Tesis Doctorado

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Caracterización química localizada de pulpas lignocelulósicas mediante técnicas microscópicas y análisis multivariado aplicado a imágenes
(Universidad de Concepción., 2017) Araya Quintana, Juan Andrés; Castillo Felices, Rosario; Freer Calderón, Juanita
El rendimiento en el proceso de obtención de etanol mediante sacarificación y fermentación de material lignocelulósico, depende en gran medida de la interacción de las enzimas con la fibra de celulosa, donde la presencia de lignina y hemicelulosas suponen una barrera para la accesibilidad enzimática, fenómeno conocido como recalcitrancia. La mayoría de los métodos analíticos existentes estudian la composición química de la madera a través de técnicas destructivas. Para estudiar más de cerca el fenómeno de la recalcitrancia es necesario desarrollar una estrategia que permita el análisis cualitativo y cuantitativo en la superficie misma de la fibra lignocelulósica. La visualización de la distribución espacial de los principales componentes químicos presentes en la fibra es posible mediante obtención de imágenes espectrales a través de micro-espectroscopía FT-IR, donde se obtiene un espectro infrarrojo desde cada píxel de la imagen microscópica. Debido a la gran cantidad de datos obtenidos desde una imagen espectral, es útil la utilización de diferentes técnicas de análisis multivariado, a fin extraer matemáticamente la información relevante que permita la separación e identificación de los diferentes componentes de la matriz. En este trabajo se analizaron por FT-IR de imágenes fibras pre-tratadas de material lignocelulósico. Las imágenes espectrales obtenidas fueron sometidas a análisis de componentes principales (PCA), resolución multivariada de curvas con mínimos cuadrados alternantes (MCR-ALS) y regresión por mínimos cuadrados parciales (PLS). La reconstrucción quimiométrica de las imágenes espectrales obtenidas permitió identificar in situ los diferentes compuestos químicos presentes en la fibra, así como describir su distribución. Además, se desarrollaron diferentes estrategias para análisis cuantitativo en imágenes espectrales, permitiendo cuantificar glucanos, lignina y hemicelulosa directamente desde la superficie de la fibra. Se aplicaron otras técnicas microscópicas, como microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía laser confocal (CLSM) como métodos complementarios para el estudio de la ultraestructura de la fibra lignocelulósica. CLSM permitió la obtención de imágenes espectrales usando el espectro de emisión de compuestos auto-fluorescentes presentes en la madera. Mediante esta técnica fue posible identificar lignina y celulosa en la pared celular de fibras pre-tratadas y describir los patrones de distribución sin necesidad de métodos de marcaje molecular. Con las estrategias analíticas desarrolladas se observó que diferentes pre-tratamientos producen diferentes patrones de relocalización de lignina y que no es necesariamente el contenido total de lignina lo que afecta la accesibilidad enzimática, sino que la distribución en que ésta se encuentra en la pared celular. La plataforma analítica desarrollada permite el estudio químico micro-localizado, selectivo y no destructivo para matrices reales complejas y de estructura irregular, lo que proporcionaría una herramienta avanzada para el estudio del fenómeno de recalcitrancia. Este tipo de análisis tendría una aplicación transversal en el estudio de ambientes químicos en matrices microscópicas, por lo que su proyección en otras áreas del conocimiento constituye otra ventaja relativa a su desarrollo.
Implementación de metodologías analíticas y desarrollo de modelos predictivos para la caracterización de componentes estructurales en clones de Eucalyptus globulus.
(Universidad de Concepción., 2009) Norambuena Césped, Marcela; Freer Calderón, Juanita
En Chile, Eucalyptus globulus, es una de las especies forestales más importante utilizada como materia prima para la industria de pulpa y papel y posee un gran mercado de exportación a nivel mundial. Entre sus principales características, destacan su rápido crecimiento, su alta calidad de fibra y pulpa y su fácil adaptación a nuevos terrenos de cultivo. Se han realizado grandes esfuerzos dedicados a la selección y mejoramiento para aumentar la eficiencia de la producción de pulpa y disminuir el consumo de reactivos químicos del pulpaje y blanqueo, logrando seleccionar clones de E. globulus que presenten ganancia significativa en la producción de pulpas. Sin embargo, es bastante limitado el conocimiento de la influencia de las características estructurales y ultraestructurales de los biopolímeros de la madera sobre la habilidad pulpable. Con este objetivo, el presente trabajo esta orientado en determinar el efecto del contenido de carbohidratos, lignina y extraíbles y las características estructurales de la lignina como unidades de tipo siringilo no condensadas, frecuencia de enlaces β-O-4, relación S/G así como también, los grupos hidroxilos fenólicos y alifáticos totales, unidades siringilo y guaiacilo con hidroxilos fenólicos libres, y la relación eritro/treo del la estructura β-O-4 en el rendimiento pulpable, consumo específico y la densidad básica de los distintos genotipos de E. globulus. Con esta finalidad, se implementaron las técnicas analíticas de tioacidólisis y de RMN 31P para evaluar las diferencias estructurales de la lignina y su influencia sobre estos parámetros. Además, se estableció la influencia de las características químicas de la madera sobre las características físico-mecánicas de la madera y pulpa, mediante la evaluación de las respectivas correlaciones lineales y se determinó que características podría ser de interés como parámetro de selección clonal para la producción de pulpa kraft. Dado que los programas de mejoramiento genético requieren del análisis de un gran número de muestras, el desarrollo de modelos predictivos NIR como una herramienta rápida y no destructiva, es de gran utilidad para predecir parámetros que permitan la selección clonal Los principales resultados obtenidos señalaron que, un alto contenido de glucano, un bajo contenido de lignina, un alto contenido de unidades de tipo siringilo unidas por enlaces de tipos de β-O-4, y una alta frecuencia de este tipo de enlaces, son características favorables para la producción de pulpas kraft aumentando su rendimiento y disminuyendo el consumo de materia prima necesaria para su producción. Además, ciertas características de la lignina como la relación eritro/treo, e hidroxilos alifáticos, fenólicos y carboxílicos parecieran no tener una fuerte influencia en el rendimiento pulpable. Además, algunas de las propiedades físicas de la pulpa y papel analizadas, como; índice de tensión, de rasgado, de estallido y opacidad, no presentaron diferencias entre los distintos clones analizados, a pesar de los distintos rendimiento pulpables obtenidos. El desarrollo de los modelos NIR de predicción obtenidos de muestras de tarugos y astillas, otorgaron buenos modelos predictivos para el contenido de glucano, y lignina, mientras que, los modelos de predicción para el contenido de unidades de tipo siringilo no condensada y frecuencia de enlaces β-O-4 en la lignina, no fueron apropiados para predecir un set de muestras externas dado principalmente por la falta de robustez del modelo desarrollado. Adicionalmente, los modelos desarrollados, permitieron también predecir el rendimiento pulpable, consumo específico y densidad básica, en E. globulus con una alta precisión. La predicción de estas propiedades presenta una gran ventaja, sobre todo para la selección clonal, considerando que puede ser aplicado para muestras de tarugo obtenidas de árboles a temprana edad, pudiendo estimar su futuro comportamiento.
Implementación de tecnología analítica para el análisis y desarrollo de bioetanol desde material lignocelulósico.
(Universidad de Concepción., 2009) Valenzuela Pickrodt, Roberto; Freer Calderón, Juanita
Para que la producción de bioetanol desde material lignocelulósico sea económicamente viable, los costos de producción del proceso deben reducirse significativamente. Los métodos de pretratamiento y la tecnología para generar azúcares fermentables mediante hidrólisis enzimática son etapas fundamentales en la producción de bioetanol y son consideradas barreras económicas para el proceso global. Una alternativa para reducir los costos es utilizar enzimas inmovilizadas con el fin de retener y reciclar, sin pérdida de actividad enzimática, uno de los componentes más caros del proceso de producción de bioetanol. La elección del soporte en el que se inmoviliza la enzima es importante. La síntesis debe ser fácil y económica, pero por sobre todo debe ser fácil de separar de la mezcla de reacción y no debe afectar la actividad y estabilidad de la enzima. En el presente trabajo se estudia el uso de nanopartículas de magnetita como soporte de enzimas. Al ser un óxido de hierro que presenta características magnéticas, su separación desde las mezclas de reacción se puede realizar fácilmente a través de imanes. Dos metodologías diferentes para sintetizar nanopartículas de magnetita fueron estudiadas: la metodología de co-precipitación de los iones Fe2+/Fe3+ en medio básico y por medio de la oxidación de Fe(OH)2 por H2O2. Las nanopartículas sintetizadas por ambos métodos fueron caracterizadas fisicoquímicamente. Por medio de difracción de rayos-X (XRD) se analizó la estructura cristalina. Para confirmar la síntesis de magnetita en vez de meghemita, la cual posee un patrón de difracción de rayos-X idéntico, se utilizó espectroscopía fotoelectrónica de rayos-X (XPS) para examinar la estequiometría Fe:O. La distribución de tamaño, forma y morfología de las nanopartículas de magnetita se determinaron a través de microscopía electrónica de transmisión (TEM). El diámetro hidrodinámico de las muestras dispersadas se determinó por dispersión dinámica de luz (DLS). Las propiedades magnéticas se analizaron utilizando un magnetrónomo superconductor con dispositivo superconductor de interferencia cuántica (SQUID). Mediante el método de co-precipitación de los iones Fe2+/Fe3+ (razón molar 1:2) por adición de amonio bajo agitación mecánica a 10000 rpm, se obtuvieron nanopartículas superparamagnéticas de magnetita con un diámetro promedio de ~ 10 nm. Se encontró que ésta velocidad de agitación es la adecuada para la obtención de nanopartículas con este tamaño promedio. Una disminución en la velocidad de agitación da como resultado mayores tamaños (~19 nm) y distribución de tamaño más amplia. A 18000 rpm, además de magnetita, se sintetiza goetita a la forma de nanopartículas y nanovaras. A mayores velocidades de agitación (25000 rpm), la temperatura del núcleo de la solución aumenta, generando una mezcla de compuestos de hierro sin características magnéticas. Por medio de la metodología de oxidación de Fe(OH)2 por H2O2, se determinó que no sólo se sintetiza nanopartículas de magnetita de distintas formas y tamaño, si no que además cristales de lepidocrocita. Se inmovilizó la enzima b-glucosidasa de Trichoderma reesi sobre nanopartículas de magnetita con diámetro promedio de ~10 nm amino funcionalizadas con 3-aminopropiltrietoxisilano, y utilizando glutaraldehido como agente enlazante. Al ser las nanopartículas silanizadas se produce el aumento del diámetro hidrodinámico, mientras que la saturación magnética disminuye sin perder el superparamagnetismo. La enzima inmovilizada se mantuvo estable por al menos 45 días sin pérdida de actividad enzimática. La b-glucosidasa inmovilizada se utilizó para suplementar a la celulasa en la hidrólisis enzimática de paja de trigo pretratada por explosión por vapor. El porcentaje de hidrólisis tras 72 h fue sólo 8.1 % más bajo que la hidrólisis realizada con celulasa suplementada con b-glucosidasa libre. Aunque el rendimiento es un poco menor, el reciclaje de la enzima inmovilizada permite reducir el costo del proceso de sacarificación de material lignocelulósico. Durante las etapas iniciales de degradación de madera por hongos de pudrición parda se produce la degradación de carbohidratos sin remover lignina. Estos hongos utilizan agentes de degradación de baja masa molar para mediar la producción de radicales ·OH por la reacción de Fenton. Los metales tienen un rol importante en los procesos de degradción no enzimáticos debido a que en esta reacción formas reducidas de metales de transición reducen H2O2 a ·OH. Se realizó un estudio de los efectos de la reacción de Fenton sobre un compuesto modelo de lignina no fenólica y sobre una forma soluble de celulosa para determinar si los hongos de pudrición parda son adecuados para ser utilizados como pretratamiento biológico. Se determinó que la reacción de Fenton cuprosa asistida por el dihidroxibenceno catecol es más lenta y menos eficiente que la reacción de Fenton ferrosa asistida por catecol. La cromatografía líquida de intercambio aniónico con detector de pulso amperométrico (HPAEPAD) permite la separación de D-arabinosa, D-galactosa, D-glucosa, D-xilosa y D-manosa con buena resolución a tavés de la columna de intercambio aniónico CarboPac PA10, utilizando 1% de NaOH 200 mM y 99% de agua de calidad nanopura como fase móvil a flujo constante de 1,0 mL min-1. Esta metodología presenta bajos límites de detección y cuantificación, pero requiere grandes diluciones de las muestras de los hidrolizados del material lignocelulósico para que los carbohidratos de éstas puedan ser cuantificados por esta metodología.

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