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Caracterización de medio enriquecido derivado de células madres para favorecer la reparación tisular en un modelo de animal con hiperglicemia
(Universidad de Concepción., 2017) Ormazabal Valladares, Valeska Alejandra; Aguayo Tapia, Claudio Rodrigo
En los últimos años, se ha habido un aumento de diabetes mellitus, la Federación Internacional de Diabetes (FDI), señala que en el 2013, 382 millones de personas tiene diabetes y se espera que llegue a 592 millones en el 2035. Chile es el país con mayor prevalencia de Diabetes en américa del sur con un 12,32% de la población con Diabetes. La Diabetes tiene una alta morbimortalidad, se estima que entre un 15-25% de los pacientes con Diabetes desarrollan Úlcera de Pie Diabético en alguna de sus extremidades inferiores, de estos entre un 10-30% sufrirá además una amputación. En este contexto, se hace necesario la búsqueda de herramientas terapéuticas innovadoras que permitan tratar en forma eficiente la úlcera de pie diabético y garantizar su curación total. Por otro lado, las células madres Mesenquimales han sido objeto de debido a su alto potencial de diferenciación, proliferación, plasticidad, baja inmunogenicidad y fácil cultivo. Trabajos previos de nuestro laboratorio permitieron demostrar la capacidad de las células mesenquimales de diferenciarse a células endoteliales. Además demostramos que estás células endoteliales tenían la capacidad de inducir angiogénesis y de acelerar el cierre de heridas en un modelo in vivo. Asociado a estos hallazgos, se logró demostrar que el potencial de regeneración de las células endoteliales estaba en factores solubles secretados al medio de cultivo. Nos preguntamos: Los factores secretados por células endoteliales podrán inducir un mayor cierre de la herida en un modelo animal con hiperglicemia. Hipótesis: Factores angiogénicos secretados al medio de cultivo, por células endoteliales favorecen el proceso de regeneración tisular en un modelo animal con hiperglicemia, inducido por dieta. Objetivo General: Evaluar la capacidad de regeneración tisular del medio condicionado endotelial en un modelo de herida de animal con hiperglicemia, inducida por dieta, e identificar los factores solubles involucrados en este efecto. Para ello realizaremos ensayos de herida in vitro e in vivo utilizado un modelo animal de hiperglicemia inducido por dieta, además analizamos del medio de cultivo por array de factores secretados e isoelectroenfoque líquido acoplado a masa. Resultados: Nuestros resultados indican que el medio condicionado endotelial, incrementa la velocidad de cierre de la herida in vivo en un modelo animal con hiperglicemia inducida por dieta. Sin embargo en los ensayos in vitro el medio condicionado endotelial no logra inducir cierre de la herida. Los ensayos de proliferación celular in vitro muestran que el medio condicionado endotelial incrementa en un 30% la proliferación celular. Por otro lado utilizando ensayos de array e isoelectroenfoque liquido acoplado a masa, pudimos identificar factores solubles con potencial de ser los involucrados en el aumento del cierre de herida. Finalmente podemos concluir que no solo las células madres son responsables de su potencial en regeneración de tejidos, si no también los factores secretados por éstas.
Caracterización del transporte de adenosina en células progenitoras de endotelio humano.
(Universidad de Concepción., 2010) Guzmán Gutiérrez, Enrique Alberto; Aguayo Tapia, Claudio Rodrigo
Las células progenitoras endoteliales (EPC) son células derivadas de la médula ósea, que pueden proliferar y diferenciarse en células endoteliales maduras. En esta diferenciación participa el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), el cual es liberado en condiciones de hipoxia, siendo regulado por la concentración extracelular de adenosina. Este nucleósido, actúa como un agente protector en condiciones de isquemia, mediante la activación de receptores de membrana, es por esto que las células cuentan con sistemas transportadores que regulan la concentración extracelular de adenosina. Los transportadores de nucleósidos se clasifican en dos grandes familias: i. Transportadores de nucleósidos equilibrativos (ENT), los cuales se subdividen de acuerdo a su sensibilidad a Nitrobenciltioinosina (NBTI); ii. Transportadores de nucleósidos concentrativos (CNT), los cuales son dependientes de sodio, y se subdividen de acuerdo a los tipos de nucleósidos transportados. No existen estudios que demuestren la expresión de transportadores de nucleosidos en células madres humanas adultas. Es por esto que, el objetivo general de esta tesis es: Caracterizar el transporte de adenosina y expresión de transportadores de nucleosidos (NT) en células progenitoras endoteliales humanas y determinar el efecto de la diferenciación sobre la expresión de NT. Nuestros resultados demuestran que las células progenitoras endoteliales (hEPCs) expresan los sistemas hENT1 y hCNT3 funcionales, pero no hENT-2, hCNT1, y hCNT2, en las diferentes etapas de diferenciación. El transporte de nucleósidos equilibrativo fue inhibido por NBTI en hEPC cultivadas por 3 días (hEPC-3d), pero solo parcialmente reducido a los 14 días de cultivo (hEPC-14d). 10 Los niveles de proteína y mRNA para hENT-1 disminuyen en hEPC-14d comparado con hEPC-3d, pero los niveles de mRNA para hCNT3 aumentan en hEPC-14d. Además, se demostró un incremento de la expresión de marcadores endoteliales, asociado a una disminución en la expresión de marcadores de células madres indiferenciadas en las etapas de cultivo estudiadas. En hEPC-3d, el transporte de adenosina mediado por hENT-1 fue saturable e independiente de sodio, mientras que en hEPC-14d el transporte de adenosina fue insensible a NBTI, semi-saturable, y mediado por dos componentes de transporte. El componente 1, de alta afinidad fue independiente de sodio e inhibido por NBTI, característico de un transportador tipo hENT1; y el componente 2, baja afinidad, no inhibido por NBTI, dependiente de sodio, y de la concentración de protones (pH) y posee una estequiometría sodio-adenosina de 2 : 1, todo lo cual sugiere la presencia de un transportador tipo hCNT3. Estos resultados representan las primeras evidencias que demuestran que células progenitoras endoteliales humanas transportan adenosina principalmente mediado por hENT-1, cuya actividad disminuye en hEPC-14d. Pero además, en hEPC-14d, existe un aumento en la expresión y actividad del transportador dependiente de Na+ , compatible con sistema tipo hCNT3. Estos resultados permiten sugerir que cambios en el estado de diferenciación de EPC hacia un fenotipo endotelial, podría asociarse con cambios en el patrón de expresión de transportadores de nucleósidos.
Caracterización fenotípica y funcional de células endoteliales transdiferenciadas desde células Mesenquimales aisladas de gelatina de Wharton humana.
(Universidad de Concepción., 2013) Aguilera Rudolph, Valeria Constanza; Aguayo Tapia, Claudio Rodrigo
Las células madres adultas han generado enormes expectativas en el contexto de la medicina regenerativa, especialmente las células madres mesenquimales (MSCs) las cuales son muy atractivas debido a su alto potencial de diferenciación, proliferación, plasticidad, baja inmunogenicidad y fácil cultivo, convirtiéndolas en una excelente fuente celular para la reparación de tejidos. Recientemente, se ha descrito que las MSCs aisladas de médula ósea, poseen la capacidad de transdiferenciarse hacia células con fenotipo endotelial, siendo capaces de migrar y participar en la neovascularización del tejido con injuria. Sin embargo, la médula ósea como fuente de aislamiento de MSCs, presenta limitaciones importantes, por esto, se han buscado fuentes alternativas para obtención de estas células, dentro de estas la gelatina de Wharton de cordón umbilical es considerada una excelente fuente de MSCs con alta capacidad de proliferación y de baja inmunogenicidad, ya que, no expresan antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Recientemente, se ha descrito que las MSCs aisladas de gelatina de Wharton humana (hWMSCs) pueden transdiferenciarse hacia células con fenotipo endotelial in vitro, pero no se ha demostrado su capacidad para sintetizar óxido nítrico y su contribución en procesos de neovascularización in vivo. El objetivo de esta tesis es evaluar en un modelo de ratón la capacidad angiogénica de células con fenotipo endotelial transdiferenciadas a partir de células mesenquimales provenientes de gelatina de Wharton humana. Para esto, en esta tesis se aislaron y cultivaron MSCs de gelatina de Wharton humana y se transdiferenciaron a células con fenotipo endotelial, posteriormente fueron caracterizadas morfológica, fenotípica y funcionalmente, mediante la evaluación de la expresión de marcadores endoteliales y la actividad de sintasa de óxido nítrico endotelial (eNOS), además se determinó la capacidad de formar estructuras tubulares en Matrigel in vitro y regeneración de lesiones tisular in vivo. En este trabajo se logró aislar células mesenquimales desde gelatina de Wharton humana, las cuales cumplen con todos los criterios estipulados por la Sociedad internacional de terapia celular (ISCT) para definir a una célula mesenquimal como tal. Las hWMSCs son capaces de diferenciarse hacia adipocitos, osteocitos y condrocitos 11 además expresan los marcadores mesenquimales CD90, CD73 y CD105. Las hWMSCs son capaces de transdiferenciarse hacia células con fenotipo endotelial (hWMSCs endotelial). Las hWMSCs-endotelial expresan los marcadores endoteliales CD31 y KDR. Los ensayos de conversión de L-[3H]arginina a L-[3H]citrulina, muestran que la formación de L-citrulina es mayor en hWMSCs-endoteliales 30 días en comparación a hWMSCs endoteliales 14 días y hWMSCs. Esto resultados son coherentes con un aumento significativo en la biodisponibilidad de óxido nítrico en hWMSCs-endoteliales de 14 y 30 días en relación a hWMSCs, sugiriendo que a medida que las células hWMSCs se transdiferencian hacia un fenotipo endotelial, la síntesis de óxido nítrico (NO) aumenta. Por otro lado, los estudios en el modelo de neovascularización in vivo, indica que los animales tratados con hWMSCs-endoteliales presentan mayor score histológico, número y área de vasos sanguíneos en comparación con ratones tratados con hWMSCs. Finalmente, ensayos de inmunohistoquímica muestran que las hWMSCs, pero en mayor medida hWMSCs-endoteliales 30 días se incorporan al tejido de cicatrización sugiriendo que el efecto tisular es mediado por las células implantadas o por los factores producidos por las células. Nuestros resultados representan las primeras evidencias que demuestras que las células mesenquimales aisladas de gelatina de Wharton humana son capaces de transdiferenciarse a células con fenotipo endotelial (hWMSCs-endoteliales) con capacidad de sintetizar óxido nítrico y de favorecer procesos de neovascularización in vivo en modelo de ratón.
Contribución de los receptores de adenosina en células progenitoras endoteliales al proceso de angiogénesis.
(Universidad de Concepción., 2019) Oporto Palma, Katherine Alejandra; Aguayo Tapia, Claudio Rodrigo
Las células progenitoras endoteliales (EPC) son un tipo de células madres adultas que se localizan en la médula ósea y en sangre periférica y tienen la capacidad de diferenciarse en endotelio adquiriendo sus marcadores de superficie característicos. Las EPC se han visto involucradas en procesos de angiogénesis y proliferación celular mediados por la activación del receptor 2 para el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), promoviendo la movilización tanto de las células endoteliales maduras como de EPC desde médula ósea o sangre periférica hacia el sitio de isquemia e hipoxia. Se han descrito dos poblaciones de células progenitoras endoteliales humanas (hEPC), las tempranas y tardías. Las hEPC tempranas se caracterizan por su capacidad para secretar factores angiogénicos que estimulan la formación de nuevos vasos sanguíneos, mientras que las hEPC tardías poseen un fenotipo endotelial y se caracterizan por su capacidad para formar vasos sanguíneos. Por otra parte, en condiciones de hipoxia e isquemia, no sólo ocurre proliferación y migración de EPC, si no también liberación de adenosina y la activación de sus receptores los cuales modulan la respuesta isquémica. El nucleósido adenosina cumple un rol cardio protector, ya que participa activamente en la regulación de procesos de angiogénesis y vasculogénesis. Además, está involucrada en otros procesos como la modulación del sistema inmune, vasodilatación, regulación del flujo sanguíneo y la oxigenación de los tejidos. Estos fenómenos ocurren en el microambiente de los tejidos de acuerdo a las necesidades metabólicas locales y dependen de la activación de una serie de receptores de membrana asociados a proteína G. A la fecha se han reportado 4 tipos de receptores, denominados A1, A2A, A2B y A3. Resultados previos demuestran el efecto de adenosina sobre la migración y movilización de EPC y además, sugieren que este nucleósido podría modular la capacidad angiogénica de las EPC. Sin embargo, se desconoce el mecanismo mediante el cual adenosina podría modular la capacidad angiogénica de las EPC, se sugiere que la secreción de VEGF y/o liberación de exosomas podrían contribuir en este proceso. En esta tesis se ha establecido que las células progenitoras endoteliales de tres días de cultivo (hEPC-3d) responde a NECA (activador general de los receptores de adenosina) favoreciendo la liberación del factor angiongenico VEGF, que contribuye a la formación de estructuras capilares. Además, se han aislado y caracterizado parcialmente las microvesículas secretadas por las EPC y en respuesta a activadores de los receptor de adenosina. También, se ha demostrado que las microvesículas contribuyen a la formación de estructuras tipo capilares in vitro y aumentan la capacidad de proliferación de las células ECV-304. Estos resultados son la primera evidencia que demuestra la interrelación entre adenosina y hEPC, puesto que ambos componentes poseen roles centrales en los procesos de vaso regeneración en el organismo. En base a los resultados se puede establecer que adenosina modula la función de las hEPC-3d mediante .
Efecto de adenosina sobre la movilización y angiogénesis in vitro de células progenitoras endoteliales humanas.
(Universidad de Concepción, 2011) Fernández Garcés, Paulina Carola Tálitha; Aguayo Tapia, Claudio Rodrigo
El nucleósido adenosina, cumple un rol protector en procesos de isquemia, ya que participa activamente en angiogénesis y vasculogénesis. Estos fenómenos ocurren en el microambiente de los tejidos de acuerdo a las necesidades metabólicas locales. El efecto de adenosina, depende de la activación de una serie de receptores de membrana asociados a proteína G. A la fecha se han reportado cuatro tipos de receptores de adenosina, denominados A1, A2A, A2B y A3. Estos receptores tienen la propiedad de estimular o inhibir la adenilciclasa con el concomitante aumento o disminución del AMP ciclico intracelular. Adenosina, también está involucrada en otros procesos como la modulación del sistema inmune, vasodilatación, regulación del flujo sanguíneo y la oxigenación de los tejidos. En condiciones de hipoxia e isquemia, no sólo la liberación de adenosina y la activación de sus receptores son importantes en modular la respuesta isquémica, sino también que el Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF) el cual induce proliferación y migración de células endoteliales maduras y Células Progenitoras Endoteliales (EPCs). Las EPCs son un tipo de células madres adultas, localizada en la médula ósea y en sangre periférica y tienen la capacidad de diferenciarse en endotelio adquiriendo sus marcadores de superficie característicos. Las EPCs han sido involucradas en procesos de angiogénesis y proliferación celular mediados por la activación del receptor 2 para el VEGF, promoviendo la movilización tanto de las células endoteliales maduras como de EPC desde médula ósea o sangre periférica hacia el sitio de la lesión. Sin embargo, no existe evidencias que relacionen EPC y adenosina en los procesos de movilización y angiogénesis, por lo tanto el objetivo de esta tesis fue: “Caracterizar la diferenciación, movilización y angiogénesis de las células Progenitoras Endoteliales en cultivo frente a adenosina”. Nuestros resultados demostraron que las células progenitoras endoteliales a tres días de cultivo (hEPC-3d) expresan marcadores de superficie característicos de una célula inmadura con fenotipo endotelial, además expresan tres de los cuatro receptores de adenosina (A2A, A2B y A3). Adenosina y NECA (agonista no selectivo de los receptores de adenosina) aumentan la movilización de las hEPC-3d, fenómeno bloqueado con ZM241385 y parcialmente bloqueado con MRS1523, por lo tanto, el principal receptor involucrado en la movilización correspondería al receptor A2A (EC50  0,4 nM). Adenosina no induce cambios en la proliferación y diferenciación de las hEPC-3d, sin embargo, sí estimula la adhesión de hEPC-3 en comparación con el control. Finalmente, las hEPC-3d no forman estructuras tipo capilares, sin embargo, estas células se incorporan a estructuras tubulares formadas por la línea celular de endotelio ECV-304, dando lugar a la formación de una estructura tubular de mayor diámetro en comparación con el control. Adenosina potencia el efecto de las hEPC-3d sobre esta formación capilar de las ECV-304. Nuestros resultados representan las primeras evidencias que demuestran que las células progenitoras endoteliales expresan receptores de adenosina (A2A, A2B, A3) y además sugieren que este nucleósido está involucrado en los fenómeos de movilización y adhesión de estas células, favoreciendo procesos de angiogénesis y/o vasculogénesis. Estos resultados permiten sugerir que la interacción entre adenosina y los receptores presentes en las hEPC-3d representan un paso fundamental en los fenómenos de reparación fisológica frente a fenómenos de isquemia o hipoxia.
Efecto de loxin sobre la expresión de lox-1 y formación de la placa aterosclerótica en ratones alimentados con una dieta alta en grasa
(Universidad de Concepción., 2018) Reyes Vivero, Camila de los Ángeles; Aguayo Tapia, Claudio Rodrigo
La aterosclerosis es una condición clínica asociada a acumulaciones de lípidos y presencia de componentes trombogénicos, inflamatorios y muerte celular, que llevan finalmente al desarrollo de la enfermedad cardiovascular (ECV). Las ECV son una de las causas más importantes de morbilidad y mortalidad a nivel mundial, siendo la aterosclerosis y la acumulación de lípidos en la pared arterial el origen de esta patología. Una etapa fundamental en el proceso aterosclerótico son las modificaciones oxidativas que sufren las lipoproteínas de baja densidad (LDL) circulantes, lo cual es crucial para el desarrollo temprano de la lesión e inicio de la disfunción endotelial y aterosclerosis. El efecto proaterogénico inducido por oxLDL es mediado por la interacción con el receptor de Lectina Tipo-1 para Lipoproteínas de Baja Densidad Oxidadas (LOX-1), el que se encuentra expresado en todos los tipos celulares involucrados en el desarrollo del proceso aterosclerótico, como células endoteliales, musculares lisas y macrófagos. La interacción del receptor con su ligando, produce la activación de diferentes vías de señalización intracelular que modulan procesos de apoptosis y proliferación celular. Se ha descrito una variable trunca del receptor LOX-1, llamado LOXIN, que carece del exón 5 y parte del dominio Lectina tipo-C, que contribuye a la interacción con su ligando; producto de esto, el heterodímero LOX-1/LOXIN es inactivo, no internaliza oxLDL y no produce activación de las vías de señalización, siendo así un modulador de los efectos dañinos producto de la activación de LOX-1 En estudios recientes, se ha observado que existe una disminución en la apoptosis de células endoteliales en presencia conjunta de LOX-1/LOXIN. Esta evidencia ha sido de interés biomédico ya que eventualmente se podría prevenir o detener el desarrollo de la aterosclerosis. Sin embargo, se desconoce si su sobreexpresión podría ejercer un rol protector en un modelo de animal aterogénico. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo es investigar si la disminución en la expresión o inactivación de LOX-1 previene la aterosclerosis en ratones alimentados con una dieta alta en grasas. Nuestros resultados muestran que la sobreexpresión LOXIN en células H4-II-E-C3 disminuyó la incorporación de Apo B100. Por otra parte, al evaluar el efecto protector de LOXIN en ratones C57BL6 alimentados con una dieta alta en grasas hubo una baja expresión de LOX-1 en presencia del vector AdoLOXIN en órganos como corazón, hígado y pulmón. Análisis histológicos de la arteria aorta mostraron que en presencia de LOXIN hay una disminución en el área de lesión de la arteria acompañado de una disminución en la expresión de LOX-1 en lumen y pared vascular. Por lo tanto, LOXIN estaría ejerciendo un rol protector de la aterosclerosis mediante la disminución de la expresión de LOX-1
Efecto de sueros de pacientes con hipercolesterolemia sobre la biodisponibilidad de óxido nítrico y la producción de especies reactivas del oxígeno en células endoteliales de vena de cordón umbilical humano.
(Universidad de Concepción., 2008) Searle Medina, Andrea Valentina; Aguayo Tapia, Claudio Rodrigo
Las enfermedades cardiovasculares son una patología compleja, que involucra la participación de diferentes componentes tanto celulares como moleculares y factores de riesgo tales como hiperlipidemia, hipertensión y tabaquismo, todo lo cual lleva a una disfunción endotelial. Dentro de estos factores de riesgo, uno de los más prevalentes en nuestra población es la hipercolesterolemia o aumento del colesterol plasmático, condición que se ha demostrado en diversos estudios tanto in vitro como in vivo que produce disfunción endotelial, lo cual se observa como una menor respuesta vasodilatadora en pacientes con altos niveles de LDL. Así también, esta disfunción endotelial se ha relacionado con un aumento en la formación de especies reactivas del oxígeno (ROS), disminución en la expresión de la sintasa del óxido nítrico endotelial (eNOS) y desacoplamiento de la eNOS, cuyo efecto final es un aumento del estres oxidativo, una disminución en la biodisponibilidad de óxido nítrico (NO) y un aumento en el riesgo cardiovascular. Entonces, considerando que la disfunción endotelial esta presente en todas las etapas de la aterosclerosis y en la evolución de la enfermedad cardiovascular, se puede utilizar al endotelio como un marcador pronóstico de riesgo cardiovascular. Basados en estos antecedentes, en el presente estudio se determinó el efecto de oxLDL y sueros de pacientes con hipercolesterolemia, sobre la biodisponibilidad de NO y la producción de ROS en células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs). Nuestros resultados demuestran una menor biodisponibilidad de NO y mayor producción de ROS en células incubadas con oxLDL o sueros de pacientes con hipercolesterolemia en comparación con aquellas expuestas a nLDL o sueros de 8 individuos con niveles normales de colesterol. Además, los niveles de proteínas c reactiva ultrasensible (marcador de inflamación) se correlaciona en forma positiva y significativa con el índice de masa corporal (r = 0.342, p< 0,05), así también una correlación significativa de la capacidad antioxidante con la circunferencia de cintura (r = 0.360, p< 0,05), sin existir diferencias significativas en la capacidad antioxidante o los niveles de proteína c reactiva ultrasensible entre ambos grupos. Estos resultados sugieren que oxLDL y los sueros de pacientes con hipercolesterolemia inducirían disfunción endotelial mediada por un incremento en la producción de las especies del oxígeno y una disminución en la biodisponibilidad de NO que estaría relacionada con los altos niveles de colesterol plasmático, específicamente con altos niveles de lipoproteínas de baja densidad. Finalmante estas evidencias permiten sugerir que el modelo celular de endotelio humano puede ser utilizado como biosensor de riesgo cardiovascular, para evaluar procozmente a una población de riesgo.
Identificación del gen CEBPα en pacientes con leucemia mieloide aguda y su potencial uso clínico.
(Universidad de Concepción, 2023) Rivera Fuentes, Juan Carlos; Aguayo Tapia, Claudio Rodrigo; Chandía, Mauricio
Acute myeloblastic leukemia (AML) arises from the accumulation of mutations in hematopoietic stem cells, resulting in a disruption of cell differentiation, apoptosis, and increased proliferation. One of the notable molecular alterations involves point mutations in the CEBPα gene, which have been associated with a favorable prognosis in terms of overall survival and event-free survival. Patients with CEBPα mutations tend to exhibit better treatment responses compared to those without these mutations. Although the clinical guide for leukemic patients issued by the Ministry of Health acknowledges the molecular study of the CEBPα gene in adults, it is currently unavailable for this age group as well as pediatric patients in any public clinical laboratory specializing in molecular biology. This limitation primarily stems from the absence of standardized polymerase chain reaction (PCR) techniques for amplifying the CEBPα gene. The gene's coding region presents a high guanine (G) and cytosine (C) base content (> 65%) and includes a trinucleotide repeat sequence, posing challenges in the amplification process. Successful amplification of the CEBPα gene necessitates a comparison and selection of DNA extraction techniques and the standardization of PCR conditions based on the gene's characteristics. Developing a comprehensive protocol encompassing amplification and sequencing will enable the characterization of the CEBPα gene in AML patients. An observational cross-sectional cohort study was conducted during the first semester of 2021. A non-probability convenience sampling method was employed, and an initial sample of three AML-free volunteers was included. Subsequently, DNA extraction was performed on peripheral blood and bone marrow samples from ten AML patients. The extraction techniques were evaluated based on DNA concentration, purity, cost, and time. PCR was then conducted to amplify the CEBPα gene in both healthy individuals and AML patients, using both published and newly designed primers. The amplification protocol underwent evaluation by adjusting annealing temperatures and incorporating adjuvants such as DMSO at varying concentrations. Agarose gel electrophoresis was utilized to assess the integrity and amplified DNA. Finally, the amplified regions were sequenced using the Sanger method, establishing a comprehensive protocol for studying the CEBPα gene. Among the evaluated extraction techniques, the salt extraction method employed on concentrated leukocyte samples demonstrated the most optimal performance. Significant statistical differences (p<0.005) in DNA concentration were observed compared to the column technique. PCR standardization successfully accomplished the amplification of the complete coding region of the CEBPα gene using a single set of primers, as well as fragment amplification using two sets of primers. The optimal annealing temperatures for all primer pairs were determined to be 62 and 64 °C, and the use of 3% and 8% DMSO facilitated the generation of single bands in agarose gel electrophoresis. The sequencing method employed was the Sanger method, which yielded optimally sequenced products for the amino terminal region, enabling the elaboration of a consensus sequence. Standardizing the DNA extraction, PCR, and sequencing techniques for studying the CEBPα gene will provide valuable diagnostic information for AML patients, equipping clinicians with improved tools to make informed decisions regarding appropriate therapy in this context.

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