Tesis Doctorado

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Implementación de tecnología analítica para el análisis y desarrollo de bioetanol desde material lignocelulósico.
(Universidad de Concepción., 2009) Valenzuela Pickrodt, Roberto; Freer Calderón, Juanita
Para que la producción de bioetanol desde material lignocelulósico sea económicamente viable, los costos de producción del proceso deben reducirse significativamente. Los métodos de pretratamiento y la tecnología para generar azúcares fermentables mediante hidrólisis enzimática son etapas fundamentales en la producción de bioetanol y son consideradas barreras económicas para el proceso global. Una alternativa para reducir los costos es utilizar enzimas inmovilizadas con el fin de retener y reciclar, sin pérdida de actividad enzimática, uno de los componentes más caros del proceso de producción de bioetanol. La elección del soporte en el que se inmoviliza la enzima es importante. La síntesis debe ser fácil y económica, pero por sobre todo debe ser fácil de separar de la mezcla de reacción y no debe afectar la actividad y estabilidad de la enzima. En el presente trabajo se estudia el uso de nanopartículas de magnetita como soporte de enzimas. Al ser un óxido de hierro que presenta características magnéticas, su separación desde las mezclas de reacción se puede realizar fácilmente a través de imanes. Dos metodologías diferentes para sintetizar nanopartículas de magnetita fueron estudiadas: la metodología de co-precipitación de los iones Fe2+/Fe3+ en medio básico y por medio de la oxidación de Fe(OH)2 por H2O2. Las nanopartículas sintetizadas por ambos métodos fueron caracterizadas fisicoquímicamente. Por medio de difracción de rayos-X (XRD) se analizó la estructura cristalina. Para confirmar la síntesis de magnetita en vez de meghemita, la cual posee un patrón de difracción de rayos-X idéntico, se utilizó espectroscopía fotoelectrónica de rayos-X (XPS) para examinar la estequiometría Fe:O. La distribución de tamaño, forma y morfología de las nanopartículas de magnetita se determinaron a través de microscopía electrónica de transmisión (TEM). El diámetro hidrodinámico de las muestras dispersadas se determinó por dispersión dinámica de luz (DLS). Las propiedades magnéticas se analizaron utilizando un magnetrónomo superconductor con dispositivo superconductor de interferencia cuántica (SQUID). Mediante el método de co-precipitación de los iones Fe2+/Fe3+ (razón molar 1:2) por adición de amonio bajo agitación mecánica a 10000 rpm, se obtuvieron nanopartículas superparamagnéticas de magnetita con un diámetro promedio de ~ 10 nm. Se encontró que ésta velocidad de agitación es la adecuada para la obtención de nanopartículas con este tamaño promedio. Una disminución en la velocidad de agitación da como resultado mayores tamaños (~19 nm) y distribución de tamaño más amplia. A 18000 rpm, además de magnetita, se sintetiza goetita a la forma de nanopartículas y nanovaras. A mayores velocidades de agitación (25000 rpm), la temperatura del núcleo de la solución aumenta, generando una mezcla de compuestos de hierro sin características magnéticas. Por medio de la metodología de oxidación de Fe(OH)2 por H2O2, se determinó que no sólo se sintetiza nanopartículas de magnetita de distintas formas y tamaño, si no que además cristales de lepidocrocita. Se inmovilizó la enzima b-glucosidasa de Trichoderma reesi sobre nanopartículas de magnetita con diámetro promedio de ~10 nm amino funcionalizadas con 3-aminopropiltrietoxisilano, y utilizando glutaraldehido como agente enlazante. Al ser las nanopartículas silanizadas se produce el aumento del diámetro hidrodinámico, mientras que la saturación magnética disminuye sin perder el superparamagnetismo. La enzima inmovilizada se mantuvo estable por al menos 45 días sin pérdida de actividad enzimática. La b-glucosidasa inmovilizada se utilizó para suplementar a la celulasa en la hidrólisis enzimática de paja de trigo pretratada por explosión por vapor. El porcentaje de hidrólisis tras 72 h fue sólo 8.1 % más bajo que la hidrólisis realizada con celulasa suplementada con b-glucosidasa libre. Aunque el rendimiento es un poco menor, el reciclaje de la enzima inmovilizada permite reducir el costo del proceso de sacarificación de material lignocelulósico. Durante las etapas iniciales de degradación de madera por hongos de pudrición parda se produce la degradación de carbohidratos sin remover lignina. Estos hongos utilizan agentes de degradación de baja masa molar para mediar la producción de radicales ·OH por la reacción de Fenton. Los metales tienen un rol importante en los procesos de degradción no enzimáticos debido a que en esta reacción formas reducidas de metales de transición reducen H2O2 a ·OH. Se realizó un estudio de los efectos de la reacción de Fenton sobre un compuesto modelo de lignina no fenólica y sobre una forma soluble de celulosa para determinar si los hongos de pudrición parda son adecuados para ser utilizados como pretratamiento biológico. Se determinó que la reacción de Fenton cuprosa asistida por el dihidroxibenceno catecol es más lenta y menos eficiente que la reacción de Fenton ferrosa asistida por catecol. La cromatografía líquida de intercambio aniónico con detector de pulso amperométrico (HPAEPAD) permite la separación de D-arabinosa, D-galactosa, D-glucosa, D-xilosa y D-manosa con buena resolución a tavés de la columna de intercambio aniónico CarboPac PA10, utilizando 1% de NaOH 200 mM y 99% de agua de calidad nanopura como fase móvil a flujo constante de 1,0 mL min-1. Esta metodología presenta bajos límites de detección y cuantificación, pero requiere grandes diluciones de las muestras de los hidrolizados del material lignocelulósico para que los carbohidratos de éstas puedan ser cuantificados por esta metodología.
Implementación de metodologías analíticas y desarrollo de modelos predictivos para la caracterización de componentes estructurales en clones de Eucalyptus globulus.
(Universidad de Concepción., 2009) Norambuena Césped, Marcela; Freer Calderón, Juanita
En Chile, Eucalyptus globulus, es una de las especies forestales más importante utilizada como materia prima para la industria de pulpa y papel y posee un gran mercado de exportación a nivel mundial. Entre sus principales características, destacan su rápido crecimiento, su alta calidad de fibra y pulpa y su fácil adaptación a nuevos terrenos de cultivo. Se han realizado grandes esfuerzos dedicados a la selección y mejoramiento para aumentar la eficiencia de la producción de pulpa y disminuir el consumo de reactivos químicos del pulpaje y blanqueo, logrando seleccionar clones de E. globulus que presenten ganancia significativa en la producción de pulpas. Sin embargo, es bastante limitado el conocimiento de la influencia de las características estructurales y ultraestructurales de los biopolímeros de la madera sobre la habilidad pulpable. Con este objetivo, el presente trabajo esta orientado en determinar el efecto del contenido de carbohidratos, lignina y extraíbles y las características estructurales de la lignina como unidades de tipo siringilo no condensadas, frecuencia de enlaces β-O-4, relación S/G así como también, los grupos hidroxilos fenólicos y alifáticos totales, unidades siringilo y guaiacilo con hidroxilos fenólicos libres, y la relación eritro/treo del la estructura β-O-4 en el rendimiento pulpable, consumo específico y la densidad básica de los distintos genotipos de E. globulus. Con esta finalidad, se implementaron las técnicas analíticas de tioacidólisis y de RMN 31P para evaluar las diferencias estructurales de la lignina y su influencia sobre estos parámetros. Además, se estableció la influencia de las características químicas de la madera sobre las características físico-mecánicas de la madera y pulpa, mediante la evaluación de las respectivas correlaciones lineales y se determinó que características podría ser de interés como parámetro de selección clonal para la producción de pulpa kraft. Dado que los programas de mejoramiento genético requieren del análisis de un gran número de muestras, el desarrollo de modelos predictivos NIR como una herramienta rápida y no destructiva, es de gran utilidad para predecir parámetros que permitan la selección clonal Los principales resultados obtenidos señalaron que, un alto contenido de glucano, un bajo contenido de lignina, un alto contenido de unidades de tipo siringilo unidas por enlaces de tipos de β-O-4, y una alta frecuencia de este tipo de enlaces, son características favorables para la producción de pulpas kraft aumentando su rendimiento y disminuyendo el consumo de materia prima necesaria para su producción. Además, ciertas características de la lignina como la relación eritro/treo, e hidroxilos alifáticos, fenólicos y carboxílicos parecieran no tener una fuerte influencia en el rendimiento pulpable. Además, algunas de las propiedades físicas de la pulpa y papel analizadas, como; índice de tensión, de rasgado, de estallido y opacidad, no presentaron diferencias entre los distintos clones analizados, a pesar de los distintos rendimiento pulpables obtenidos. El desarrollo de los modelos NIR de predicción obtenidos de muestras de tarugos y astillas, otorgaron buenos modelos predictivos para el contenido de glucano, y lignina, mientras que, los modelos de predicción para el contenido de unidades de tipo siringilo no condensada y frecuencia de enlaces β-O-4 en la lignina, no fueron apropiados para predecir un set de muestras externas dado principalmente por la falta de robustez del modelo desarrollado. Adicionalmente, los modelos desarrollados, permitieron también predecir el rendimiento pulpable, consumo específico y densidad básica, en E. globulus con una alta precisión. La predicción de estas propiedades presenta una gran ventaja, sobre todo para la selección clonal, considerando que puede ser aplicado para muestras de tarugo obtenidas de árboles a temprana edad, pudiendo estimar su futuro comportamiento.
Diferenciación varietal y evolución del perfil de flavonoides y actividad antioxidante del vino tinto durante el proceso de guarda.
(Universidad de Concepción., 2010) Vergara Rosales, Carola Andrea; Von Baer Von Lochow, Dietrich
El vino es un producto de lujo que está sujeto a las demandas del consumidor. El vino chileno es un producto de exportación que compite en mercados internacionales, por lo que debe cumplir con estándares de confianza como la autenticidad varietal y presentar características que lo hagan más atractivo para los consumidores, por el efecto beneficioso para la salud asociado a su consumo moderado. El objetivo de este trabajo fue el desarrollo e implementación de metodologías analíticas para la evaluación de parámetros de calidad, como es la autenticidad varietal en vinos de guarda, y el estudio de la evolución de compuestos antioxidantes del vino tinto durante dicho proceso. Una de las familias de compuestos usados para la diferenciación varietal de vinos tintos son los antocianos, que le confieren el color característico. La razón de antocianos acetilados y cumarilados (Rac/coum) determinados por HPLC en columnas de fase inversa que permite la diferenciación de ciertas variedades de vinos tintos, puede verse alterada por la formación de piranoantocianos durante el envejecimiento del vino. Estos pigmentos poliméricos interfieren en la determinación de antocianos cumarilados, por lo tanto, la resolución entre estos picos debe ser optimizada y rigurosamente controlada para cada columna para minimizar el riesgo de una clasificación errónea. Otra aproximación al problema, es evaluar columnas con una selectividad diferente a las columnas de fase inversa para la separación cromatográfica de antocianos y piranoantocianos. El vino Carménère es un producto emblema nacional, que tradicionalmente había sido confundido en Chile con la variedad Merlot. Como alternativa a la diferenciación varietal de vinos tintos por medio de perfiles de antocianos, se evaluó otro grupo de marcadores que permita mejorar su clasificación. Los perfiles de flavonoles permiten mejorar la separación entre vinos Carménère y Merlot, por medio de la concentración de quercetina total y miricetina total. Se encontró que la concentración de flavonoles promedio para vinos Carménère y Merlot es mayor que la concentración promedio de los vinos Cabernet Sauvignon. Los vinos estudiados presentaron concentraciones de flavonoles superiores a las reportadas en literatura. Por otro lado, una tendencia similar se encontró en pieles de uvas, en donde se encontró una concentración de flavonoles totales superior en la variedad Carménère. Los flavonoles, como compuesto de interés debido a sus propiedades antioxidantes, en vinos Carménère producidos completamente en barrica de roble presentaron la concentración de flavonoles totales más alta en comparación a vinos Carménère producidos en cubas de acero inoxidable. La variedad Carménère presenta los cambios mayores desde el inicio de la fermentación maloláctica que los vinos Cabernet Sauvignon, con respecto a la concentración de flavonoides, capacidad antioxidante y polifenoles totales, pero ambas variedades llegan a concentraciones similares al final del estudio. Se puede observar una mayor correlación entre la concentración de antocianos totales con la capacidad antioxidante, debido a la mayor proporción de éstos en el vino tinto. Debe considerarse además el sinergismo entre todos los polifenoles presentes en el vino sobre la capacidad antioxidante total de éste.
Desarrollo de metodologías analíticas para la caracterización de compuestos de bajo peso molecular en Bio-Oil y su aplicación en la optimización del proceso de producción y fraccionamiento.
(Universidad de Concepción., 2011) Tessini Ortiz, Catherine Valeska; Von Baer Von Lochow, Dietrich
En la presente tesis se desarrollaron y evaluaron diferentes metodologías para la determinación de diversos componentes en el bio-oil. Para ello se emplearon distintas técnicas cromatográficas, con el objetivo de determinar ácidos orgánicos de cadena corta, compuestos volátiles, azúcares y aldehídos en bio-oil y sus fracciones. La caracterización y determinación de estos analitos además sirve de base para evaluar las condiciones óptimas de pirólisis de biomasa, para orientar el proceso hacia la obtención de productos químicos de interés industrial. Para la determinación de los aldehídos de bajo peso molecular, como formaldehído, acetaldehído y propionaldehído, se evaluó su determinación por HPLC-UV, previa derivatización con 2,4-DNPH. Las condiciones de esta derivatización pueden provocar reacciones no deseadas que afecten la estabilidad del bio-oil y de sus principales componentes. Por ello fue necesario desarrollar una metodología de mayor selectividad y en que la reacción de derivatización no se realice en condiciones que afecten la cuantificación. Este procedimiento está basado en la utilización de la microextracción en fase sólida en modo espacio de cabeza (head space), empleando la derivatización directamente en la fibra con PFBHA como agente derivatizante. Posteriormente la separación/detección es realizada en un sistema GC/MS. Esta metodología demostró ser sencilla y rápida. Además es posible su optimización, empleando herramientas quimiométricas. Alternativamente se desarrolló un método basado en la derivatización en la solución de la muestra, empleando el sistema de inyección en modo espacio de cabeza. Los aldehídos determinados por ambas metodologías fueron: formaldehído (~ 2 %), acetaldehído (~ 0.1 %) y propionaldehído (~ 0.05 %). Mediante cromatografía liquida de alta resolución, en la modalidad de fase inversa en serie con exclusión iónica y detección directa al UV a 210 nm, es posible la determinación por inyección directa de ácidos orgánicos (fórmico, acético y propiónico) en fracciones de bio-oil obtenidas por destilación. Ello no requiere un tratamiento previo de la muestra, sin embargo esta metodología no es aplicable a muestras de bio-oil crudo, por los interferentes que éste contiene. Los azúcares en bio-oil fueron determinados por HPTLC. Con esta técnica fue posible la cuantificación de los principales azúcares en el bio-oil. Para ello fue necesaria la implementación de un sistema de screening para descartar la presencia de glucosa en las muestras, ya que de estar presente en altas concentraciones, podría interferir en la cuantificación del celobiosano. Esta metodología puede aplicarse directamente a muestras de bio-oil crudo, fracciones de solventes orgánicos y fracciones acuosas e incluso a muestras de lignina pirolítica. Los principales azúcares que se determinaron fueron: levoglucosano (~ 1.5-3 %), celobiosano (~ 0.5-2.0 %), xilosa y arabinosa. Estos últimos en la mayoría de las muestras, si es que se detectaban, se encontraban bajo los límites de cuantificación del método. Además se desarrolló una metodología sencilla basada en la derivatización de analitos con BSTFA. Ello permite determinar ácidos orgánicos y azúcares, los cuales pueden ser derivatizados de forma simultánea y cuantificados en un solo cromatograma, empleando un estándar interno para cada grupo de compuestos. Los principales ácidos determinados mediante este método fueron ácido fórmico (~ 0.5-2 %), acético (~ 1.5-3.0 %), propiónico (~ 0.1-0.8 %), láctico (~ 0.1-0.6 %) y glicólico. A su vez, los principales azúcares determinados fueron levoglucosano (~ 1.5-2.8 %), celobiosano (~0.2-1.5 %), xilosa (~ 0.05 %) y arabinosa (~ 0.05 %). Dependiendo de la utilidad que tenga el bio-oil a nivel industrial, las metodologías desarrolladas pueden ser aplicadas de forma individual o complementada con el método general de caracterización de bio-oil mediante su inyección directa a GC/MS. De esta forma es posible contar con diferentes alternativas para la cuantificación de los compuestos en el bio-oil.
Perfiles de derivados de ácidos hidroxicinámicos y alcaloides en frutos de calafate (Berberis ssp.) y otros frutos de la Patagonia mediante HPLC-DAD-MS/MS en relación a su diversidad genética y distribución geográfica.
(Universidad de Concepción., 2013) Ruiz Muñoz, María Antonieta; Mardones Peña, Claudia
La promoción de una vida saludable es una estrategia que ha cobrado gran importancia en la actualidad, enfocada en la prevención de la obesidad y sobrepeso que afecta a altos porcentajes de la población, debido a las enfermedades crónicas no transmisibles que pueden producirse como consecuencia de dichos desordenes alimentarios. Dentro de este punto, se ha promovido el consumo de alimentos saludables, donde juegan un rol importante los berries, debido a su alto contenido de compuestos fenólicos, a los cuales se les ha atribuido efectos beneficiosos para la salud. El calafate (Berberis microphylla) es un berry nativo de la Patagonia Chilena y Argentina, el cual se caracteriza por ser una baya ovalada de color rojizo-azulado oscuro debido a su alto contenido de antocianos, y con altos niveles de capacidad antioxidante. Es una planta silvestre que no se cultiva, pero que ha sido utilizada desde tiempos remotos para la preparación de bebidas y mermeladas con su fruto y de colorantes con su raíz. Estudios previos han revelado que el fruto es una fuente importante de compuestos fenólicos, específicamente antocianos, sin embargo no se ha estudiado la diversidad de sus concentraciones ni la distribución de estos compuestos fenólicos en frutos obtenidos en diferentes latitudes. Tampoco existe información sobre la variabilidad genética de las poblaciones que conforman la especie. No se ha reportado en literatura el estudio de los perfiles y el contenido de derivados de ácidos hidroxicinámicos presentes en su fruto, compuestos responsables de interesantes efectos biológicos. Por otro lado, si bien se reportó la presencia de alcaloides en otras estructuras de la planta, no se ha encontrado información que indique niveles de dichos alcaloides en su fruto. En esta investigación se aborda el estudio de estos compuestos y su distribución de acuerdo a la zona de obtención de la muestra. Junto con ello, se estudian los perfiles de antocianos y flavonoles en un número alto de muestras obtenidas en distintas regiones de la Patagonia sur del país, con el objetivo de dar una explicación a las posibles diferencias en los perfiles de compuestos fenólicos observados. Con este objetivo, fue necesario desarrollar una estrategia analítica que permitiese la extracción, separación cromatográfica y detección adecuada de cada uno de los compuestos de interés. Para ello se usó columnas de fase mixta en el caso de los derivados hidroxicinámicos y columnas Extrelut en el caso de los alcaloides. Los gradientes de separación cromatográfica fueron optimizados utilizando como fases móviles, sistemas de solventes compatibles con detección mediante espectrometría de masas (MS/MS), para lo cual las condiciones también debieron ser optimizadas. También fue necesaria la caracterización mediante RMN de moléculas que no lograron serlo por espctrometría de masas. En forma paralela, fueron estudiados los perfiles de antocianos, flavonoles y derivados de ácidos hidroxicinámicos de otros berries magallánicos pertenecientes a familias Grossulariaceae, Ericaceae, Rosaceae, Myrtaceae y Onagraceae. Los resultados cuantitativos de los perfiles de compuestos fenólicos y actividad antioxidante de frutos de calafate de diferente origen geográfico y diferentes años de recolección, fueron abordados mediante herramientas quimiométricas. Dichos resultados fueron contrastados con datos de diversidad genética obtenida para las mismas muestras, siendo ambos concordantes, pudiendo concluir que las diferencias observadas serían mejor explicadas por factores ambientales y no genéticos. Por otro lado, los resultados comparativos con otros frutos magallánicos muestran que los niveles de compuestos fenólicos en calafate fueron mayores que los observados para frutos que crecen en las mismas zonas que éste, pudiendo clasificar al calafate como un “super fruto” por su alto potencial nutracéutico.
Desarrollo de un sistema Fenton heterogéneo soportado en tanino insoluble de corteza de pinus radiata y su evaluación como proceso de oxidación avanzada en sistema modelo
(Universidad de Concepción., 2016) Romero Carrillo, Romina Patricia; Contreras Pérez, David Rodrigo; Segura Castillo, Cristina
En las últimas décadas, la presencia de contaminantes orgánicos en efluentes municipales e industriales ha sido un problema de creciente consideración lo que ha llevado a la búsqueda de métodos eficientes para el tratamiento de la contaminación ambiental abriendo el campo a la investigación de nuevas tecnologías. Entre éstas, los llamados Procesos de Oxidación Avanzada (AOPs) son particularmente importantes, ya que son capaces de degradar completamente y convertir en productos inocuos y/o biodegradables un amplio espectro de compuestos orgánicos e inorgánicos. El proceso Fenton heterogéneo es un AOP, que emplea peróxido de hidrógeno y un sólido contenedor/portador de hierro, se basa en la generación in situ de radicales hidroxilo, los cuales reaccionan rápidamente y en forma no selectiva con cualquier compuesto, debido a su gran capacidad oxidante (E°(∙OH/H2O)= 2.8 V/SHE). En la presente tesis se realizó la modificación de la convencional reacción de Fenton, en un sistema heterogéneo que emplea peróxido de hidrógeno, hierro y un sólido contenedor de dihidroxibencenos, que como señala la literatura conducen y amplifican esta reacción, sin embargo, al ser sistemas en fase homogénea no presentan aplicación en limpieza de contaminantes. De este modo, la ventaja consiste en la utilización de un sólido insoluble en agua, lo que evita la contaminación del efluente con compuestos fenólicos, además de presentar también, un importante valor ambiental al ser obtenido desde un residuo forestal, específicamente de corteza de Pinus radiata. Como resultado de esta investigación se caracterizó el tanino proveniente de la corteza de Pinus radiata con metodologías analíticas desarrolladas y otras rutinarias en el estudio de matrices sólidas. Posteriormente, se evaluó su efectividad como soporte y catalizador de reacción para Fenton heterogéneo con el cual se degradó atrazina en un sistema modelo optimizado, de forma más rápida y efectiva que la reacción de Fenton convencional.
Desarrollo de modelos quimiométricos para determinar la correlación entre bio-actividad y características químicas y espectroscópicas de propóleos provenientes de distintas zonas apícolas del Sur de Chile
(Universidad de Concepción., 2016) Venegas Sepúlveda, Yovani Alexis; Contreras Pérez, David Rodrigo; Pastene Navarrete, Edgar Rafael
Se abordó la problemática de la estandarización del propóleos, desde un enfoque basado en el estudio quimiométrico de la correlación entre la composición química y la actividad biológica de muestras recolectadas en diferentes zonas geográfica de la región del Biobío y Araucanía. Se implementó un método espectroscópico de bajo costo para caracterizar muestras crudas de propóleos en función de su composición química. Fueron desarrollados modelos predictivos de actividad biológica para ser utilizados en el control de la producción de productos apícolas. Para desarrollar estos modelos se utilizó la espectroscopia de infrarrojo cercano (NIR) con muestras de propóleos crudas, sin ningún tipo de procesamiento. Los espectros NIR fueron calibrados con los resultados obtenidos por diferentes métodos de referencia, (espectroscópicos y cromatográficos) para algunos compuestos de interés biológico relevante, tal como son el contenido de polifenoles totales, el contenido de flavonoides totales y el contenido de equivalentes de fenetil éster de ácido cafeico (CAPE). Simultáneamente, a partir de los mismos espectros NIR, se desarrollaron modelos predictivos PLS de la bio-actividad “in vitro” que pudieran tener 26 muestras de propóleos determinadas por los métodos tradicionales de inhibición enzimática, como fueron la actividad antioxidante y la actividad antidiabética. La capacidad de predicción simultánea de marcadores químicos responsables de alguna actividad biológica relevante mediante el uso de herramientas quimiométricas permite inferir que es posible abordar la problemática de la estandarización de propóleos de manera rápida, eficiente, automatizable y de bajo costo, siendo esta información útil para la industria apícola y que puede ser extrapolado a otro tipo de investigación de productos naturales.
Desarrollo de una plataforma analítica para el estudio de compuestos (poli)fenólicos en frutos de uva, calafate y para metabolómica en plasma de animales de experimentación sometidos a la ingesta aguda de un extracto de fruto
(Universidad de Concepción., 2017) Bustamante Salazar, Luis Alejandro; Mardoñes Peña, Claudia; von Lochow, Dietrich von Baer; Pastene Navarrete, Edgar
Se desarrolló un conjunto de métodos de análisis con un enfoque metabolómico dirigido y no dirigido, junto a ensayos de capacidad antioxidante como plataforma analítica para estudios de intervención nutricional. De acuerdo a la estrategia analítica planteada, se caracterizaron frutos de uva de mesa (Vitis vinífera L.) Red Globe, Pink Globe y de calafate (Berberis microphylla), 3 frutos con elevadas concentraciones de polifenoles. Los resultados obtenidos por HPLC-DAD-ESI-MS/MS indican que el fruto de calafate contiene entre 60 a 400 veces más antocianos que en las uvas estudiadas, seguido por ácidos hidroxicinámicos y flavonoles (45 y 15 veces, respectivamente), por lo que se diseñó un ensayo de ingesta aguda usando calafate. Con el fin de elaborar un extracto liofilizado de Calafate enriquecido en polifenoles, se modificó la extracción usando etanol potable y ácido fórmico, produciendo un extracto seco de calafate que contiene 265.26 μmol de polifenoles por gramo. Una vez producido un lote homogéneo de extracto liofilizado, se administraron 300 mg/kg de éste a 5 grupos de gerbos (n=3). Transcurridas 1, 2, 4, 8 y 12 horas, se extrajo entre 600 y 1000 μL de sangre mediante punción del plexo retroorbital. Un grupo control (n=3) usado como tiempo 0 se incluyó en el diseño. Se logró obtener plasma sin hemólisis y los animales no fueron sacrificados. A partir de los plasmas obtenidos, se cuantificaron mediante un método GC-MS/MS validado más de 40 productos de metabolización de polifenoles presentes en calafate, análisis metabolómico no dirigido mediante UPLC-QTOF y ensayos de capacidad antioxidante en microplaca. Los resultados cuantitativos obtenidos por GC-MS/MS muestran aumentos de 9 compuestos asociados al consumo del extracto de calafate. Luego de 1 y 2 horas los compuestos 1,4-dihidroxibenceno, ácidos 3,4-dihidroxifenilacético, 4-hidroxicinámico, 3,5-dimetoxi-4-hidroxibenzoico y 3-metoxi-4-hidroxibenzoico muestran una tendencia al alza, mientras que se observó un aumento significativo de los ácidos 3-hidroxicinámico y 3-metoxi-4-hidroxifenilacético. Además, los ácidos 3-hidroxifenilacético y fenilacético muestran aumentos significativos luego de 4 y 8 horas de administrado el extracto. El análisis metabolómico no dirigido de las mismas muestras de plasma revela un cambio significativo de 20 compuestos durante los tiempos ensayados. De estos, uno se identificó como adenosina monofosfato y 6 como metabolitos derivados del consumo del extracto de calafate. Los compuestos cumaroil-quinolactona y derivados sulfatados de ácido (iso)vaníllico y un isómero de ácido cafeico aumentan significativamente luego de 1 y 2 horas de administrado el extracto de calafate. Los derivados sulfatados de un segundo isómero de ácido cafeico y ácido (iso)ferúlico aumentan significativamente solo luego de 1 hora y un metoxicatecol-sulfato aumenta luego de 2 horas. Además, el mismo ácido (iso)ferúlico aumenta nuevamente luego de 12 horas de administrado el extracto. El ensayo ORAC-FL revela un aumento significativo luego de 1 hora, mientras que el ensayo CUPRAC lo alcanza a las 4 horas de administrado el extracto de calafate. Los resultados de Fenoles totales exhiben un aumento significativo a las 1, 4 y 12 horas, relacionándose con los incrementos de los resultados anteriores
Caracterización química localizada de pulpas lignocelulósicas mediante técnicas microscópicas y análisis multivariado aplicado a imágenes
(Universidad de Concepción., 2017) Araya Quintana, Juan Andrés; Castillo Felices, Rosario; Freer Calderón, Juanita
El rendimiento en el proceso de obtención de etanol mediante sacarificación y fermentación de material lignocelulósico, depende en gran medida de la interacción de las enzimas con la fibra de celulosa, donde la presencia de lignina y hemicelulosas suponen una barrera para la accesibilidad enzimática, fenómeno conocido como recalcitrancia. La mayoría de los métodos analíticos existentes estudian la composición química de la madera a través de técnicas destructivas. Para estudiar más de cerca el fenómeno de la recalcitrancia es necesario desarrollar una estrategia que permita el análisis cualitativo y cuantitativo en la superficie misma de la fibra lignocelulósica. La visualización de la distribución espacial de los principales componentes químicos presentes en la fibra es posible mediante obtención de imágenes espectrales a través de micro-espectroscopía FT-IR, donde se obtiene un espectro infrarrojo desde cada píxel de la imagen microscópica. Debido a la gran cantidad de datos obtenidos desde una imagen espectral, es útil la utilización de diferentes técnicas de análisis multivariado, a fin extraer matemáticamente la información relevante que permita la separación e identificación de los diferentes componentes de la matriz. En este trabajo se analizaron por FT-IR de imágenes fibras pre-tratadas de material lignocelulósico. Las imágenes espectrales obtenidas fueron sometidas a análisis de componentes principales (PCA), resolución multivariada de curvas con mínimos cuadrados alternantes (MCR-ALS) y regresión por mínimos cuadrados parciales (PLS). La reconstrucción quimiométrica de las imágenes espectrales obtenidas permitió identificar in situ los diferentes compuestos químicos presentes en la fibra, así como describir su distribución. Además, se desarrollaron diferentes estrategias para análisis cuantitativo en imágenes espectrales, permitiendo cuantificar glucanos, lignina y hemicelulosa directamente desde la superficie de la fibra. Se aplicaron otras técnicas microscópicas, como microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía laser confocal (CLSM) como métodos complementarios para el estudio de la ultraestructura de la fibra lignocelulósica. CLSM permitió la obtención de imágenes espectrales usando el espectro de emisión de compuestos auto-fluorescentes presentes en la madera. Mediante esta técnica fue posible identificar lignina y celulosa en la pared celular de fibras pre-tratadas y describir los patrones de distribución sin necesidad de métodos de marcaje molecular. Con las estrategias analíticas desarrolladas se observó que diferentes pre-tratamientos producen diferentes patrones de relocalización de lignina y que no es necesariamente el contenido total de lignina lo que afecta la accesibilidad enzimática, sino que la distribución en que ésta se encuentra en la pared celular. La plataforma analítica desarrollada permite el estudio químico micro-localizado, selectivo y no destructivo para matrices reales complejas y de estructura irregular, lo que proporcionaría una herramienta avanzada para el estudio del fenómeno de recalcitrancia. Este tipo de análisis tendría una aplicación transversal en el estudio de ambientes químicos en matrices microscópicas, por lo que su proyección en otras áreas del conocimiento constituye otra ventaja relativa a su desarrollo.
Revalorización de matrices lignocelulósicas como fuentes de lignanos.
(Universidad de Concepción., 2018) Inostroza Saldías, Juan Pablo; Vergara Rosales, Carola Andrea; Mardones Peña, Claudia
Los lignanos son metabolitos secundarios de las plantas que están relacionadas con su crecimiento y defensa. Su estructura química está compuesta por dos unidades fenilpropanoides enlazadas mediante el carbono La unidad fenilpropanoide es la misma que se utiliza como monómero de la lignina, por lo que lignano y lignina tienen una estrecha relación. Los lignanos son fitoestrógenos, en donde se caracterizan por tener una estructura similar a los estrógenos. Una vez ingeridos, los lignanos son transformados a enterolignanos mediante bacterias del tracto intestinal. Estos enterolignanos (principalmente enterodiol y enterolactona), poseen propiedades nticancerígenas, específicamente contra cáncer de mamas, próstata, colon y otros tipos de cáncer dependientes de hormonas, y también contra enfermedades cardiovasculares, osteoporosis y síndrome menopáusico.Exceptuando a la linaza, las oncentraciones de lignanos en vegetales son bajas, pero se ha descubierto que en algunas matrices leñosas, específicamente en los nudos de algunos árboles, se encuentran concentraciones altas de estos compuestos (5-30% p/p). En este trabajo se evaluaron algunas matrices lignocelulósicas consideradas desechos, como los sarmientos de vitis vinifera, huesos de aceitunas (olea europaea) de la industria XIII olivícola, zarzamoras (rubus ulmifolius) y zarzamoras (rubus ulmifolius) y desechos de la industria forestal (pinus radiata), con el fin de obtener un extracto rico en lignanos. Para llevar a cabo esto, se desarrollaron tres metodologías distintas de extracción: Extracción por Soxhlet, Extracción sólido-líquido asistida por ultrasonido y Extracción por fluido supercrítico. Se optimizaron los métodos y se evaluó finalmente que matriz posee mayor cantidad de lignanos y que metodología extractiva es la que genera resultados más favorables. La identificación y cuantificación de los lignanos se realizó mediante HPLC-DAD-ESI-MS/MS. Si bien algunas matrices no se detectaron lignanos en concentraciones importantes - como en la zarzamora o sarmientos-, en los desechos forestales se encontraron matairesinol y nortrachelogenina como los principales lignanos identificados en piñas y nudos, respectivamente. Los extractos producidos con Soxhlet y SFE produjeron 10 g de lignanos totales por 100 g de extracto seco. Aunque con ambos métodos se logran resultados similares, el uso de extracción de fluido supercrítico con CO2 produjo un extracto con menos uso de solventes y tiempo. El extracto final también tiene una gran capacidad antioxidante, por lo que podría ser una excelente opción como producto dirigido a la industria nutracéutica.
Composición elemental y perfil electroquímico de vinos Chilenos para la determinación del origen geográfico y varietal mediante modelos quimiométricos
(Universidad de Concepción., 2018) Latorre Castañeda, Mónica Piedad; Peña Farfal, Carlos
Teniendo en cuenta la importancia bioquímica que los elementos tienen en la elaboración del vino, se ha propuesto una caracterización de los principales metales en los vinos de la zona del valle del Itata. Se distinguen dentro de este territorio tres zonas geográficas que son reconocidos empíricamente por los productores. Así como tradiciones vitivinícolas han trascendido a lo largo del tiempo manteniéndose en la actualidad la producción de estos vinos con baja intervención química y tecnológica. Este estudio se enfocó en el comportamiento de la fracción elemental inmersa en el vino y su potencial para la diferenciación geográfica, recurriendo a técnicas quimiométricas para el análisis de datos multivariados, extrayendo información que relacione las concentraciones de los metales con la calidad y denominación de los vinos. En paralelo se incluyeron estudios electroquímicos no dirigidos para identificar y diferenciar de forma rápida el tipo de cultivar. Específicamente los vinos fueron seleccionados a lo ancho del valle del Itata y la clasificación se centra en las características geomorfológicas de este a oeste. Las muestras corresponden a vinos campesinos, elaborados con metodologías tradicionales y con mínimos tratamientos químicos. La determinación de los componentes inorgánicos del vino, requirió de un espectrómetro de masas con plasma de acoplamiento inductivo o ICP – MS. Técnicas con capacidad de detectar vestigios de metales hasta los niveles de ultra trazas y que, adicionalmente, contienen opciones de lectura de muestra (sistemas automatizados de dilución de muestra y diluciones isotópicas) capaces de contrarrestar las interferencias de la matriz o las causadas por las determinaciones multianalisis. A esto debe añadirse una óptima preparación de muestra que consiga establecer con precisión y exactitud las concentraciones. En el caso del vino, esta matriz es reconocida por su complejidad para el análisis, al coexistir con una gran cantidad de compuestos distribuidos en una suspensión hidroalcohólica, los que constituyen aproximadamente un 3% del total de la fracción total de compuestos diferentes al agua y al etanol. Estos a su vez se organizan por el nivel de concentración en que se encuentran en el vino. De forma complementaria se incluye el desarrollo de una metodología exploratoria para la determinación de complejos de bajo peso molecular (LMWC), empleando cromatografía líquida con detección UV y detección por espectrometría de masas con plasma de acoplamiento inductivo (SEC/AEC-ICP-MS). Además del estudio in vitro de biodisponibilidad para los metales. Para la elaboración de los modelos de clasificación geográfica y varietal, se desarrollaron modelos de clasificación y predicción con herramientas estadísticas multivariadas y análisis quimiométrico. Los métodos de clasificación y predicción utilizados incluyeron técnicas de exploración como análisis de componentes principales (PCA) para realizar análisis exploratorios y técnicas con más rigurosidad matemática y estadística con las cuales se calcularon los porcentajes de clasificación y error sobre un porcentaje de predicción, entre ellos Modelado Suave Independiente de Analogías de Clase (SIMCA) y Análisis Discriminate Lineal (LDA). Por otro lado, se realizó la investigación descriptiva aplicada a los perfiles electroquímicos de diferentes cultivares de vinos por medio de un arreglo de sensores. Para generar modelos de clasificación con técnicas electroquímicas, fue necesario el uso del Análisis Paralelo de Factores (PARAFAC).
Systematic study for the hydroxyl radical production in white wines as a function of the chemical composition.
(Universidad de Concepción., 2018) Márquez Calvo, Katherine Andrea; Contreras, David; Mardones, Claudia
La exposición del vino blanco al oxígeno puede causar efectos perjudiciales tales como la pérdida de características sensoriales, formación de olores desagradables y alteración del color. Nuevos antecedentes, sobre la oxidación del vino, establecen la importancia de la formación de complejos metálicos con compuestos con hidroxilos adyacentes. Estos complejos podrían reducir Fe(III), promoviendo la formación de radicales a través de la reacción de Fenton. Se ha propuesto un esquema que explica las vías de la oxidación química de los vinos blancos a través de la reacción de Fenton, donde la principal especie oxidante de esta reacción es el radical hidroxilo (•OH). Este radical tiene un alto poder oxidante y podría oxidar los principales componentes del vino. La formación de •OH, inducida por un corto burbujeo de aire, se determinó en 18 vinos blancos analizados por resonancia paramagnética electrónica (EPR) con Spin Trapping. La variación en la producción de •OH se relacionó con la composición fenólica de los vinos. Del análisis de las relaciones lineales, se observó que la concentración de •OH estaba relacionada linealmente con 5 compuestos fenólicos (ácido cafeico, ácido protocatecúico, ácido pcumárico, ácido gentísico y ácido siríngico). Por lo tanto, en este estudio se estableció la relación entre ciertos compuestos fenólicos y la inducción y amplificación de la producción de •OH. Aunque la oxidación química de los vinos ha sido ampliamente estudiada, principalmente en vinos modelo. Hasta esta tesis no había un estudio sistemático que relacione la composición de los vinos con la producción de •OH en vinos blancos reales. En esta tesis se generó un modelo de regresión multivariante, utilizando el algoritmo Partial Least Square (PLS), y se establecieron correlaciones lineales entre la composición del vino y la producción de •OH. De estos resultados, las variables más importantes se clasificaron como pro-oxidantes (ácido málico, ácido pcumárico, ácido cafeico, prodelfinidina, procianidinas B1, Mn, Cu y Zn) y antioxidantes (cis-piceido, ácido elágico, ácido gálico, proantocianidinas, glucosa y concentración de protones). Cabe destacar que, a la diferencia de las demás variables antioxidantes, el aumento en la concentración de glucosa y protones, hacen menos eficiente el proceso oxidativo, vale decir que su efecto es indirecto. Finalmente, se discuten las vías en las que los compuestos más importantes del vino participan en la producción de •OH.
Estilbenoides y proantocianidinas en sarmientos de vides caracterización, incidencia de las condiciones de guarda post-poda, actividad antioxidante y antiproliferativa en células cancerosas.
(Universidad de Concepción., 2018) Sáez Pulgar, Vania Stephanie; Mardones Peña, Claudia; Von Locfhow, Dietrich Von Baer
Los sarmientos de vides son residuos lignocelulósico que se producen anualmente en los viñedos durante la poda invernal. Debido a los altos niveles de (E)-resveratrol, se han propuesto a los sarmientos como una fuente de estilbenoides. Debido a la carencia de estándares de estilbenoides oligoméricos, éstos se purificaron a través de CPC y HPLCsemi. preparativa desde un extracto de sarmientos de Pinot Noir, obteniéndose 12 estilbenoides: (E)-ε-viniferina, (E)-resveratrol, (E)-piceatanol, ampelopsin A, vitisina B, (E)-δ-viniferina, (E)-ω-viniferina, pallidol, scirpusina A, isorapontigenina, (E)-trans-cismiyabenol C y un nuevo estilbenoide, denominado iso-scirpusina A. La identidad de los oligoestilbenoides se confirmó a través de HPLC-Q-Tof y mediante 1H- NMR, 13C-NMR, 1H-HCOSY, 1H-13C-HSQC. Los oligoestilbenoides aislados presentaron una mayor capacidad antioxidante in vitro a través de ORAC-FL que (E)-resveratrol. (E)-piceatannol exhibe efecto in vitro antiproliferativo a través del ensayo MTT sobre líneas celulares cancerosas humanas (SK-MES-1, AGS, J82), este efecto no es apreciable sobre la línea celular humana normal (MRC-5). Ampelopsina A muestra un efecto antiproliferativo mayor que (E)-resveratrol en la línea celular J82 de cáncer de vejiga. Sorprendentemente, el incremento de los estilbenoides en sarmientos es gatillado por la poda. La magnitud de dicho incremento en el sarmiento metabólicamente activo depende de las condiciones en la guarda post-poda. Para evaluar la evolución de los estilbenoides así como de las procianidinas, una familia de (poli)fenoles asociados con efectos beneficiosos para la salud, se desarrolló y aplicó en tres cultivares de vides un método HPLC-DAD-FL para la cuantificación rápida, selectiva y sensible, empleando tecnología de columna de núcleo sólido y un método HPLC-DAD-FL-MS/MS para la identificación. A 60 % de humedad relativa, se obtiene el doble de (E)-resveratrol para el mismo cultivar en comparación a los sarmientos que se almacenaron en 70 % de humedad relativa. (-)- epicatequina disminuye sus niveles durante el almacenamiento post-poda hasta un 75%. por lo que la humedad relativa es una variable importante a considerar en el almacenamiento post-poda de los sarmientos, además del tiempo de guarda, temperatura y longitud del trozo de sarmiento. Explorando nuevas opciones con mayor poder de separación, se desarrolló y optimizó un método cromatográfico bidimensional (HILIC x RP)-DAD-MS/MS, obteniéndose con una buena separación, capacidad de peak (842) y ortogonalidad (A0 = 78%). Se separaron 81 compuestos, entre los que destacan estilbenoides altamente polimerizados así como prodelfinidinas y procianidinas oligoméricas reportadas por primera vez en sarmientos de vides.
Fotoelextroxidación de compuestos disruptores endocrinos de origen esteroidal con electrodos de Ti/RuO2 – Acero inoxidable y evaluación de actividad estrógenica en muestras sintéticas.
(Universidad de Concepción., 2019) Diaz Solis, Naysa Agneli; Peña Farfal, Carlos
Para lograr la mejor degradación foto y electroquímica de Estriol (E3) y Etinilestradiol (EE2) utilizando electrodo Ti/RuO2-Acero inoxidable, fue necesario realizar estudios preliminares, donde se evaluaron de forma univariada el efecto del pH; concentración de sustrato y electrolito soporte, potencial, configuración de puente salino, volumen de reactor, fuente de Luz , logrando buenos resultados a concentraciones de 500 μg L -1 de sustrato, volúmenes de 90 mL de solución, puente salino de 30 cm de longitud, voltajes entre 0,8 -3 A, concentración de Na2SO4 de 0,1 M, pH entre 6 -10, lámpara UV 125 W. Seguido a los estudios preliminares, se seleccionaron las variables; concentración de Na2SO4 (0,05-2,5 M), Voltaje (0,6-3) y pH (4-10), para realizar optimizaciones mediante la metodología de superficie de respuesta (MSR). Las condiciones óptimas encontradas para la degradación de 500 μg L-1 de solución de E3 y EE2, fueron: pH 10, concentración Na2SO4 0,05 M/0,1353 M, voltaje 1,6/1,5 A, obteniendo degradaciones de 47-64 % (E3/EE2) por Electroxidación, 85-95% (E3/EE2) por Fotoelectroxidación, con mineralizaciones de un 29 % (Electroxidación) y 84% (Fotoelectroxidación). Además, se realizaron pruebas post tratamiento que dieron cuenta de la efectividad del tratamiento aplicado (E-Screen), los cuales mostraron casi nula estrogenicidad a los 180 minutos de reacción por Fotoelectroxidación a diferencia de Electroxidación donde la actividad estrogénica es predominante hasta finales de la reacción. Los resultados obtenidos por los procesos electroquímicos fueron comparados con el tratamiento Foto Fentón, el cual al igual que los anteriores fue optimizado para la degradación de E3 y EE2, logrando las mejores condiciones de degradación a una concentración de 4-5 mg L-1 de H2O2 y Fe (II), con degradaciones de 82-90 % (E3/EE2) y mineralizaciones de un 31%. Por último, se evaluó la extracción de los analitos por Microextracción por sorción con disco rotatorio (RDSE), desde aguas servidas, logrando los mejores resultados bajo las siguientes condiciones: 100 mg de fase HLB, un volumen de 100 mL de muestra, velocidad de rotación para el disco de 3000 rpm, tiempo de extracción y desorción superiores a una hora. Bajo estas condiciones se obtuvieron recuperaciones superiores al 87 %, con coeficientes de variación inferiores al 10%. Los límites de detección de estas hormonas en HPLC-DAD fueron de 1,6 µgL -1 para Estriol y de 1,4 µg L -1 para Etinilestradiol. La determinación y cuantificación de hormonas en aguas servidas arrojo como resultado la presencia de Estriol y 17 α- Etinilestradiol a concentraciones de 103-75 μg L-1 en afluente, y concentraciones de 0,56-0,7 μg L-1 en aguas provenientes del tratamiento secundario, por lo que se justifica el presente estudio.
Desarrollo de una plataforma científica tecnológica para estudiar el proceso de clarificación de vinos orientada a disminuir la prevalencia de agentes clarificantes con potencial alergénico.
(Universidad de Concepción., 2019) Pavón Pérez, Jessy; Aranda Bustos, Mario Antonio; Henríquez Aedo, Karem
La caseína y la ovoalbúmina son usadas habitualmente como agentes clarificantes durante el proceso de elaboración del vino, con el objetivo de promover interacciones con compuestos no deseados como algunos polifenoles y taninos. Este tipo de proteínas pueden desencadenar reacciones alérgicas en individuos susceptibles, por tanto su presencia en vinos puede ser un riesgo para la salud humana, especialmente cuando su presencia no está reportada o indicada en la etiqueta. Es por esto que la Unión Europea estableció a través de su Directiva 2003/89/EC, actualizada en el año 2012 Directiva 2012/579/EC que las concentraciones mayores a 0.25 mg L-1 deben ser declaradas en la etiqueta. De ahí la necesidad de contar con técnicas con un alto poder de resolución que proporcionen la información necesaria para el análisis de estas proteínas en vino. En la presente tesis doctoral se demuestra el enorme poder que tiene la cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masa para la identificación y cuantificación de péptidos de caseína y ovoalbúmina en vinos. La extracción de las proteínas desde la matriz vino se realizó combinando el uso de membranas de ultracentrifugación y precipitación con solventes orgánicos. En particular el análisis se desarrolló a partir de la estrategia de trabajo bottom-up. El paso limitante de esta metodología son los largos tiempos de digestión enzimática que se requieren (12-24 horas). Debido a que varios factores (tiempo, temperatura, relación concentración enzima:proteína, etc) pueden afectar el rendimiento de la digestión tríptica la estrategia más eficiente es aplicar herramientas qumiométricas para su optimización. Se empleó un Diseño Central Compuesto para optimizar la digestión con tripsina aplicando una temperatura de 37oC y energías del infrarrojo, microondas y ultrasonido. Cada método fue evaluado a partir de SDS-PAGE y del % de sequence coverage (SQ) arrojado por la base de datos Mascot. En todos los casos fue posible disminuir los tiempos de digestión y aumentar su rendimiento. Para la determinación de los péptidos resultantes fue desarrollado, implementado y validado un método UHPLC-DAD-ESI-MS/MS el cual en conjunto con la comparación de los resultados teóricos arrojados por las bases de datos Swiss-Prot y Mascot permitió la identificación y cuantificación de un péptido marcador para la -caseína, -caseína y la ovoalbúmina en 60 muestras comerciales de vinos chilenos, empleando como estándar interno un péptido marcado isotópicamente. De las muestras analizadas 17 presentaron concentraciones de estas proteínas en un valor cercano o superior a lo regulado por la OIV, por consiguiente se hace necesario establecer normativas que normalicen su uso en Chile. Con la finalidad de lograr una mayor identificación de péptidos marcadores de caseína y ovoalbúmina en los vinos se desarrolló un método UHPLC-ESI-Q/TOF, identificándose y cuantificándose 5 péptidos para -caseína, 4 para -caseína, uno para -caseína y 3 para ovoalbúmina. Esto evidencia las ventajas de emplear analizadores de masa híbridos de alta resolución en los análisis proteómicos. La separación e identificación de los péptidos marcadores en vinos se realizó también mediante HPTLC-ESI-MS. El uso de esta herramienta analítica, permitió detectar de manera rápida dos bandas características de la -caseína y ovoalbúmina. Explorando alternativas para reducir o evitar el uso de estos clarificantes se realizó un estudio químico-analítico utilizando bentonita, tierras de diatomea, caseína y ovoalbúmina.Se evaluó su influencia sobre el color, turbidez, antocianinas y polifenoles del vino. En aras de no añadir al vino agentes exógenos se evaluó también la capacidad de eliminar caseína y ovoalbúmina por una membrana de ultracentrifugación con flujo cruzado y tamaño de poro de 10kDa. En vinos tratados con estas proteínas no se encontraron péptidos característicos luego de ser sometidos al proceso de filtración.
Implementación de una plataforma analítica HPTLC-bioensayo-MS de efecto dirigido para la identificación de compuestos bioactivos en chirimoya (Annona cherimola Mill.).
(Universidad de Concepción., 2019) Galarce Bustos, Oscar Francisco; Aranda Bustos, Mario Antonio; Arráez Román, David
El chirimoyo/a (Annona cherimola Mill.) es un árbol pequeño cultivado en diferentes países incluido Chile. Este árbol produce un fruto conocido como chirimoya que ha sido largamente utilizado en medicina tradicional. Algunas actividades biológicas beneficiosas para la salud humana han sido demostradas mediante ensayos in vitro, sin embargo son pocos los estudios que individualizan los compuestos que ejercen la bioactividad. El estudio de los componentes bioactivos de la chirimoya permitiría descubrir moléculas con potencial terapéutico para enfermedades crónicas no transmisibles, otorgando de esta manera un valor agregado a la fruta y subproductos generados. Para la determinación de compuestos bioactivos fue desarrollada e implementada una plataforma analítica HPTLC-bioensayo-MS de efecto dirigido que permite la determinación e identificación in situ de compuestos bioactivos mediante un flujo de trabajo simple y directo, que permite un screening general de la composición de piel, pulpa y semilla de chirimoya. El uso de esta herramienta analítica, permitió detectar en la piel de chirimoya tres compuestos con actividad inhibitoria sobre la enzima acetilcolinesterasa, que luego fueron analizados mediante HPTLC-MS y UHPLCDAD-MS/MS. Los compuestos fueron identificados como anonaina, glaucina, y un tercer candidato como xilopina, siendo por primera vez reportada la capacidad inhibitoria de estos alcaloides. Aplicando el mismo sistema, tres fenolamidas presentes en piel y semilla fueron detectadas e identificadas como inhibidores de a-glucosidasa, las cuales corresponden a N-trans-feruloil tiramina, N-trans-p-coumaroil tiramina y N-trans-feruloil fenetilamina, siendo primera vez que se reporta esta bioactividad así como la presencia de este último en chirimoya. Los compuestos antioxidantes presentes en extracto de piel y semilla fueron detectados vía ensayo HPTLC-DPPH, y la capacidad antioxidante fue cuantificada a partir del mismo ensayo mediante procesamiento de imagen digital usando el software ImageJ. Los compuestos que presentaron una mayor actividad, expresada como equivalentes de ácido cafeico, fueron estudiados directamente mediante un análisis TLC-MS y clasificados preliminarmente como como acetogeninas y fenolamidas. De esta manera, el ensayo HPTLC-DPPH-MS resultó en una metodología completa que permite detectar, cuantificar e identificar compuestos antioxidantes, estableciendo la aplicabilidad del procesamiento de imagen digital sobre otras metodologías HPTLC-bioensayo. El trabajo realizado logró establecer también un extracto de piel de chirimoya con destacada actividad inhibitoria de AChE, a-glucosada y capacidad antioxidante, obtenido mediante una metodología optimizada de extracción por fluidos supercríticos. La presencia de algunos de los compuestos, caracterizados en la plataforma analítica, fue cuantificada mediante un análisis UHPLC-ESI-MS. Adicionalmente, hojas de diferentes variedades de chirimoya fueron evaluados con la misma metodología, estableciendo su potencial como fuente de alcaloides inhibidores de AChE. En resumen, la aplicación de la plataforma analítica permitió evaluar el potencial de sub-productos de la agroindustrial, piel y semilla, como fuente de compuestos bioactivos con potencial terapéutico.
Desarrollo e implementación de metodologías espectroscópica y quimiométricas para controles de la calidad y de procesos productivos de medicamentos en la industria farmacéutica
(Universidad de Concepción., 2020) Pino Torres, César Lorenzo; Castillo Felices, Rosario; Peña Farfal, Carlos
La industria farmacéutica es un sector industrias que necesita estar en constante evolución en cuanto a tecnologías de análisis se refiere. Esto le permite crecer de forma exitosa, optimizar la productividad de los análisis y cumplir con las especificaciones que los organismos reguladores demandan para la calidad requerida de los productos. En este contexto, la industria farmacéutica demanda técnicas analíticas que cumplan con las características mencionadas, incluyendo metodologías rápidas, sencillas y que garanticen resultados confiables Las técnicas espectroscópicas, en especial la espectroscopía de infrarrojo cercano y la espectroscopía Raman, presentan una serie de ventajas en relación a las técnicas instrumentales convencionales utilizadas por el sector industrial, como lo son las cromatográficas. Dentro de estas ventajas se destaca la rapidez de los análisis, puesto que no es necesario el tratamiento de la muestra, la ausencia de consumo de reactivos, la mínima formación del personal de laboratorio y el bajo coste de mantenimiento. El desarrollo de nuevos métodos analíticos basados en técnicas espectroscópicas para ser utilizadas en el control del proceso y ensayos de la calidad de los productos finales, es el principal objetivo de este trabajo de investigación. Bajo esta premisa se realizó un estudio crítico de distintos métodos cualitativos y cuantitativos aplicables en la monitorización del proceso de mezclado farmacéutico y la detección de su punto final mediante espectroscopía de infrarrojo cercano (NIRS) y espectroscopía Vis-NIR. El estudio reveló información importante respecto al avance tecnológico para estas tareas, ayudando a definir el método más adecuado para determinar el punto final en los procesos de mezclados estudiados, ya que no todos los métodos obtuvieron la misma sensibilidad ni la misma facilidad de implementación, característica relevante para análisis en línea. Respecto a las metodologías cuantitativas para el análisis de comprimidos farmacéuticos terminados, los resultados mostraron que los modelos desarrollados para espectroscopía NIR y Raman poseen una capacidad predictiva adecuada con los requerimientos exigidos por los organismos reguladores. Por lo que las metodologías desarrolladas se han aplicado para la determinación de la uniformidad de las unidades de dosificación en dos lotes comerciales. Además, la aplicación de espectroscopía Raman permitió la detección de una distribución inapropiada de ingredientes activos en productos farmacéuticos. Los estudios realizados en esta tesis proporcionaron un conjunto de pautas metodológicas basadas en técnicas espectroscópicas para realizar el control de parámetros críticos en la producción de comprimidos farmacéuticos, demostrando la factibilidad para ser utilizadas en controles de rutinas o de calidad en los laboratorios de producción.
Desarrollo de una plataforma científica tecnológica para la identificación de compuestos bioactivos desde arrayán (luma apiculata) y evaluación del efecto de la nanoencapsulación sobre su bioaccesibilidad.
(Universidad de Concepción., 2020) Carrasco Sandoval, Jonathan; Von Baer Von Lochow, Dietrich; Aranda Bustos, Mario
Las Enfermedades Crónicas No Transmisibles (ECNT) son la principal causa de morbimortalidad del país y representan un problema nacional e internacional de salud pública. Como resultado, muchas especies nativas/autóctonas han sido estudiadas por su potencial fuente de compuestos fenólicos, los cuales pueden contribuir a la prevención y/o tr7atamiento de dichas enfermedades. Dentro de las especies nativas reconocidas por sus propiedades medicinales se encuentra el arrayán (Luma apiculata), cuyos compuestos bioactivos presentes en el fruto y la hoja podrían ser un aporte relevante para disminuir el riesgo de padecer ECNT. Sin embargo, los estudios reportados de esta especie son muy escasos. En consecuencia, el presente trabajo de investigación tuvo como objetivo principal desarrollar metodologías químico-analíticas para obtener datos científicos que sustenten la característica funcional del fruto y hoja del arrayán y preservar los compuestos bioactivos identificados mediante el empleo de la nanotecnología. Como paso previo al trabajo con arrayán, se desarrolló y optimizó un proceso de extracción asistida de ultrasonido de compuestos fenólicos desde semilla de quinoa. Basándose en este procedimiento, fue establecido y optimizado el proceso de extracción de dichos compuestos desde frutos y hojas de arrayán mediante extracción asistida por ultrasonido en baño ultrasónico. Esta optimización contempló un diseño factorial completo y un diseño central compuesto. Con las condiciones de extracción optimizadas, se evaluó la capacidad antioxidante de los extractos crudos y extractos ricos en compuestos fenólicos obtenidos por adsorción selectiva sobre la resina polimérica Amberlita XAD-7. La capacidad antioxidante se evaluó mediante dos metodologías: 2,2- Difenil-1- picrilhidrazilo (DPPH) y capacidad antioxidante reductor del hierro (FRAP). Además, se determinó el contenido de fenoles totales mediante la metodología de Folin-Ciocalteu (TPC). De acuerdo con los ensayos realizados, quedó en evidencia que los extractos de fruto y hoja de arrayán presentan una elevada concentración de compuestos fenólicos y una alta capacidad antioxidante, en especial, los extractos ricos en compuestos fenólicos. Para establecer el perfil fenólico de los extractos crudos, se implementó un método por cromatografía líquida de ultra-alta eficiencia (UHPLC) acoplada a espectrometría de masas (MS). El análisis cromatográfico, reveló la presencia de siete compuestos fenólicos en el extracto crudo de fruto de arrayán (quercetin 3-β-D glucósido, miricetina, quercetina, ácido p-cumárico, kaempferol glucósido, ácido gálico y kaempferol) y cinco compuestos fenólicos en el extracto crudo de hoja (quercetina 3-ß-D-glucósido, kaempferol 3-glucósido, miricetina, quercetina y ácido gálico). Considerando el perfil fenólico y el efecto antimicrobiano reportado para algunos de los compuestos fenólicos identificados, se determinó la actividad antiviral de extractos crudos (30% etanol) sobre el virus de la hepatitis A y norovirus murino, principales virus entéricos asociados a contaminación alimentaria. El extracto de hoja presentó un efecto antiviral significativo sobre ambos virus, mientras que el extracto de fruto tuvo un efecto moderado sobre el virus de la hepatitis A. Luego de establecer el perfil fenólico, estándares de los compuestos fenólicos puros fueron sometidos a un proceso de digestión gastrointestinal in vitro para estudiar la bioaccesibilidad de dichos compuestos. Paralelamente, se evaluó la potencialidad de tres sistemas nanoparticulados (nanopartículas de zeina, zeína recubierta de alginato y zeína recubierta de complejo alginato/quitosano), los cuales fueron obtenidos mediante los métodos de nanoprecipitación y deposición electrostática. La fracción bioaccesible de los compuestos bioactivos fue determinada mediante cromatografía líquida de alta eficiencia asociada a detección UV (HPLC/UV). Los compuestos fenólicos presentaron una limitada bioaccesibilidad, que varió entre un 3.4 y 16.1%, mientras que los tres sistemas nanoparticulados incrementaron significativamente la bioaccesibilidad de todos los compuestos fenólicos, en especial, las nanoparticulas de zeina recubiertas con complejo de alginato/quitosano, la cual varió entre un 65.8 y 84.0%. Finalmente, se implementó una plataforma científica-tecnológica por HPTLC/(bio)autografía/MS para detectar e identificar en los extractos crudos de fruto y hoja de arrayán compuestos con actividad antioxidante e inhibitoria sobre las enzimas α-glucosidasa y acetilcolinesterasa, consideradas como blancos terapéuticos para tratar la diabetes mellitus tipo 2 y enfermedades neurodegenerativas, respectivamente. El extracto de hoja sólo presentó bandas con actividad antioxidante, mientras que el extracto de fruto presentó un compuesto con marcada actividad antioxidante e inhibitoria sobre ambas enzimas, el cual fue identificado tentativamente mediante la interfaz TLC-MS como fraxetina (hidroxicumarina). Estos resultados permiten sustentar la característica funcional del fruto y hoja de arrayán, además de demostrar el potencial de la nanotecnología (sistemas nanoparticulados) en la preservación de los compuestos responsables de dicha funcionalidad.
Desarrollo de técnicas preparativas de separación cromatográficas para confirmar la actividad biológica de las plantas chilenas Peumus boldus y Buddleja globosa mediante la sustracción química de sus compuestos bioactivos.
(Universidad de Concepción., 2020) Torres Vega, Jeniffer Paulina; Vergara Rosales, Carola Andrea
Las plantas medicinales Peumus boldus (boldo) y Buddleja globosa (matico) son ampliamente utilizadas en medicina popular, debido a que producen metabolitos secundarios que serían los responsables de sus actividades biológicas. Los solventes naturales eutécticos profundos (NADES) tuvieron una buena eficiencia para extraer polifenoles desde el matico (verbascosido y 7-O-glucósido de luteolina) siendo el NADES L-prolina: acido cítrico y cloruro de colina: 1.2-propanodiol los solventes más efectivos. Así también para el boldo se obtuvieron buenos resultados para la extracción de alcaloides siendo el NADES Prolina: ácido oxálico el que mostró mayor aumento en la extracción de boldina superando 8 veces a la extracción con metanol. Por otro lado, debido a que no está 100% comprobado la actividad de boldo y matico, es que se decide sustraer selectivamente sus compuestos bioactivos utilizando CPC y refinamento zona de pH-CPC, pudiendo de esta forma aislar los alcaloides (knock-out polifenoles) y los polifenoles (knock-out alcaloides). Un total de 9 alcaloides fueron identificados y 22 polifenoles para el boldo y para el matico se pudo sustraer 3 fracciones denominadas knock-out 1 (extracto que contiene verbascósido como compuesto mayoritario), knock-out 2 (extracto que contiene forsitósido como compuesto mayoritario) y knockdown (extracto reducido en fenilpropanoides) y también se identificaron 17 compuestos, de los cuales 13 es primera vez que han sido reportados. La identidad de estos compuestos se confirmó a través de HPLC-Q-TOF. De los extractos diseñados para el matico se comprobó que el compuesto forsithoside B, tiene un gran poder antioxidante al igual que el verbascosido, por lo que esté compuesto también contribuye a está actividad, con respecto a los ensayos celulares (migración celular) no permitieron evidenciar efectos claros para ninguno de los extractos. Por otro lado, los extractos diseñados de boldo permitieron comprobar que el extracto alcaloideo presenta una citotoxicidad y genotoxicidad moderada y también para la actividad inhibitoria en el ensayo inhibición de la acetilcolinesterasa. Por otro lado, se pudo corroborar que los polifenoles presentes en el boldo serían los responsables de su actividad antioxidante, esto se comprobó en el ensayo cometa en donde estos no tuvieron una genotoxicidad significativa, sino que tienen efectos citoprotectores.
Innovaciones Analíticas en Sistemas Miniaturizados de Extracción para la Determinación de Drogas y Fármacos en Muestras Biológicas.
(Universidad de Concepción, 2022) Vejar Vivar, Carmina Beatriz; Mardones Peña, Claudia
The complexity of biological matrices and the constat appearance of new drugs make toxicology a major analytical challenge. The need to increase the simplicity of the procedures and to reduce the environmental impact of chemical processes have encouraged the development of more efficient and sustainable analytical strategies. In this PhD Thesis, different analytical strategies for the detection of drugs in forensic matrices were developed. The main emphasis was placed on sample preparation processes and their instrumental coupling. The first method was developed for the analysis of antidepressants and benzodiazepines by direct coupling of a commercial microextraction device to a high-resolution mass spectrometer, thus reducing analysis times and the use of organic solvents. Two other methods focused on establishing the extractive capabilities of polydopamine. This polymer was used as coating material for microextraction devices in the analysis of antidepressants and drugs of abuse in saliva by mass spectrometry, without a previous chromatographic separation. Finally, a highly sensitive method was developed using ultra-high efficiency liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry as a screening method. Its application to postmortem blood samples from the Forensic Medical Service of Chile allowed the identification of drugs and metabolites from different pharmacological groups. These strategies allowed the efficient and relatively simple, analysis of drugs and pharmaceuticals in biological samples with a more environmentally friendly approach.

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