin alterar la capacidad del receptor de ser modulado por otros fármacos alostéricos, como n-alcoholes o anestésicos generales. Además, estudiamos el fenómeno de “cutoff” en una serie homóloga de n-alcoholes, el cual indirectamente podría dar cuenta de la presencia de una cavidad o bolsillo con un volumen determinado. En particular y a diferencia de lo reportado para los sitios transmembrana, estos residuos (316RFRRK320 y 385KK386) no formarían un bolsillo de unión, con un volumen aceptor determinado, debido a que el fenómeno de cutoff no sufrió modificaciones en los RGli hiposensibles a etanol. Estos observaciones muestran por primera vez que residuos importantes para la acción de etanol en el RGli, no son relevantes para la sensibilidad del receptor a otros moduladores alostéricos, lo que nos permite sugerir que este nuevo mecanismo de acción descrito para etanol, es de una naturaleza molecular diferente a los mecanismos utilizados por otros moduladores del RGli. Con estos datos en mente, es claro que existen residuos localizados en el dominio intracelular importantes para los efectos de etanol sobre el RGli, pero ¿es esta región importante para la acción de otros moduladores como anestésicos generales? Nuestros datos funcionales nos permiten sugerir un nuevo sitio para la acción del anestésico general intravenoso propofol, distinto a los descritos previamente, y más aún nos permiten sugerir por primera vez que la potenciación de las corrientes de glicina y GABA por propofol ocurre principalmente por una vía intracelular. Estas conclusiones se encuentran sostenidas por los datos obtenidos a través de tres estrategias experimentales independientes. Primero, utilizando estudios de mutagénesis sitio dirigida, realizados en los dominios citoplasmáticos de las subunidades α1 del RGli y α1 y β2 del RGABAA, determinamos que un residuo de Fenilalanina, localizado en regiones homólogas de la subunidades α1 del RGli (F380) y α1 del RGABAA (F385) es el responsable de la sensibilidad a propofol, mientras que la subunidad β2 del RGABAA no juega un rol crítico en la sensibilidad de este receptor a propofol. Estos sitios demostraron ser altamente selectivos para propofol, no resultando relevantes para la potenciación del receptor por otros moduladores alostéricos. Segundo, utilizando diálisis intracelular de proteínas con demostrada capacidad de unir propofol, determinamos que propofol debe alcanzar el espacio intracelular como un paso previo a la modulación de los RGli y RGABAA, tanto en sistemás recombinantes de expresión como en neuronas en cultivo. Tercero, utilizando análisis de registros de canal único determinamos que la sustitución de los residuos F380 en el RGli y F385 en el RGABAA redujo significativamente la potenciación de la probabilidad de apertura del canal, sin alterar sus parámetros cinéticos como el tiempo de apertura promedio y su conductancia. En conclusión, los datos generados en esta tesis nos permiten extender nuestro conocimiento acerca de los mecanismos involucrados en la modulación alostérica de los miembros de la superfamilia LGICs. Nuestros resultados nos permiten sugerir que el dominio citoplasmático mayor de los miembros de la familia LGICs, presenta residuos específicos y distintos para la acción de etanol y propofol. Estos resultados permiten además, iniciar nuevos estudios en la generación de drogas con minimos efectos indeseados.Item Modulación de la conductancia unitaria del receptor de glicina variante α3K por fosforilación mediada por PKA.(Universidad de Concepción, 2024) Fariña Oliva, Katherine Nicole; Moraga Cid, Gustavo Alonso; Yévenes Crisóstomo, Gonzalo EnriqueEl RGli pertenece a la superfamilia de canales iónicos activados por ligando pentaméricos (pLGICs) y se ha demostrado que subunidades específicas del RGli pueden desempeñar un papel clave en varias enfermedades. En el caso de la subunidad α3; se ha visto relacionada con la nocicepción y mecanismos de sensibilización al dolor crónico. Esta subunidad del receptor de glicina presenta dos variantes; α3L y α3K, que difieren en 15 aminoácidos ubicados en el ICD de la variante α3L y que no presenta la variante α3K. Esto debido al splicing alternativo que elimina el exón 8 del gen GNRL3. Se ha estudiado un mecanismo de sensibilización al dolor inflamatorio crónico, dependiente de la pérdida de inhibición glicinérgica del RGli α3L, tras la activación de los receptores neuronales EP2 y consecuente activación de PKA. De modo que, a través de estudios de inmunocitoquímica y registros electrofisiológicos pudimos observar que la mutación fosfomimética o la activación de PKA a través de bPAC, disminuye las corrientes glicinérgica de la variante α3K del RGli. Esta disminución es producto de una disminución en la conductancia unitaria del canal. Por lo tanto, nuestros hallazgos muestran que la variante α3K actúa de una forma similar a la variante α3L del RGli, frente a la activación de PKA mediante bPAC o en el modelo fosfomimético de α3K. De igual manera, pudimos observar que el PAM del RGli; 2,6-DTBP, restauró la conductancia unitaria del RGli α3K S346E, siendo esta similar a la conductancia de la variante α3K WT del RGli. Finalmente, el desarrollo de herramientas farmacológicas para la restauración de la actividad glicinérgica podría ejercer efectos anti-nociceptivos, recuperando el equilibrio excitatorio – inhibitorio fundamental en el funcionamiento del SNC.