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“Estudio fitoquímico de los extractos de Ugni molinae Turcz. (“Murtilla”) y evaluación del efecto protector de sus componentes sobre endotelio vascular humano frente a lipoproteínas de baja densidad oxidada (oxLDL)”
(Universidad de Concepción., 2004) Avello Lorca, Marcia Andrea; Pastene Navarrete, Edgar
La oxidación de lipoproteínas de baja densidad (LDL) es uno de los eventos más importantes en el desarrollo del proceso aterosclerótico, que entre otras alteraciones, afectan la funcionalidad del endotelio. Se ha descrito que la LDL oxidada (oxLDL) tiene efectos deletéreos en la función del endotelio, afectando principalmente la síntesis de óxido nítrico (NO) por la enzima óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) cuyo sustrato es L-arginina, modulando la ruta L-arginina/NO. Compuestos de naturaleza fenólica han demostrado ser eficaces antioxidantes, y su estudio tiene singular importancia en sistemas biológicos sometidos a estrés oxidativo, especialmente en membranas biológicas, por su capacidad de inhibir la peroxidación lipídica y la consecuente modificación oxidativa de las LDL. Estudios realizados en la planta chilena, Ugni molinae Turcz. (“Murtilla”), mostraron la presencia de compuestos fenólicos (taninos hidrolizables, ácidos fenólicos) y capacidad antioxidante en sistemas in vitro. Esta capacidad se puede evidenciar por técnicas como la estabilización de los radicales libres (DPPH), protección frente a la autooxidación de moléculas poliinsaturadas (ácido linoleico), y sobre la modificación oxidativa de LDL por iones Cu+2 . El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto protector de los extractos de Ugni molinae en células vasculares de endotelio fetal humano (HUVECs) frente a la modificación oxidativa de LDL, y sus efectos en el transporte de L-arginina y actividad de eNOS en HUVECs. Se comprobó mediante el estudio bioguiado que Ugni molinae es un potencial agente protector de células vasculares endoteliales frente a procesos oxidativos de LDL.
Determinación de ocratoxina A en plasma humano y su relación con el consumo de alimentos posiblemente contaminados.
(Universidad de Concepción., 2005) Muñoz Sepúlveda, Katherine Andrea; Vega Herrera, Mario
Ochratoxin A is a mycotoxin produced by several Aspergillus species and in less proportion by Penicillium species. The distribution of Ochratoxin A (OTA) in the environmental is widely known. It is possible to find it as contaminant of food like cereals and derivates, wine grapes, meat of pork and chicken and derivates like eggs. Several studies have demonstrated the presence of OTA in human and animal tissues and foods. The carcinogenic properties of OTA have contributed to fix maximum limits allowed for foods and human intake in several countries. In this work OTA production by three toxicogenic species was studied, using wheat as matrix. The result obtained can be used to apply adequate plans of food control to prevent the contamination of food by OTA. In the second part of this work, the presence of OTA in human plasma was determinate and it was compared with food consumption through an alimentary questionnaire. Finally, the comparison between two methodologies for the determination of Ochratoxin A in wheat was done. As part of this comparison some wheat samples were analyzed with the objective to know about the presence of OTA in the Chilean food. In Chile does not exist information about the presence of this mycotoxin in food and human tissue, for this reason, this study should be a first approach to the problem calling for further researches.
Estudio de constantes fisicoquímicas de medicamentos por espectrofotometría derivada.
(Universidad de Concepción., 2005) Vélez Duarte, Dely Karina; Godoy Mosciatti, Carmen Gloria
El diseño de las formulaciones de los medicamentos se basa en gran medida en el conocimiento de sus características fisicoquímicas para producir un medicamento seguro, eficaz y estable. Los azoles son antifúngicos utilizados en el tratamiento de infecciones fúngicas tanto superficiales como sistémicas, problema de salud de gran importancia en pacientes inmunodeprimidos. Las estatinas son un grupo de fármacos que se utilizan en el tratamiento de las dislipidemias porque inhiben la HMG-CoA reductasa, enzima clave en la síntesis de colesterol y que han resultado ser muy efectivas en la disminución de los niveles de colesterol. Se realizó el estudio del coeficiente de partición y la constante de disociación de los azoles y estatinas y la cinética de degradación de lovastatina, simvastatina y atorvastatina por espectrofotometría derivada de segundo orden, información de interés para un laboratorio de producción farmacéutica de la zona. En base a los resultados del coeficiente de partición, es posible observar que las diferencias en la lipofilia de algunos inhibidores del citocromo P-450, se deben a diferencias estructurales en las moléculas. La presencia del anillo imidazol hace que el miconazol y el ketoconazol sean más lipofílicos, log P= 5.00 y 3.70, pKapp= 6.58 y 2.42 - 6.50 respectivamente, y tengan mayor afinidad por la unión a las proteínas plasmáticas. Mientras los anillos triazoles del fluconazol hacen que éste sea menos lipofilico, log P = 1.09, pKapp 2.01, y se una en menor proporción a las proteínas plasmáticas. Esto último constituye una ventaja ya que entre todo los compuestos azólicos, el fluconazol es el que alcanza concentraciones más elevadas en el sistema nervioso central siendo el fármaco de elección en micosis sistémicas. Las tres estatinas son muy lipofílicas a pH fisiológico (pH 7.4), log P lovastatina 1.48, simvastatina 2.05, atorvastatina 1.23, y pKapp lovastatina 5.06, simvastatina 4.45, atorvastatina 5.25, debido a su alta lipofilicidad son más susceptibles al metabolismo oxidativo por el sistema CYP450. La degradación de las estatinas sometidas a diferentes condiciones de estrés, sigue una cinética de seudo primer orden, pH dependiente a pH 1 y 10. Los valores determinados de la constante de velocidad de degradación para las estatinas a diferentes pH y temperatura se encuentran en el intervalo de 1.20 x 106 s -1 a 10.90 x 106 s -1.
Determinación de Nicotina, Cotinina y Cafeína en leche materna de puérperas atendidas en el Hospital “Las Higueras”, Talcahuano, Chile.
(Universidad de Concepción., 2005) Aquino Ramirez, Rainy G.; Barrios Guerra, Carlos A.
La utilización de la leche materna como matriz biológica alternativa para el análisis toxicológico, proporciona información relevante al momento de evaluar el riesgo de exposición del neonato a diversas sustancias químicas. La nicotina, su metabolito, cotinina, y la cafeína, poseen propiedades fisicoquímicas que facilitan el paso de las mismas hacia la leche materna. Se determinaron las concentraciones de nicotina, cotinina y cafeína en leche materna de 48 madres puérperas (mediana, M=28 años) elegidas a través de un muestreo al azar simple. Las muestras se recolectaron en envases estériles por extracción manual. Se obtuvo consentimiento informado y se completó un cuestionario con los datos demográficos de la madre y del neonato, el hábito de fumar e ingesta de bebidas cafeínadas durante el embarazo. La detección y confirmación simultánea de nicotina, cotinina y cafeína se realizó por Cromatografía de Gases/ Espectrometría de Masas, doble columna. La metodología demostró ser exacta, precisa y lineal en el rango estudiado, con un coeficiente de determinación (r2 ) mayor a 0,9990 para nicotina y cotinina y mayor a 0,9970 para la cafeína. Se encontró nicotina en el 19% de los casos (14,7 a 55,2 ng/mL), cotinina en el 4% (10,5 y 136,8 ng/mL) y cafeína en el 25% (9 a 250 ng/mL). La utilización del método analítico permitió demostrar que nicotina y cotinina son biomarcadores que indican que las madres fumaron durante la lactogénesis. También, el detector de masas detectó la presencia de Petidina (n=1), Metronidazol (n=1), Metamizol (n=19) y Aminofenazona (n=19) en las muestras de leche materna evaluadas, lo que permite visualizar a esta metodología como una valiosa herramienta para ampliar el espectro de futuros estudios toxicológicos
Desarrollo de geles a base de quitosano para su aplicación en lesiones cutáneas.
(Universidad de Concepción., 2006) Fernández Escobar, Marcos Mauricio; Plessing Rossel, Carlos von
El objetivo de este trabajo fue formular y preparar geles a base de quitosano con sulfadiazina de plata y estudiar su aplicación en el tratamiento de heridas cutáneas de diversa etiología. Se formularon geles de quitosano de peso molecular bajo (Mv=72.180 g/mol) con un 92% de desacetilación y peso molecular medio (Mv=103.200 g/mol) con un 97% de desacetilación, ambos a una concentración de 4% p/p. Los geles fueron caracterizados por FT-IR, microscopia electrónica de barrido y análisis reológico. Se evaluó la estabilidad física y química de las formulaciones preparadas, a través de un estudio de estabilidad bajo dos condiciones de almacenamiento: 20±3°C y 40°C/75% HR por un periodo de 90 días. Se evaluó la actividad antimicrobiana in vitro de las formulaciones preparadas y la eficacia de los geles para contribuir a la regeneración tisular en heridas provocadas en ratas. En el estudio espectroscópico, ambos geles no presentaron diferencias en sus espectrogramas FT-IR. El estudio reológico arrojó que el gel de quitosano de peso molecular bajo, presentó un flujo pseuplástico, y el quitosano de peso molecular medio un flujo plástico, ambos sin tixotropía. A partir de los geles anteriormente caracterizados se formularon y elaboraron preparados semisólidos a base de quitosano de peso molecular alto y bajo al 4% con y sin sulfadiazina de plata al 1 %. Los semisólidos fueron estables física y químicamente durante un periodo de 90 días cuando se almacenaron a 20± 3°C. Las formulaciones almacenadas a 40°C y 75 % de humedad relativa presentaron estabilidad variable durante los 90 días de almacenamiento. La caracterización reológica reveló que todas las formulaciones estudiadas presentaron un flujo plástico con diferentes grados de tixotropía. Los valores de rendimiento fueron los adecuados para permitir una fácil extracción del preparado desde el envase y evitar su escurrimiento cuando el semisólido es aplicado sobre una superficie. Los geles compuestos por quitosano al 4% y sulfadiazina al 1% presentaron una mayor actividad antibacteriana y antifúngica que el Platsul-A®. La aplicación del gel de quitosano al 4% en heridas cutáneas en ratas provocaron una recuperación más rápida de éstas comparado al gel quitosano al 4%+sulfadiazina de plata y Platsul-A®.
Establecimiento del grado de frescura de jurel (trachurus symmetricus murohyi) congelado en ausencia de valores de referencia.
(Universidad de Concepción., 2006) Aranda Bustos, Mario Antonio; Mendoza Campos, Néstor
Se investigó el deterioro que se produce en la fracción lipídica del jurel entero (Trachurus symmetricus murphyi) durante 120 días de almacenamiento congelado. Su composición química fue determinada a través del análisis proximal y los cambios en la fracción lipídica fue evaluada determinando los ácidos grasos libres, el valor de peroxido, los dienos conjugados y el valor de p-anisidina. También se cuantificó el valor de TVB-N para evaluar la actividad bacteriana durante el almacenamiento congelado. Los resultados indicaron que el jurel es una especie de pez medianamente grasa con un 74 - 78% de agua, entre un 3 y 5% de grasa (cruda) y entre un 20 y 27% (del total de ácidos grasos) de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA). El mayor deterioro sufrido en la fracción grasa durante el almacenamiento congelado fue la rancidez hidrolítica, la cual presentó una relación positiva con el tiempo, con un coeficiente de correlación de 0.96 hasta los 75 días de almacenamiento. La rancidez oxidativa (productos primarios y secundarios) que normalmente se presenta en filetes y trozados de diferentes especies no fue observada en el pescado entero. Los cambios autolíticos fueron los predominantes, puesto que la actividad bacteriana se mantuvo baja durante todo el tiempo de almacenamiento.
Elaboración de nanopartículas de poli (alquilcianoacrilato) C recubiertas con quitosano tiolado para la administración oral de leucin-encefalina.
(Universidad de Concepción., 2007) Campos Requena, Víctor Haroldo; Plessing Rossel, Carlos von
En el presente trabajo se diseñó un sistema transportador para la entrega controlada de Leucina-Encefalina por vía oral, teniendo como base nanopartículas poliméricas de poli (alquilcianoacrilato) cubiertas con Quitosano de diferentes masas moleculares (30.000, 85.000 y 145.000 g.mol-1) elaboradas por polimerización aniónica y radical, obteniéndose nanopartículas en el rango nano de entre 28 y 58 nm de diámetro. Para aumentar la bioadhesión de estas nanopartículas, se elaboraron formulaciones con quitosano tiolado, sintetizado por método de modificación con 2-iminotiolano (reactivo de Traut), cuya evaluación ex vivo mostró un aumento de 5 veces en la bioadhesión de las nanopartículas cuando se disminuye la masa molecular del quitosano utilizado (P<0,025); y aumentó en 6 veces cuando se incrementa el porcentaje de quitosan tiolado agregado a las nanopartículas (P<0,01). Se validó una metodología para encapsular Leucina-Encefalina en estas nanopartículas, y una metodología para determinar de manera directa el porcentaje de encapsulación. Se evaluaron dos formas de encapsulación, alcanzandose entre 25-47% de encapsulación de princio activo, con un porcentaje de recuperación del método por sobre el 94%. Se evaluó además el perfil de liberación in vitro de la Leucina-Encefalina desde las nanopartículas con diferentes formulaciones de quitosano, variando su masa molecular y su porcentaje de quitosan tiolado, obteniéndose controles de liberación de hasta 6 horas. Además se modificó la composición del núcleo polimérico adicionando un segundo polímero, metilmetacrilato, obtiendose un importante “burst effect” en la liberación del fármaco.
Efecto de sueros de pacientes con hipercolesterolemia sobre la biodisponibilidad de óxido nítrico y la producción de especies reactivas del oxígeno en células endoteliales de vena de cordón umbilical humano.
(Universidad de Concepción., 2008) Searle Medina, Andrea Valentina; Aguayo Tapia, Claudio Rodrigo
Las enfermedades cardiovasculares son una patología compleja, que involucra la participación de diferentes componentes tanto celulares como moleculares y factores de riesgo tales como hiperlipidemia, hipertensión y tabaquismo, todo lo cual lleva a una disfunción endotelial. Dentro de estos factores de riesgo, uno de los más prevalentes en nuestra población es la hipercolesterolemia o aumento del colesterol plasmático, condición que se ha demostrado en diversos estudios tanto in vitro como in vivo que produce disfunción endotelial, lo cual se observa como una menor respuesta vasodilatadora en pacientes con altos niveles de LDL. Así también, esta disfunción endotelial se ha relacionado con un aumento en la formación de especies reactivas del oxígeno (ROS), disminución en la expresión de la sintasa del óxido nítrico endotelial (eNOS) y desacoplamiento de la eNOS, cuyo efecto final es un aumento del estres oxidativo, una disminución en la biodisponibilidad de óxido nítrico (NO) y un aumento en el riesgo cardiovascular. Entonces, considerando que la disfunción endotelial esta presente en todas las etapas de la aterosclerosis y en la evolución de la enfermedad cardiovascular, se puede utilizar al endotelio como un marcador pronóstico de riesgo cardiovascular. Basados en estos antecedentes, en el presente estudio se determinó el efecto de oxLDL y sueros de pacientes con hipercolesterolemia, sobre la biodisponibilidad de NO y la producción de ROS en células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs). Nuestros resultados demuestran una menor biodisponibilidad de NO y mayor producción de ROS en células incubadas con oxLDL o sueros de pacientes con hipercolesterolemia en comparación con aquellas expuestas a nLDL o sueros de 8 individuos con niveles normales de colesterol. Además, los niveles de proteínas c reactiva ultrasensible (marcador de inflamación) se correlaciona en forma positiva y significativa con el índice de masa corporal (r = 0.342, p< 0,05), así también una correlación significativa de la capacidad antioxidante con la circunferencia de cintura (r = 0.360, p< 0,05), sin existir diferencias significativas en la capacidad antioxidante o los niveles de proteína c reactiva ultrasensible entre ambos grupos. Estos resultados sugieren que oxLDL y los sueros de pacientes con hipercolesterolemia inducirían disfunción endotelial mediada por un incremento en la producción de las especies del oxígeno y una disminución en la biodisponibilidad de NO que estaría relacionada con los altos niveles de colesterol plasmático, específicamente con altos niveles de lipoproteínas de baja densidad. Finalmante estas evidencias permiten sugerir que el modelo celular de endotelio humano puede ser utilizado como biosensor de riesgo cardiovascular, para evaluar procozmente a una población de riesgo.
Purificación de estrógenos y progesterona de suero equino por cromatografía de inmunoafinidad.
(Universidad de Concepción., 2008) Muñoz Sandoval, Isabel Julia del Carmen; Bustos Araya, Paula
La utilización de estrógenos y progesterona tiene un fuerte impacto en la industria farmacéutica, fundamentalmente en la terapia de sustitución hormonal. Hoy en día los estrógenos que se utilizan en esta terapia son extraídos de la orina de yeguas preñadas y purificados por osmosis reversa. En el caso del progestágeno, el más ampliamente utilizado es la medroxiprogesterona acetato, un progestágeno sintético. Sin embargo, el posible rol carcinogénico de los estrógenos de equino, el sufrimiento de los animales, la falta de materia prima elaborada y comercializada a nivel nacional, y la necesidad de utilizar en la terapia de sustitución hormonal compuestos análogos a las moléculas femeninas endógenas, han apoyado la búsqueda de nuevas técnicas de extracción y purificación hormonal. El objetivo del presente trabajo fue purificar estrógenos y progesterona a partir del suero de yeguas preñadas utilizando anticuerpos policlonales específicos por cromatografía de inmunoafinidad. Anticuerpos policlonales contra 17-estradiol y progesterona fueron producidos en conejos y purificados por cromatografía de inmunoafinidad. Los anticuerpos purificados y específicos para 17-estradiol y progesterona fueron unidos covalentemente a Sefarosa activada. En estas columnas se sembraron sueros de yeguas de 3.5 y 7 meses de preñez para la purificación de progesterona y 17-estradiol, respectivamente, las cuales fueron eluidas con etanol al 40%. La valoración de hormonas esteroidales fue realizada por HPLC reversa. 16 Los resultados demuestran que se obtuvieron anticuerpos específicos y de un título elevado para 17-estradiol y progesterona los cuales permitieron la purificación de hormonas esteroidales desde el suero de yeguas preñadas. A partir de 4 y 2 mL de suero de yegua con 3.5 y 7 meses de gestación, se obtuvo 23 y 135 ng de estrógenos y progesterona de equino, respectivamente. Por lo tanto, los anticuerpos policlonales obtenidos constituyen una herramienta importante para la purificación de hormonas esteroidales y potencialmente para la valoración de éstas a nivel sérico.
Caracterización de anticuerpos monoclonales anti apolipoproteína A-l para el reconocimiento de subpoblaciones de HDL.
(Universidad de Concepción., 2008) Lezana Díaz, Alejandra Marcela; Bustos Araya, Paula
La aterosclerosis es un desorden inflamatorio que conduce al desarrollo de la enfermedad coronaria, la que se caracteriza por una alteración de las lipoproteínas plasmáticas. Las lipoproteínas de alta densidad (HDL) contienen apolipoproteína A-I (apo A-I), clave en el metabolismo del colesterol y responsable del rol antiaterogénico. En este trabajo se caracterizaron anticuerpos monoclonales (AcMos) anti apo A-I utilizando HDL total, HDL2, HDL3, pre-HDL, apo A-I nativa, apo A-I mutadas y péptidos de apo A-I. Los AcMos presentaron igual reactividad con apo A-I y HDL mediante ELISAs competitivos realizados en presencia de Tween-20. Al realizar estos ensayos en ausencia de Tween-20, los AcMos 2B4E9, 7C5E10 y 2C10 reaccionaron con la apo A-I y la HDL, en tanto los AcMos 1C11B7, 8A4 y 8A5 reaccionaron con la apo A-I en HDL y no con la apo A-I libre. La utilización de apo A-I con mutaciones puntuales en el extremo amino-terminal, demostró que los AcMos 2B4E9, 7C5E10, 2C10 y 6B9 reconocían epitopes de esta región. Los AcMos 1C11, 8A4, y 8A5 presentaron una elevada reactividad con líquido folicular humano, que contiene una alta concentración de preB-HDL. Por el contrario, los AcMos 2C10, 6B9 y 8B12G8 presentaron un bajo reconocimiento de las pre-HDL. Mediante la técnica del Biacore, se determinó una Kd (M) promedio de 10-9 para la interacción entre la apo A-I o HDL y los anticuerpos 1C11, 8A4, y 8A5, y de 10-8 para la interacción entre estos anticuerpos y una fracción del líquido folicular. La caracterización de los AcMos permitió la estandarización de dos ELISAs tipo sandwich. El primero desarrollado en presencia de tween-20 para la cuantificación de apo A-I total. El segundo se realizó en ausencia de tween-20 para la cuantificación de apo A-I en HDL. Se determinó apo A-I total y apo A-I en HDL en una muestra de 76 adolescentes obesos agrupados en base a la presencia o ausencia de síndrome metabólico, encontrándose una diferencia significativa tanto en los niveles de apo A-I total como de apo A-I en HDL entre los grupos con y sin SM. Se encontró una correlación altamente significativa entre la determinación de apo A-I por ELISA y la determinación de apo A-I realizada por turbidimetría.
Implementación de tecnología analítica para el análisis y desarrollo de bioetanol desde material lignocelulósico.
(Universidad de Concepción., 2009) Valenzuela Pickrodt, Roberto; Freer Calderón, Juanita
Para que la producción de bioetanol desde material lignocelulósico sea económicamente viable, los costos de producción del proceso deben reducirse significativamente. Los métodos de pretratamiento y la tecnología para generar azúcares fermentables mediante hidrólisis enzimática son etapas fundamentales en la producción de bioetanol y son consideradas barreras económicas para el proceso global. Una alternativa para reducir los costos es utilizar enzimas inmovilizadas con el fin de retener y reciclar, sin pérdida de actividad enzimática, uno de los componentes más caros del proceso de producción de bioetanol. La elección del soporte en el que se inmoviliza la enzima es importante. La síntesis debe ser fácil y económica, pero por sobre todo debe ser fácil de separar de la mezcla de reacción y no debe afectar la actividad y estabilidad de la enzima. En el presente trabajo se estudia el uso de nanopartículas de magnetita como soporte de enzimas. Al ser un óxido de hierro que presenta características magnéticas, su separación desde las mezclas de reacción se puede realizar fácilmente a través de imanes. Dos metodologías diferentes para sintetizar nanopartículas de magnetita fueron estudiadas: la metodología de co-precipitación de los iones Fe2+/Fe3+ en medio básico y por medio de la oxidación de Fe(OH)2 por H2O2. Las nanopartículas sintetizadas por ambos métodos fueron caracterizadas fisicoquímicamente. Por medio de difracción de rayos-X (XRD) se analizó la estructura cristalina. Para confirmar la síntesis de magnetita en vez de meghemita, la cual posee un patrón de difracción de rayos-X idéntico, se utilizó espectroscopía fotoelectrónica de rayos-X (XPS) para examinar la estequiometría Fe:O. La distribución de tamaño, forma y morfología de las nanopartículas de magnetita se determinaron a través de microscopía electrónica de transmisión (TEM). El diámetro hidrodinámico de las muestras dispersadas se determinó por dispersión dinámica de luz (DLS). Las propiedades magnéticas se analizaron utilizando un magnetrónomo superconductor con dispositivo superconductor de interferencia cuántica (SQUID). Mediante el método de co-precipitación de los iones Fe2+/Fe3+ (razón molar 1:2) por adición de amonio bajo agitación mecánica a 10000 rpm, se obtuvieron nanopartículas superparamagnéticas de magnetita con un diámetro promedio de ~ 10 nm. Se encontró que ésta velocidad de agitación es la adecuada para la obtención de nanopartículas con este tamaño promedio. Una disminución en la velocidad de agitación da como resultado mayores tamaños (~19 nm) y distribución de tamaño más amplia. A 18000 rpm, además de magnetita, se sintetiza goetita a la forma de nanopartículas y nanovaras. A mayores velocidades de agitación (25000 rpm), la temperatura del núcleo de la solución aumenta, generando una mezcla de compuestos de hierro sin características magnéticas. Por medio de la metodología de oxidación de Fe(OH)2 por H2O2, se determinó que no sólo se sintetiza nanopartículas de magnetita de distintas formas y tamaño, si no que además cristales de lepidocrocita. Se inmovilizó la enzima b-glucosidasa de Trichoderma reesi sobre nanopartículas de magnetita con diámetro promedio de ~10 nm amino funcionalizadas con 3-aminopropiltrietoxisilano, y utilizando glutaraldehido como agente enlazante. Al ser las nanopartículas silanizadas se produce el aumento del diámetro hidrodinámico, mientras que la saturación magnética disminuye sin perder el superparamagnetismo. La enzima inmovilizada se mantuvo estable por al menos 45 días sin pérdida de actividad enzimática. La b-glucosidasa inmovilizada se utilizó para suplementar a la celulasa en la hidrólisis enzimática de paja de trigo pretratada por explosión por vapor. El porcentaje de hidrólisis tras 72 h fue sólo 8.1 % más bajo que la hidrólisis realizada con celulasa suplementada con b-glucosidasa libre. Aunque el rendimiento es un poco menor, el reciclaje de la enzima inmovilizada permite reducir el costo del proceso de sacarificación de material lignocelulósico. Durante las etapas iniciales de degradación de madera por hongos de pudrición parda se produce la degradación de carbohidratos sin remover lignina. Estos hongos utilizan agentes de degradación de baja masa molar para mediar la producción de radicales ·OH por la reacción de Fenton. Los metales tienen un rol importante en los procesos de degradción no enzimáticos debido a que en esta reacción formas reducidas de metales de transición reducen H2O2 a ·OH. Se realizó un estudio de los efectos de la reacción de Fenton sobre un compuesto modelo de lignina no fenólica y sobre una forma soluble de celulosa para determinar si los hongos de pudrición parda son adecuados para ser utilizados como pretratamiento biológico. Se determinó que la reacción de Fenton cuprosa asistida por el dihidroxibenceno catecol es más lenta y menos eficiente que la reacción de Fenton ferrosa asistida por catecol. La cromatografía líquida de intercambio aniónico con detector de pulso amperométrico (HPAEPAD) permite la separación de D-arabinosa, D-galactosa, D-glucosa, D-xilosa y D-manosa con buena resolución a tavés de la columna de intercambio aniónico CarboPac PA10, utilizando 1% de NaOH 200 mM y 99% de agua de calidad nanopura como fase móvil a flujo constante de 1,0 mL min-1. Esta metodología presenta bajos límites de detección y cuantificación, pero requiere grandes diluciones de las muestras de los hidrolizados del material lignocelulósico para que los carbohidratos de éstas puedan ser cuantificados por esta metodología.
Estudio de genes importantes para el desarrollo embrionario y para la interacción útero-embrión.
(Universidad de Concepción., 2009) Bertín Benavides, Ariana R.; Castro Reboredo, Fidel Ovidio
Una de las industrias en las que se han empleado la ingeniería genética y la biotecnología es la ganadera, en la que uno de los mayores problemas es la alta tasa de pérdida temprana de embriones, porque compromete la eficiencia reproductiva y el mejoramiento genético, lo que resulta en serias pérdidas financieras para los productores. Uno de los motivos que dieron origen a esta tesis, es que normalmente para el estudio de la expresión génica durante el desarrollo temprano en rumiantes se utilizan marcadores moleculares que han sido probados como tal en ratones o humanos, no siendo siempre útiles para rumiantes. Utilizando la metodología de clonación manual, se produjeron embriones bovinos clonados, los cuales fueron transferidos a receptoras homólogas (bovinos) y heterólogas (ovinos y caprinos). Para estudiar la expresión de genes importantes para el desarrollo perimplantatorio de bovinos, tanto en embriones como en endometrios gestantes y no gestantes, se extrajo ARN total, a partir del cual se sintetizó ADN copia, el cual fue utilizado como templado para la PCR. Los blastocitos fueron capaces de continuar con su crecimiento después de ser transferidos dentro del útero bovino, ovino y caprino. La mayoría de los genes estudiados fueron detectados en todos los embriones, independiente del ambiente en el cual se desarrollaron. De igual manera se detecto la presencia de los genes OCT4, EOMES, IFNτ, DICER, IFI6, excepto SOX2, en los endometrios de las especies en estudio. En esta tesis se logró evidenciar que los marcadores moleculares del desarrollo embrionario no son necesariamente útiles en el desarrollo perimplantatorio en bovinos, debido a la detección de genes embrionarios en endometrios de rumiantes; se validó el uso de receptoras heterólogas como fuente de embriones clonados elongados; y además nuestros resultados sugieren la presencia de células madre en el endometrio de rumiantes.
Evaluación de la influencia de derivados de quitosano sobre la permeabilidad intestinal de capreomicina sulfato en modelos in vitro E in vitro.
(Universidad de Concepción., 2009) Torres Vergara, Pablo Miguel; Von Plessing Rossel, Carlos
En el presente trabajo se evaluó la influencia de un derivado semisintético del polímero catiónico Quitosano sobre la permeabilidad intestinal del antibiótico polipeptídico Capreomicina sulfato en modelos in vitro e in vivo. El cloruro de N trimetilquitosano es obtenido por metilación sucesiva del grupo amino libre con yodometano en medio básico, obteniendo un producto que es soluble en un rango de pH más amplio que el polímero original.
Evaluación de la Estabilidad química de prednisona en suspencisón oral.
(Universidad de Concepción., 2009) Müller Ramírez, Claudio Felipe; Godoy Mosciatti, Carmen Gloria
Se desarrolló y validó un método indicador de estabilidad química por cromatografía líquida en fase reversa para la determinación de Prednisona materia prima y en suspensión oral según los requerimientos y normas ICH, USP y FDA; utilizando como fase estacionaria una columna monolítica C-18 Chromolith® (100 x 4.6 mm), fase móvil agua:tetrahidrofurano:metanol 73:23:4 v/v/v a flujo de 1 mL/min, detección ultravioleta a 243 nm y un volumen de inyección de 5 µL, Prednisolona fue empleado como estándar interno.
Implementación de metodologías analíticas y desarrollo de modelos predictivos para la caracterización de componentes estructurales en clones de Eucalyptus globulus.
(Universidad de Concepción., 2009) Norambuena Césped, Marcela; Freer Calderón, Juanita
En Chile, Eucalyptus globulus, es una de las especies forestales más importante utilizada como materia prima para la industria de pulpa y papel y posee un gran mercado de exportación a nivel mundial. Entre sus principales características, destacan su rápido crecimiento, su alta calidad de fibra y pulpa y su fácil adaptación a nuevos terrenos de cultivo. Se han realizado grandes esfuerzos dedicados a la selección y mejoramiento para aumentar la eficiencia de la producción de pulpa y disminuir el consumo de reactivos químicos del pulpaje y blanqueo, logrando seleccionar clones de E. globulus que presenten ganancia significativa en la producción de pulpas. Sin embargo, es bastante limitado el conocimiento de la influencia de las características estructurales y ultraestructurales de los biopolímeros de la madera sobre la habilidad pulpable. Con este objetivo, el presente trabajo esta orientado en determinar el efecto del contenido de carbohidratos, lignina y extraíbles y las características estructurales de la lignina como unidades de tipo siringilo no condensadas, frecuencia de enlaces β-O-4, relación S/G así como también, los grupos hidroxilos fenólicos y alifáticos totales, unidades siringilo y guaiacilo con hidroxilos fenólicos libres, y la relación eritro/treo del la estructura β-O-4 en el rendimiento pulpable, consumo específico y la densidad básica de los distintos genotipos de E. globulus. Con esta finalidad, se implementaron las técnicas analíticas de tioacidólisis y de RMN 31P para evaluar las diferencias estructurales de la lignina y su influencia sobre estos parámetros. Además, se estableció la influencia de las características químicas de la madera sobre las características físico-mecánicas de la madera y pulpa, mediante la evaluación de las respectivas correlaciones lineales y se determinó que características podría ser de interés como parámetro de selección clonal para la producción de pulpa kraft. Dado que los programas de mejoramiento genético requieren del análisis de un gran número de muestras, el desarrollo de modelos predictivos NIR como una herramienta rápida y no destructiva, es de gran utilidad para predecir parámetros que permitan la selección clonal Los principales resultados obtenidos señalaron que, un alto contenido de glucano, un bajo contenido de lignina, un alto contenido de unidades de tipo siringilo unidas por enlaces de tipos de β-O-4, y una alta frecuencia de este tipo de enlaces, son características favorables para la producción de pulpas kraft aumentando su rendimiento y disminuyendo el consumo de materia prima necesaria para su producción. Además, ciertas características de la lignina como la relación eritro/treo, e hidroxilos alifáticos, fenólicos y carboxílicos parecieran no tener una fuerte influencia en el rendimiento pulpable. Además, algunas de las propiedades físicas de la pulpa y papel analizadas, como; índice de tensión, de rasgado, de estallido y opacidad, no presentaron diferencias entre los distintos clones analizados, a pesar de los distintos rendimiento pulpables obtenidos. El desarrollo de los modelos NIR de predicción obtenidos de muestras de tarugos y astillas, otorgaron buenos modelos predictivos para el contenido de glucano, y lignina, mientras que, los modelos de predicción para el contenido de unidades de tipo siringilo no condensada y frecuencia de enlaces β-O-4 en la lignina, no fueron apropiados para predecir un set de muestras externas dado principalmente por la falta de robustez del modelo desarrollado. Adicionalmente, los modelos desarrollados, permitieron también predecir el rendimiento pulpable, consumo específico y densidad básica, en E. globulus con una alta precisión. La predicción de estas propiedades presenta una gran ventaja, sobre todo para la selección clonal, considerando que puede ser aplicado para muestras de tarugo obtenidas de árboles a temprana edad, pudiendo estimar su futuro comportamiento.
Efecto de los ácidos biliares sobre la regulación del metabolismo de L-Arginina/Óxido Nítrico en células endoteliales de cordón umbilical humano.
(Universidad de Concepción., 2009) Contreras Moraga, Héctor Antonio; Durán Sandoval, Daniel Andrés
Los ácidos biliares (ABs) son los productos finales del etabolismo del colesterol, mediante el cual éste, luego de su utilización, es eliminado del organismo como un componente principal de la bilis. Observaciones clínicas recientes demuestran que los ABs son capaces de modular el tono vascular a través de mecanismos no bien descritos, pero que sugieren su participación tanto en la actividad de algunas enzimas como en el metabolismo del sustrato, necesarias para la producción de sustancias vasoactivas. Entre estas sustancias destaca el óxido nítrico (NO), gas derivado de las células endoteliales. El NO es sintetizado por la enzima Óxido Nítrico Sintasa endotelial (eNOS) cuya actividad es regulada, entre otras, por la presencia de cofactores y la disponibilidad de su sustrato L-Arginina. La L-arginina es un aminoácido semi-esencial transportado a través de la membrana plasmática por sistemas de transporte activo entre los que se incluye hCAT-1. El NO producido por el endotelio es capaz de difundir hacia las células musculares lisas en el vaso sanguíneo, donde actúa como segundo mensajero activando una cascada de fosforilaciones y proteínas kinasas cuyo resultado final es el aumento del diámetro del vaso sanguíneo y la relajación de éste. Además, la L-Arginina puede ser metabolizada a L-Ornitina y urea por acción de las Arginasas, postulando que la co-expresión de estas enzimas alterarían la actividad de eNOS al competir por su sustrato común L-arginina. 8 De esta manera los ABs, además de cumplir su rol primordial en metabolismo del colesterol, podrían participar en la regulación del tono vascular. Así, el objetivo la presente tesis es evaluar el efecto de los ácidos biliares epímeros Quenodeoxicólico (CDCA) y Ursodeoxicólico (UDCA) sobre los mecanismos moleculares que la regulan el metabolismo de L-Arginina necesaria para la síntesis de NO en células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC). Nuestros estudios realizados en HUVEC, demuestran que sólo CDCA por 12 horas es capaz de aumentar la síntesis de NO en una respuesta dependiente de concentración, mientras de UDCA no ejerce efecto alguno. El aumento de la síntesis de NO por CDCA se correlaciona con un incremento en la expresión de eNOS y una mayor fosforilación del residuo Serina 1177 (Ser1177) relacionada con la actividad en el dominio reductasa. Además, los resultados demuestran que CDCA no modifica el transporte endotelial de L-arginina, mientras que UDCA lo disminuye, sugiriendo una regulación del transportador CAT-1. Por otra parte, demostramos que CDCA y UDCA son capaces de aumentar la síntesis de urea en HUVEC sin modificar la expresión ni la actividad de ARG2. Estos resultados confirman que CDCA, pero no UDCA, regula la síntesis endotelial de NO sugiriendo un mecanismo asociado a sus características fisicoquímicas. Además observamos que este AB regula directamente la actividad eNOS en un modelo de células endoteliales. Por otro lado, tanto CDCA como UDCA aumentan la síntesis endotelial de urea, efecto que no se relacionaría con la síntesis de NO. Finalmente, por primera vez hemos demostrado que sólo UDCA es capaz de 9 regular la disponibilidad de L-arginina, efecto relacionado con los niveles de transcripción del transportador hCAT-1. Estas observaciones podrían estar a la base de la hipotensión asociada a hipercolanemia en hepatopatías congestivas como la colestasia intrahepática del embarazo.
Estudio de prevalencia de ocratoxina A en vinos chilenos importancia toxicológica de los niveles detectados.
(Universidad de Concepción., 2009) Alvarado Villarroel, Maritza Eliana; Vega Herrera, Mario
El objetivo de este trabajo fue optimizar y validar un método por cromatografía liquida para cuantificar selectivamente Ocratoxina A en vinos previamente purificados con columnas C18. Las condiciones cromatográficas optimas fueron definidas utilizando un diseño central compuesto para tres factores relevantes: porcentaje de acetonitrilo en la fase móvil, flujo y temperatura de la columna. Las respuestas de 16 experimentos realizados se ajustan a un modelo polinomial de segundo orden, el cual se utilizo para predecir las condiciones optimas: fase móvil compuesta por acetonitrilo: agua: ácido acético (59.5:39.5:1.0 v/v/v), flujo de 1.2 ml min-1 y temperatura de columna de 30 ‹C. Con estas condiciones, se logro la efectiva separación y cuantificación de la micotoxina en menos de 5 minutos, usando una columna C18 YMC-Pack ODS-A (150 x 4.6 mm, S-5 ƒÊm) y detección por fluorescencia a las longitudes de onda de excitación y emisión de 333 nm 460 nm, respectivamente. La validación se realizo de acuerdo a la ICH guidelines. La calibración se ajusto a un modelo de regresión lineal en un rango 0.5 a 50 ng ml-1 con un coeficiente de determinación (R2) de 0.9992. La repetibilidad (desviación estándar relativa, RSD) y la precisión intermedia en matriz arrojaron valores de 1.3% (n=6) y 0.8% (n=3) respectivamente. Los limites de detección y cuantificación fueron 0.03 y 0.1 ng ml-1, respectivamente. Los estudios de recuperación en muestras sobrecargadas a cinco niveles de concentración se encontraron en el rango de 87.2 a 118.9% con un promedio de RSD de 7.4%. Adicionalmente, la exactitud también fue evaluada por comparación de metodologías. Los resultados obtenidos con el presente método fueron estadísticamente no diferentes (F-test, t-test) a los obtenidos con el método oficial de la Organización Internacional del Vino y la Vina (OIV). Por lo tanto, la metodología aquí propuesta es altamente útil y representa una buena alternativa para la determinación de ocratoxina A en vino bajo el límite máximo. residual.
Estudio de estabilidad Química de Ascorbil-2-Monofosfato en alimentos extruidos para Salmonideos por Cromatografía líquida de alta eficiencia con optimización Cromatográfica vía diseño experimental.
(Universidad de Concepción., 2009) Carrillo Rojas, Daniela Olivia; Aranda Bustos, Mario Antonio
A pesar de la crisis actual, la industria acuicultora Chilena se ha convertido en una de las más importantes del mundo con US$ 2475 millones de exportaciones durante el 2008, lo cual representa más del 50% de las exportaciones pesqueras Chilenas. Para lograr aumentar o mantener la producción se deben controlar cada uno de los aspectos relevantes, entre ellos, una dieta adecuada es uno de los factores más críticos para lograr un crecimiento saludable del salmón. La vitamina C es un nutriente indispensable para mantener los procesos fisiológicos de los distintos animales incluyendo los peces. La mayoría de los animales acuáticos incluyendo los crustáceos son sumamente sensibles a la deficiencia de vitamina C, lo cual genera escoliosis, lordosis, hemorragia interna y despigmentación. El ácido L-ascórbico ha sido la fuente tradicional de vitamina C utilizada en alimentos para peces, pero debido a su inestabilidad, la mayoría se pierde durante el procesamiento y el almacenaje. Se han utilizado derivados más estables como el ascorbil-2- monofosfato. El objetivo de este trabajo fue evaluar la estabilidad química de ascorbil-2-monofosfato en alimento extruído para peces bajo diferentes condiciones de almacenamiento. Para ello fue desarrollado, optimizado y validado, un método para la determinación de ascorbil-2-monofosfato en alimento extruído para peces. El analito fue extraído por agitación con 100 mL de ácido orto-fosfórico al 5% v/v, la mezcla fue centrifugada para luego ser inyectada directamente en el sistema cromatográfico. El análisis se realizó en fase reversa con una fase móvil compuesta por una solución acuosa de KH2PO4 ajustado a pH 2.6, octilamina (0.045% v/v): acetonitrilo (94:6 v/v), a un flujo de 0.7 mL min-1 . La detección se realizó en el rango ultravioleta a 254 nm. El proceso de optimización se llevó a cabo mediante el uso de un diseño experimental central compuesto evaluando tres factores: flujo, pH y porcentaje de acetonitrilo en la fase móvil. Mediante 16 experimentos se lograron obtener los valores óptimos para cada una de estas variables, los cuales fueron: flujo de 0.7 mL/min, 6% v/v de acetonitrilo y pH 2.6, de ellos el flujo fue el único factor que presentó una influencia estadísticamente significativa (p=0.01).
Estudio de la variabilidad del contenido de aminas biógenas en vinos chilenos de acuerdo a cepaje y denominación de origen.
(Universidad de Concepción., 2009) Pineda Lallemand, Ángela Simone; Aranda Bustos, Mario Antonio
Las aminas biógenas (BA) son compuestos orgánicos nitrogenados de bajo peso molecular sintetizadas naturalmente por animales, plantas y microorganismos (2). En los alimentos y bebidas son principalmente producidos por decarboxilación microbiana de aminoácidos libres, y su presencia, especialmente de histamina, es un indicador de descomposición en los alimentos.
Caracterización del mecanismo de defensa de estrés oxidativo en células endoteliales humanas expuestas al efecto del humo del tabaco.
(Universidad de Concepción., 2010) Salgado Mejías, Perla Katharinna Stephannia; Rivas Rocco, Coralia
El endotelio humano está constantemente expuesto a oxidantes intra y extracelulares, como los presentes en el humo de tabaco, ante los que se encuentra protegido por la acción de moléculas antioxidantes, tanto enzimáticas como no enzimáticas, de las cuales la vitamina C y el glutatión constituyen los componentes no enzimáticos más importantes. La vitamina C debe ser adquirida desde la dieta y es transportada al interior de la célula tanto en su forma reducida (ácido ascórbico) como en su forma oxidada (ácido deshidroascórbico), siendo acumulada intracelularmente como ácido ascórbico, alcanzando concentraciones de 0,1 - 5 mM. A diferencia de la vitamina C, el tripéptido glutatión (GSH, γ-glutamil-cistein-glicina) es sintetizado por todas las células, alcanzando concentraciones intracelulares de 0,5 a 10 mM, teniendo un papel fundamental en los procesos de detoxificación celular. Resultados iniciales obtenidos en nuestro laboratorio indican que el glutatión, y no la vitamina C, sería el antioxidante celular que determina la capacidad de células endoteliales humanas para sobrevivir al estrés oxidativo inducido por exposición a los compuestos tóxicos solubles presentes en el humo del tabaco. Tanto el contenido inicial de glutatión como la capacidad de las células para sintetizar el tripéptido de novo parecen ser fundamentales para una respuesta antioxidante efectiva. De acuerdo a lo anterior, en este proyecto proponemos que es posible aumentar la resistencia de células endoteliales humanas al efecto tóxico de los componentes solubles del humo del tabaco, modificando farmacológicamente el contenido y la síntesis de glutatión celular, en forma independiente del contenido de vitamina C. Para ello, estudiamos el efecto de la exposición de células endoteliales ECV-304 a medio de cultivo condicionado con humo de cigarro, en la presencia o en la ausencia del inhibidor de la síntesis de glutatión L-butionina-(S,R)-sulfoximina (BSO), del precursor de la síntesis de glutatión N-acetilcisteína, o de ácido ascórbico. Los objetivos desarrollados en este trabajo de tesis fueron: i) Establecer las condiciones experimentales para modificar en forma controlada y selectiva el contenido de glutatión de células endoteliales humanas. ii) Establecer el papel del contenido inicial de glutatión en la resistencia de las células ECV-304 al efecto tóxico de los componentes XI solubles del humo del cigarro. iii) Establecer el papel de la síntesis de novo de glutatión en la resistencia de las células ECV-304 al efecto tóxico de los componentes solubles del humo del cigarro. iv) Establecer que el contenido de vitamina C no altera el efecto de la modificación farmacológica del contenido y la síntesis del glutatión celular sobre la resistencia de las células endoteliales humanas al efecto tóxico de los componentes solubles del humo del cigarro. Aunque células endoteliales ECV-304 conteniendo glutatión sobreviven una exposición aguda y prolongada al humo del cigarro, células tratadas con BSO carentes de glutatión intracelular mueren rápidamente antes de completadas las 48 horas de cultivo. El tratamiento de las células endoteliales con N-acetilcisteína provocó un aumento del glutatión intracelular por un mecanismo que involucra la síntesis de novo de glutatión intracelular, ejerciendo un potente efecto protector contra el daño oxidativo producido por el humo del cigarro. En contraste, la vitamina C no tiene efecto protector del daño producido por estrés oxidativo inducido por el humo del cigarro en las células endoteliales ECV-304. Nuestros resultados demuestran que es posible aumentar la resistencia de células endoteliales humanas al efecto tóxico de los componentes solubles del humo del tabaco, modificando farmacológicamente el contenido y la síntesis de glutatión celular, en forma independiente del contenido de vitamina C.

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