Development of predictive methods based on VIS–NIR spectroscopy and artificial vision techniques for the detection of water stress in Eucalyptus spp. and a study of their recovery.
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Date
2026
Authors
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Publisher
Universidad de Concepción
Abstract
Water deficit is a major constraint on the productivity, establishment, and adaptability of Eucalyptus plantations, creating a need for rapid and non-destructive analytical tools capable of detecting plant responses before severe visible damage occurs. The main objective of this Ph.D. thesis was to develop and evaluate spectral methodologies based on visible–near infrared hyperspectral imaging (VIS–NIR HSI) and portable near-infrared spectroscopy, combined with chemometrics, machine learning, physiological measurements, recovery assessment, and candidate gene-expression analysis, for monitoring water-deficit responses in juvenile Eucalyptus plants.
Two sequential controlled-environment assays were conducted. An initial assay involving four genotypes was used to evaluate the feasibility of VIS–NIR HSI for differentiating mild, moderate, and severe water-deficit conditions and to compare full-spectrum information with conventional vegetation indices. A second, expanded assay involving six genotypes integrated VIS–NIR HSI, portable NIR spectroscopy, physiological measurements, gene-expression analysis, and post-stress monitoring after rewatering. Principal component analysis was used to explore spectral structure, whereas ANOVA–simultaneous component analysis (ASCA) was applied to partition spectral variability associated with genotype, sampling day, treatment condition, biological replicate, and their interactions. Supervised classification models were evaluated for binary discrimination between control and pooled water-deficit samples and for multiclass discrimination among the control condition and three progressive water-deficit stages. Partial least squares-discriminant analysis, support vector machines, k-nearest neighbors, Random Forest, Extreme Gradient Boosting, and multivariate regression methods were evaluated within the analytical workflow.
VIS–NIR HSI detected spectral changes associated with progressive water deficit more effectively than the evaluated vegetation indices. In the initial assay, supervised models based on mean spectra achieved external-validation errors between 0 and 2%, while support vector machine classification generated the most consistent spatial reconstructions of stress progression. In the expanded assay, binary discrimination between control and water-deficit samples was effective for both spectral platforms, whereas direct classification of the control condition and the three progressive water-deficit stages was less accurate because adjacent stress stages showed substantial spectral overlap. ASCA demonstrated that VIS–NIR HSI variability was dominated by genotype, which explained 30.2% of the spectral variance, whereas portable NIR variability was primarily associated with sampling day and treatment condition, explaining 40.2% and 10.6%, respectively. An ASCA-guided hierarchical HSI workflow achieved complete correct classification in the evaluated external-validation set, while portable NIR provided a more moderate but interpretable classification of water-deficit progression.
Physiological measurements confirmed coordinated reductions in net CO₂ assimilation, stomatal conductance, photosystem II performance, and plant water status. Recovery after rewatering was incomplete and strongly genotype dependent, with the six evaluated genotypes showing contrasting degrees of restoration of water status and physiological function during the monitored recovery period. Water deficit induced DHN1, LEA4, and TRDX expression in genotype-dependent patterns, although high transcript accumulation did not necessarily indicate greater physiological tolerance. VIS–NIR HSI showed its strongest association with non-photochemical quenching, whereas portable NIR spectroscopy showed the clearest relationship with plant water potential.
Overall, the results demonstrate that VIS–NIR HSI and portable NIR spectroscopy provide complementary, biologically meaningful information for non-destructive water-deficit monitoring in Eucalyptus. The proposed design-aware analytical framework supports controlled-environment phenotyping and genotype screening, although independent validation across new genotypes, experimental campaigns, nurseries, and field-like environments is required before operational implementation.
El déficit hídrico constituye una de las principales limitaciones para la productividad, el establecimiento y la adaptabilidad de las plantaciones de Eucalyptus, lo que genera la necesidad de disponer de herramientas analíticas rápidas y no destructivas capaces de detectar las respuestas de las plantas antes de que se produzcan daños visibles severos. El objetivo principal de esta tesis doctoral fue desarrollar y evaluar metodologías espectrales basadas en imágenes hiperespectrales en el visible–infrarrojo cercano (VIS–NIR HSI) y espectroscopía portátil en el infrarrojo cercano, combinadas con quimiometría, aprendizaje automático, mediciones fisiológicas, evaluación de la recuperación y análisis de expresión de genes candidatos, para monitorear las respuestas al déficit hídrico en plantas juveniles de Eucalyptus. Se realizaron dos ensayos secuenciales bajo condiciones ambientales controladas. Un ensayo inicial, que incluyó cuatro genotipos, se utilizó para evaluar la viabilidad de VIS–NIR HSI en la diferenciación de condiciones de déficit hídrico leve, moderado y severo, y para comparar la información del espectro completo con índices de vegetación convencionales. Un segundo ensayo ampliado, que incluyó seis genotipos, integró VIS–NIR HSI, espectroscopía NIR portátil, mediciones fisiológicas, análisis de expresión génica y seguimiento posterior al estrés después del restablecimiento del riego. El análisis de componentes principales se utilizó para explorar la estructura espectral, mientras que el análisis ANOVA–componentes simultáneos (ASCA) se aplicó para particionar la variabilidad espectral asociada con el genotipo, el día de muestreo, la condición de tratamiento, la réplica biológica y sus interacciones. Los modelos de clasificación supervisada se evaluaron mediante una estrategia binaria, destinada a discriminar entre muestras control y muestras sometidas a déficit hídrico agrupadas, y una estrategia multiclase, destinada a discriminar entre la condición control y tres etapas progresivas de déficit hídrico. Dentro del flujo analítico se evaluaron análisis discriminante por mínimos cuadrados parciales, máquinas de vectores de soporte, k-vecinos más cercanos, Random Forest, Extreme Gradient Boosting y métodos de regresión multivariante. VIS–NIR HSI detectó los cambios espectrales asociados con la progresión del déficit hídrico de manera más efectiva que los índices de vegetación evaluados. En el ensayo inicial, los modelos supervisados basados en espectros medios alcanzaron errores de validación externa entre 0 y 2%, mientras que la clasificación mediante máquinas de vectores de soporte generó las reconstrucciones espaciales más consistentes de la progresión del estrés. En el ensayo ampliado, la discriminación binaria entre muestras control y sometidas a déficit hídrico fue efectiva para ambas plataformas espectrales, mientras que la clasificación directa de la condición control y las tres etapas progresivas de déficit hídrico presentó una menor exactitud debido al considerable solapamiento espectral entre etapas de estrés adyacentes. ASCA demostró que la variabilidad de VIS–NIR HSI estuvo dominada por el genotipo, que explicó el 30,2% de la varianza espectral, mientras que la variabilidad de NIR portátil estuvo asociada principalmente con el día de muestreo y la condición de tratamiento, que explicaron el 40,2% y el 10,6%, respectivamente. Un flujo de clasificación jerárquica mediante HSI guiado por ASCA alcanzó una clasificación completamente correcta en el conjunto de validación externa evaluado, mientras que NIR portátil proporcionó una clasificación más moderada, pero interpretable, de la progresión del déficit hídrico. Las mediciones fisiológicas confirmaron reducciones coordinadas en la asimilación neta de CO₂, la conductancia estomática, el desempeño del fotosistema II y el estado hídrico de las plantas. La recuperación después del restablecimiento del riego fue incompleta y fuertemente dependiente del genotipo, y los seis genotipos evaluados mostraron distintos grados de restauración del estado hídrico y de la función fisiológica durante el periodo de recuperación monitoreado. El déficit hídrico indujo la expresión de DHN1, LEA4 y TRDX siguiendo patrones dependientes del genotipo, aunque una elevada acumulación de transcritos no necesariamente indicó una mayor tolerancia fisiológica. VIS–NIR HSI mostró su asociación más fuerte con la disipación no fotoquímica, mientras que la espectroscopía NIR portátil presentó la relación más clara con el potencial hídrico de las plantas. En conjunto, los resultados demuestran que VIS–NIR HSI y la espectroscopía NIR portátil proporcionan información complementaria y biológicamente significativa para el monitoreo no destructivo del déficit hídrico en Eucalyptus. El marco analítico propuesto, que considera explícitamente el diseño experimental, constituye una herramienta de apoyo para el fenotipado en condiciones controladas y la evaluación de genotipos, aunque se requiere validación independiente en nuevos genotipos, campañas experimentales, viveros y condiciones más cercanas a campo antes de su implementación operativa.
El déficit hídrico constituye una de las principales limitaciones para la productividad, el establecimiento y la adaptabilidad de las plantaciones de Eucalyptus, lo que genera la necesidad de disponer de herramientas analíticas rápidas y no destructivas capaces de detectar las respuestas de las plantas antes de que se produzcan daños visibles severos. El objetivo principal de esta tesis doctoral fue desarrollar y evaluar metodologías espectrales basadas en imágenes hiperespectrales en el visible–infrarrojo cercano (VIS–NIR HSI) y espectroscopía portátil en el infrarrojo cercano, combinadas con quimiometría, aprendizaje automático, mediciones fisiológicas, evaluación de la recuperación y análisis de expresión de genes candidatos, para monitorear las respuestas al déficit hídrico en plantas juveniles de Eucalyptus. Se realizaron dos ensayos secuenciales bajo condiciones ambientales controladas. Un ensayo inicial, que incluyó cuatro genotipos, se utilizó para evaluar la viabilidad de VIS–NIR HSI en la diferenciación de condiciones de déficit hídrico leve, moderado y severo, y para comparar la información del espectro completo con índices de vegetación convencionales. Un segundo ensayo ampliado, que incluyó seis genotipos, integró VIS–NIR HSI, espectroscopía NIR portátil, mediciones fisiológicas, análisis de expresión génica y seguimiento posterior al estrés después del restablecimiento del riego. El análisis de componentes principales se utilizó para explorar la estructura espectral, mientras que el análisis ANOVA–componentes simultáneos (ASCA) se aplicó para particionar la variabilidad espectral asociada con el genotipo, el día de muestreo, la condición de tratamiento, la réplica biológica y sus interacciones. Los modelos de clasificación supervisada se evaluaron mediante una estrategia binaria, destinada a discriminar entre muestras control y muestras sometidas a déficit hídrico agrupadas, y una estrategia multiclase, destinada a discriminar entre la condición control y tres etapas progresivas de déficit hídrico. Dentro del flujo analítico se evaluaron análisis discriminante por mínimos cuadrados parciales, máquinas de vectores de soporte, k-vecinos más cercanos, Random Forest, Extreme Gradient Boosting y métodos de regresión multivariante. VIS–NIR HSI detectó los cambios espectrales asociados con la progresión del déficit hídrico de manera más efectiva que los índices de vegetación evaluados. En el ensayo inicial, los modelos supervisados basados en espectros medios alcanzaron errores de validación externa entre 0 y 2%, mientras que la clasificación mediante máquinas de vectores de soporte generó las reconstrucciones espaciales más consistentes de la progresión del estrés. En el ensayo ampliado, la discriminación binaria entre muestras control y sometidas a déficit hídrico fue efectiva para ambas plataformas espectrales, mientras que la clasificación directa de la condición control y las tres etapas progresivas de déficit hídrico presentó una menor exactitud debido al considerable solapamiento espectral entre etapas de estrés adyacentes. ASCA demostró que la variabilidad de VIS–NIR HSI estuvo dominada por el genotipo, que explicó el 30,2% de la varianza espectral, mientras que la variabilidad de NIR portátil estuvo asociada principalmente con el día de muestreo y la condición de tratamiento, que explicaron el 40,2% y el 10,6%, respectivamente. Un flujo de clasificación jerárquica mediante HSI guiado por ASCA alcanzó una clasificación completamente correcta en el conjunto de validación externa evaluado, mientras que NIR portátil proporcionó una clasificación más moderada, pero interpretable, de la progresión del déficit hídrico. Las mediciones fisiológicas confirmaron reducciones coordinadas en la asimilación neta de CO₂, la conductancia estomática, el desempeño del fotosistema II y el estado hídrico de las plantas. La recuperación después del restablecimiento del riego fue incompleta y fuertemente dependiente del genotipo, y los seis genotipos evaluados mostraron distintos grados de restauración del estado hídrico y de la función fisiológica durante el periodo de recuperación monitoreado. El déficit hídrico indujo la expresión de DHN1, LEA4 y TRDX siguiendo patrones dependientes del genotipo, aunque una elevada acumulación de transcritos no necesariamente indicó una mayor tolerancia fisiológica. VIS–NIR HSI mostró su asociación más fuerte con la disipación no fotoquímica, mientras que la espectroscopía NIR portátil presentó la relación más clara con el potencial hídrico de las plantas. En conjunto, los resultados demuestran que VIS–NIR HSI y la espectroscopía NIR portátil proporcionan información complementaria y biológicamente significativa para el monitoreo no destructivo del déficit hídrico en Eucalyptus. El marco analítico propuesto, que considera explícitamente el diseño experimental, constituye una herramienta de apoyo para el fenotipado en condiciones controladas y la evaluación de genotipos, aunque se requiere validación independiente en nuevos genotipos, campañas experimentales, viveros y condiciones más cercanas a campo antes de su implementación operativa.
Description
Tesis presentada para optar al grado de Doctor/a en Ciencias y Tecnología Analítica.
Keywords
Eucalyptus Breeding, Drought, Spectroscopy, Machine learning