Browsing by Author "Zelada Varas, Diego Stefan"
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Item Estudio de la dinámica de los receptores de acetilcolina y la organización del aparato postsináptico de la unión neuromuscular: regulación por componentes de la vía Wnt.(Universidad de Concepción, 2022) Zelada Varas, Diego Stefan; Henríquez Hohmann, Juan PabloLa sinapsis neuromuscular es la conexión sináptica entre la motoneurona y la fibra muscular. Disfunciones en esta sinapsis se manifiestan debido a patologías asociadas al aparato locomotor o por el daño traumático de la médula espinal y/o de nervios periféricos. De manera importante, los eventos de formación, maduración y estabilización de la unión neuromuscular son regulados por distintas moléculas y vías de señalización. En este contexto, diversas evidencias han relacionado la expresión de ligandos y efectores intracelulares de la vía Wnt con la sinapsis neuromuscular. Aun cuando se conoce poco respecto a la posible participación de los receptores Frizzled (Fzd), se ha descrito que Fzd9 regula la conectividad sináptica en el sistema nervioso central y, además, se localiza en la postsinapsis, característica que también ha sido observada en la unión neuromuscular. De hecho, datos previos en cultivos de miotubos obtenidos en nuestro laboratorio sugieren que Fzd9 altera la organización del aparato postsináptico. Sin embargo, los mecanismos que subyacen a este efecto se desconocen. En esta tesis, mediante ensayos de electroporación in vivo, inmunohistoquímica, aproximaciones bioquímicas, microscopía confocal, microscopía de súper resolución, así como de pulso y caza de subpoblaciones de AChRs in vivo e in vitro, utilizando tanto ratones wild-type como transgénicos sometidos a denervación crónica o parcial, se evaluó la estabilidad y dinámica de los AChRs dentro de los dominios postsinápticos denervados. Nuestros resultados indican que previo al colapso morfológico inducido por la denervación, los AChRs disminuyen su estabilidad, donde su recambio en la placa motora ocurre de manera diferencial. Mas aún, la recuperación en la estabilidad de los AChRs pudo ser restituida por la reinervación del aparato postsináptico. Sin embargo, esta recuperación en la estabilidad de los AChRs fue precedida por un cambio morfológico de los agregados del AChR desde una estructura tipo pretzel a una fragmentada, los que fueron inervados por más de un axón motor. Por otra parte, se analizó la dinámica de los AChRs localizados intracelularmente. Nuestros hallazgos elucidaron que la subpoblación de AChRs intracelulares exhiben un patrón de distribución en forma de anillos en etapas tempranas post-denervación, donde se observó que la distribución en forma de anillos no se relacionó a los mionúcleos o a las células satélite que residen en la vecindad de la unión neuromuscular, sino que se relacionaron directamente con estructuras lisosomales, sugiriendo que son AChRs en vías de degradación. Este cambio en la distribución de los AChRs intracelulares podría ser utilizado como un posible marcador temprano que facilite la identificación de uniones neuromusculares en vías de degeneración. como una potencial intervención farmacológica en el mantenimiento del dominio postsináptico. Además, se determinó que Fzd9 se localiza en los dominios postsinápticos y es requerido para el mantenimiento de la estabilidad de los AChRs. De manera interesante, se observó que Fzd9 está acoplado basalmente a la subunidad Gαo, lo que constituye la primera evidencia de un posible rol de Fzd9 como un receptor acoplado a proteína G (GPCR). Finalmente, se evaluó el rol de litio sobre la estabilidad de los AChRs tanto en sinapsis inervadas como denervadas. Se observó que, por una parte, litio estabiliza a los AChRs en sinapsis inervadas mediante la inhibición en la internalización de los AChRs que pre-existen en la superficie, mientras que en sinapsis denervadas, litio indujo una reducción en la estabilidad los AChRs concomitante a un incremento en la disponibilidad de estos receptores en la superficie de la fibra muscular. En cuanto a los mecanismos celulares, se observó que la denervación generó la pérdida en la localización postsináptica de β-catenina, donde interesantemente, el tratamiento con litio retuvo esta localización sináptica de β-catenina sobre la placa motora denervada, sin alterar sus niveles. En conjunto, la ejecución de este trabajo permite comprender la participación de componentes de la vía Wnt en la unión neuromuscular madura, y además, constituye un aporte en el marco de potenciales estrategias para la regeneración de esta sinapsis después de situaciones patológicas.