Browsing by Author "Wong Alvaro, Yat Sen"
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Item Capacidad antifibrótica de las secreciones de las células madre derivadas de tejido adiposo equino en un modelo de endometrosis(Universidad de Concepción, 2024) Wong Alvaro, Yat Sen; Castro Rebolledo, FidelLa endometrosis en yeguas es una enfermedad degenerativa, de gran impacto a nivel productivo. Es una patología multifactorial pero con un común denominador, se presenta en yeguas incapaces de resolver una inflamación post-monta en el endometrio, la cual conlleva a la perpetuación de esta condición y generar un ambiente fibrótico, caracterizado por una excesiva deposición de matriz extracelular, que compromete la arquitectura del tejido y funcionalidad de las glándulas endometriales, lo que a su vez genera un ambiente no favorable para la implantación embrionaria. Diversos tratamientos han sido probados pero con resultados poco favorables, es en este punto donde las terapias regenerativas aparecen como una alternativa. Las células madre presentan una probada actividad regenerativa y además han demostrado también capacidad antifibrótica en otros órganos. Esta acción terapéutica no está basada solo en su interacción directa con el tejido, sino también a partir de una acción paracrina de su secretoma, el cual puede contener diversas moléculas como factores de crecimiento, prostanoides y vesículas extracelulares. A partir de esto, se plantea la siguiente hipótesis: Las secreciones de las células madre derivadas de tejido adiposo equino presentan actividad antifibrótica en un modelo de endometrosis. Para ello, primero se buscó establecer un modelo in vitro de endometrosis en células endometriales estromales, evaluándose el efecto de citoquinas proinflamatorias (IL1-β, IL-6, TNF-α) y TGF-β en células estromales provenientes de diferentes etapas del estro (Folicular y Luteal media). En la fase folicular, las citoquinas en combinación con TGF-β potencian la transcripción de genes relacionados a la fibrosis (CTGF, COL1A1, COL3A1 y TIMP1/MMP9) a partir un aumento de la fosforilación y posterior translocación a nivel nuclear del factor de transcripción SMAD2, aumento de expresión de miARNs profibróticos (mir-17, mir-21 y mir-433) en las células y en las vesículas extracelulares. Por otro lado, en la fase luteal media, se observó un aumento de la síntesis de PGE2 (prostanoide con actividad antifibrótica) y a su vez un aumento de miARNsantifibróticos (mir-26a, mir-29b, mir-29c, mir-145, mir-378 y mir-488), sin observar cambios en la expresión de los miARNs profibróticos. Una vez establecido este modelo in vitro, se procedió a evaluar la actividad antifibrótica de las secreciones de las células madre derivadas de tejido adiposo equino en el modelo de endometrosis anterior. Para ello, se pre-condicionó con TGF-β en 3 tiempos de exposición, 0, 4 y 24 horas. La exposición a TGF-β cambió las propiedades de las células madre, aumentando significativamente su capacidad de migración y favoreciendo la diferenciación a linaje condrocitario. Sin embargo, se observó una disminución de la diferenciación a linaje osteo y adipogénico con respecto al control (0 horas). Por otro lado, se demostró una notoria contracción de las células en la monocapa, así como la formación de nódulos, evidenciando los cambios a nivel de citoesqueleto y síntesis de matriz extracelular. A nivel molecular, 24 horas de exposición propició un aumento significativo de la expresión de los marcadores génicos de miofibroblastos αSMA, COL1A1 y TGF-β. A las 4 horas se observó en menor grado el aumento de marcadores miofibroblasticos y el alza de la expresión de los genes implicados en la síntesis y función de la PGE2, COX2, PTGES y el receptor de la PGE2, EP4. El aumento de secreción de PGE2 en el medio fue confirmado mediante ELISA. Estos hallazgos permitieron establecer una estrategia potencial del uso de secreciones de las células madre como terapia libre de células en la patología fibrótica endometrial. Con los resultados obtenidos se definió un perfil secretor antifibrótico basado en un preacondicionamiento con TGF-β en las MSC, y se procedió a determinar los posibles blancos asociados a la actividad antifibrótica de las secreciones de dichas células derivadas de tejido adiposo equino en el modelo de endometrosis. Para ello, se analizaron los cambios en la expresión de miARNs relacionados con procesos fibróticos en MSC expuestas a diferentes tiempos de preacondicionamiento, la presencia y expresión de tales miARNs en vesículas extracelulares y los efectos de vesículasextracelulares derivadas de MSC pre-condicionadas, en la reversión de la fibrosis en el modelo in vitro. El perfil de expresión de miARNs tanto en las células como en las vesículas extracelulares fue congruente con lo encontrado en el anterior experimento, observándose una regulación a la alza de miARNs antifibróticos a las 4 horas (mir-29c, mir-145 y mir-200) y en contraposición un aumento de miARNs profibróticos a las 24 horas (mir-192,mir-199 y mir-433). Las vesículas extracelulares fueron añadidas por 48 horas al modelo fibrótico estromal y se evaluaron los marcadores génicos relacionados con la fibrosis, observando una baja significativa de los marcadores miofibroblásticos (αSMA, CTGF, COL1A1) en las células tratadas con las vesículas extracelulares derivadas de 4 horas de preacondicionamiento. Los cambios génicos globales fueron analizados mediante secuenciación de nueva generación. Los resultados evidenciaron 1526 genes sobreexpresados con respecto a las células estromales fibróticas. Mediante análisis de ontología génica se pudo evidenciar una prevalencia mayor de genes involucrados en la respuesta celular a interferones tipo I. Este mecanismo ha sido observado como antagonista a la acción de TGF-β ya que estimula directamente al represor del complejo SMAD2/3, SMAD7. Los resultados obtenidos no solo respaldan la acción antifibrótica de las vesículas derivadas del preacondicionamiento de 4 horas, sino que también identifican una diana molecular que podría ser relevante en el tratamiento de la endometrosis y enfermedades relacionadas.