Browsing by Author "Saavedra Sieyes, Paulina Andrea"

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    Caracterización de SVCT-1 short una nueva variante de empalme de SVCT-1 con propiedades regulatorias.
    (Universidad de Concepción, 2012) Saavedra Sieyes, Paulina Andrea; Zúñiga Arbalti, Felipe Andrés
    La vitamina C juega un importante papel en la mantención de la homeostásis normal de nuestro organismo y en la prevención de enfermedades. La vitamina C o ácido ascórbico (AA), funciona como un importante cofactor enzimático, permitiendo la síntesis de colágeno, péptidos neuroendocrinos y carnitina. Por otro lado, el AA es un poderoso antioxidante que participa en la neutralización de radicales peroxilo e hidróxilo, radicales superóxido y peroxinitrilo. Para adquirir estas funciones, el AA debe ser transportado activamente al interior de la célula, lo cual es llevado a cabo por transportadores específicos presentes a nivel de membrana celular. En humanos, se han descrito 2 familias distintas de transportadores capaces de transportar la vitamina C. Uno de estos corresponde a los transportadores de hexosas o GLUTs, dentro de los cuales se ha descrito que las isoformas 1, 2, 3,4 y 6 corresponden a transportadores de ácido deshidroascórbico, la forma oxidada de la vitamina C. Por otro lado, se ha descrito la presencia de una familia de transportadores con la capacidad de transportar AA aprovechando la gradiente electroquímica del catión Na+, denominados SVCTs. Dentro de esta familia, se han descrito 2 isoformas funcionales: SVCT1 y SVCT2, las cuales presentan una estructura bastante similar y son específicas para el transporte de ácido ascórbico. Además, para SVCT2, ha sido caracterizada una variante incapaz de transportar AA además, actuando como dominante negativo para SVCT1 y SVCT2. En este trabajo, clonamos y caracterizamos una nueva isoforma, denominada SVCT-1 short (shSVCT1). Nuestra hipótesis de trabajo es que shSVCT1 es capaz de regular la capacidad de transporte de vitamina C actuando como dominante negativo. SVCT1 short fue clonado desde cDNA de Caco-2 y luego subclonado en el vector pEGFP- N1. Al ser expresado en células HEK-293, shSVCT1, mostró una localización principalmente intracelular, siendo incapaz de transportar ácido ascórbico al interior de las células. Experimentos de colocalización, con marcadores específicos de organelos, indicaron que shSVCT1 se encuentra localizado principalmente a nivel de retículo endoplásmico. Realizamos estudios de expresión del mensajero para shSVCT1 por la técnica de PCR, utilizando partidores específicos que pudieran amplificar selectivamente el transportador VII clonado. SVCT1 short se expresa en las líneas celulares HEK 293, de cáncer de próstata DU-145 y cáncer de mama ZR-75. Para evaluar la función de shSVCT1, realizamos estudios de captación de ácido ascórbico y determinamos de los parámetros cinéticos de transporte en presencia o no de la isoforma shSVCT1. Interesantemente, cuando sobre-expresamos shSVCT1 en células que solo expresan de forma endógena el transportador SVCT2, como lo son las células Hek-293, no observamos cambios en los parámetros cinéticos estudiados, sin embargo, cuando sobre-expresamos shSVCT1 en células que expresan normalmente ambos transportadores SVCT1 y SVCT2, como lo son las células COS-7, observamos la disminución selectiva del componente de mayor capacidad de transporte, SVCT1 sin afectar aparentemente la capacidad de transporte para SVCT2. En conclusión hemos podido clonar y caracterizar una nueva isoforma de los transportadores de vitamina C que tiene capacidades regulatorias del transporte de ácido ascórbico. Específicamente, la isoforma shSVCT1 es capaz de interaccionar de forma selectiva y específica con el transportador SVCT1 (y no SVCT2) produciendo una retención del transportador a nivel intracelular y con esto disminuyendo la eficiencia de transporte para SVCT1. Actuando así shSVCT1 como un dominante negativo selectivo para el transportador SVCT1.
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    Determinación de potenciales interacciones de proteínas con la PrPc en la enfermedad de Alzheimer.
    (Universidad de Concepción, 2021) Saavedra Sieyes, Paulina Andrea; Muñoz Montesino, Carola Andrea; Rivas Rocco, Coralia Isabel
    La proteína priónica celular (PrPC), ha sido implicada en la señalización fisiopatológica que lleva a la pérdida sináptica inducida por el péptido -amiloide en el contexto de la enfermedad de Alzheimer. Se ha sugerido que PrPC, el que se ubica en la cara externa de membrana plasmática de neuronas unido a ella por un anclaje GPI, podría actuar como receptor mediador de la toxicidad inducida por el péptido A. Varios estudios muestran que la interacción de PrPC con oligómeros de A activaría una vía de transducción de señales, que debido a la ausencia de dominios transmembrana en PrPC debe ser mediada por una proteína transmembrana no conocida. Una proteína transmembrana interesante de analizar como transductor de señales de PrPC inducidas por oligómeros de A, corresponde a la proteína precursora amiloide (APP). La interacción entre PrPC y APP ha sido sugerida en algunos estudios del interactoma de ambas proteínas. Sin embargo, aún falta evidencia para demostrar su interacción directa, y si esta interacción tiene un carácter funcional. Debido a esto, el presente trabajo propone buscar interacciones entre PrPC y APP en el contexto de la enfermedad de Alzheimer, utilizando aproximaciones bioinformáticas de docking proteína - proteína y ensayos de colocalización y coinmunoprecipitación. Los análisis de docking revelaron cerca de 35 pares de residuos que conformarían los puntos de interacción entre ambas proteínas, los cuales fueron encontrados en diferentes dominios de APP. Hay que destacar el dominio E2 (3NLY) arrojo 12 pares de residuos en interacción con PrPC con excelentes valores energéticos. Además, fueron realizados diferentes ensayos de colocalización los cuales resultaron positivos para PrPC y APP. Todas las coninmunoprecipitaciones resultaron positivas para interacción, pero los controles realizados para APP revelaron la coinmunoprecipitación de un fragmento de 55kDa que podría ser un fragmento previamente reportado. Finalmente, con todos estos resultados nuestro trabajo da lugar a las primeras directrices para determinar la interacción entre ambas proteínas. Toda esta información permitirá el desarrollo de diferentes experimentos a futuro para definir la interacción y para luego analizar las consecuencias funcionales de la interacción PrPC -APP.
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