Browsing by Author "Castro Maldonado, Patricio Alejandro"
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Item Efectos de Ivermectina sobre el proceso de neurulación en Xenopus laevis. Posible rol de receptores purinérgicos P2X4.(Universidad de Concepción, 2024) Catrupay Valdebenito, Claudio Joaquín; Castro Maldonado, Patricio Alejandro; Burgos Arias, Carlos FelipeLa neurulación es un proceso crucial para conformar el sistema nervioso central (SNC) en cordados, que implica el pliegue de la placa neural para formar el tubo neural, estructura que dará origen a todas las células del SN. Para el desarrollo adecuado de este proceso, es necesaria una fina comunicación entre las células precursoras neurales, que regulan los eventos requeridos como migración, diferenciación, proliferación, entre otros. Existen receptores purinérgicos ionotrópicos (P2Xn) y metabotrópicos (P2Yn), los que son activados por ATP y otros nucleótidos para establecer la “señalización purinérgica” en procesos como la neurulación, expansión de células progenitoras, neurogénesis, crecimiento y maduración axonal. Los defectos de tubo neural (DTNs) son producto de un cierre defectuoso del tubo neural y representan los principales defectos congénitos del sistema nervioso. El uso de anticonvulsivos durante el embarazo, como el ácido valproico, se ha vinculado con los DTNs. Por lo tanto, es necesario evaluar el perfil de seguridad de los anticonvulsivos, especialmente durante el desarrollo neural temprano. Para evaluar la participación de la señalización purinérgica en Xenopus laevis durante neurulación, utilizamos ivermectina (IVM), un modulador alostérico positivo (PAM) de los receptores P2X4 humanos utilizado ampliamente para tratar infecciones parasitarias y recientemente propuesto como anticonvulsivo. Por ello, el objetivo de este seminario de título fue determinar los efectos en la formación del sistema nervioso temprano (DTN) y características fenotípicas de la unión neuromuscular y la actividad locomotora de embriones de Xenopus laevis expuestos a la presencia de Ivermectina durante el proceso de neurulación. Para ello usamos distintas metodologías como técnicas de biología molecular como RT-qPCR, Western blot, técnicas farmacológicas como exposición a IVM en distintas concentraciones, técnicas bioinformáticas a través de la construcción de modelos y docking y por último técnicas histológicas para la evaluación de las estructuras que conforman la unión neuromuscular. Nuestros resultados demostraron la expresión del receptor purinérgico P2X4 durante un periodo crítico del desarrollo embrionario, y predicciones de su interacción utilizando modelos generados mediante modelamiento comparativo confirmaron sus capacidades in silico para unir IVM. Asimismo, la aplicación de IVM produjo defectos de tubo neural abierto en los embriones tratados, junto con un aumento en el área (80,90 ± 5,270 mm2) y cantidad de melanocitos relativos (49,60 ± 10,02) en comparación con los controles. Observamos además parálisis locomotora en 92% de los embriones tratados. Se evidenció la presencia de transcritos de los factores de transcripción asociados a diferenciación de motoneuronas NKX 6.1 y HB9, acompañados de cambios morfológicos en las estructuras de la unión neuromuscular, difusión en los receptores de acetilcolina, posible activación de procesos de autofagia y múltiples núcleos alargados en las fibras musculares en los embriones tratados. Considerando estos resultados, proponemos que los receptores P2X4 serian modulados por IVM, estableciendo un mecanismo de acción a través de liberación de Ca2+, activando la señalización purinérgica, responsable los efectos mencionados.Item Evaluación de la presencia y actividad del sistema endocannabinoide, y los receptores PPAR y TRPV1 en el proceso de neurulación de X. laevis.(Universidad de Concepción, 2024) Torres Toro, Angel Javier; Castro Maldonado, Patricio Alejandro; Burgos Arias, Carlos FelipeEn la actualidad se ha asociado epidemiológicamente al consumo de marihuana durante la gestación, con la aparición de las principales malformaciones congénitas del Sistema Nervioso Central (SNC), donde se encuentran los Defectos del tubo neural (DTN) (Reece & Hulse, 2019). Comprender acerca de la influencia de fitocannabinoides como Tetrahidrocannabinol (THC) y Cannabidiol (CBD), la participación de la señalización endocannabinoide y como esta interviene en el desarrollo del SNC, específicamente, en el proceso de neurulación, es esencial para comprender como los cannabinoides pueden inducir la presencia de DTN. De lo anterior, el objetivo del presente trabajo es determinar la participación del Sistema endocannabinoide (SEC) y de algunos posibles blancos de acción directos e indirectos (receptor cannabinoide 1 (CB1), receptor activado por proliferadores de peroxisomas alfa (PPARα), receptor activado por proliferadores de peroxisomas gama (PPARγ) y receptor de potencial transitorio sensible a la temperatura, subtipo vanilloide 1 (TRPV1)) de moléculas cannabinoides durante el proceso de neurulación en Xenopus laevis a través de experimentos de RT-qPCR, la elaboración de modelos bioinformáticos predictivos y tratamientos farmacológicos. Nuestros resultados indican la presencia de todos los transcritos de interés evaluados (CB1, N-acil fosfatidiletanolamina fosfolipasa D (NAPE-PLD), diacilglicerol lipasa alfa (DAGL), PPARα, PPARγ y TRPV1) en el proceso de neurulación de Xenopus laevis. La elaboración de modelos predictivos bioinformáticos indica que CBD interaccionaría con CB1 y PPARα, al igual que GW6471 con PPARα, ambas drogas con parámetros similares entre las proteínas humanas y de Xenopus. Luego, la administración de CBD afecta el cierre correcto del Tubo neural (TN) de manera dependiente de la 13 concentración y la administración de GW6471 un antagonista de PPARα sugiere que este fármaco no tiene efectos teratogénicos en los embriones al ser administrado en neurulación. En conclusión, los resultados nos señalan que la señalización endocannabinoide participaría durante el proceso de neurulación de Xenopus laevis y que su alteración por medio de la presencia de CBD podría inducir malformaciones que se evidencian en estadios larvales posteriores.Item Origen evolutivo y participación funcional de la comunicación glutamatérgica durante el proceso de neurulación en Xenopus laevis.(Universidad de Concepción, 2021) Zúñiga Soto, Nicolás Andrés; Castro Maldonado, Patricio Alejandro; Aguilera Muñoz, Felipe EleanderEn humanos, la sinapsis excitatoria glutamatérgica participa en procesos de aprendizaje y memoria, y cumple un rol importante en el establecimiento del sistema nervioso durante el desarrollo embrionario. La liberación de glutamato como neurotransmisor ha sido descrita además en distintas especies de animales, como moscas, gusanos y ratones. La señalización sináptica glutamatérgica en estas especies depende de la participación de transportadores vesiculares de glutamato o VGLUTs, que acumulan glutamato en vesículas sinápticas, en un proceso altamente controlado por señales reguladoras de iones cloruro y protones, así como por motivos endocíticos de reciclaje. Sin embargo, la historia evolutiva de VGLUT y su importancia durante el desarrollo embrionario y consolidación del funcionamiento del sistema nervioso permanece desconocida. En la presente tesis, se presenta un estudio filogenético de los VGLUTs, comprendiendo 111 especies de eucariontes, así como un estudio ontogénico de la señalización de glutamato mediada por VGLUTs para establecer su importancia durante el desarrollo embrionario temprano del sistema nervioso o neurulación del cordado Xenopus laevis. Los resultados pro ponen una evolución secuencial de la señalización de glutamato vesicular, con el surgimiento de la interacción con glutamato en el último ancestro común de los animales cnidarios-bilaterados, mientras que la capacidad de formar vesículas emerge en el último ancestro común de los animales bilaterados. Al evaluar como VGLUT participa en neurulación, observamos que la disrupción de la comunicación glutamatérgica mediante VGLUT genera un cierre anormal del tubo neural, provocado por cambios en la migración celular de las células que alterarían el establecimiento y posterior funcionamiento correcto del sistema nervioso en X. laevis. Estos resultados en conjunto permiten proponer la correlación e importancia del surgimiento de la señalización de glutamato vesicular con la formación de sistemas nerviosos organizados y condensados, en donde a nivel evolutivo, surge junto a la reorganización anatómica y sofisticación funcional del sistema nervioso, lo que explicaría la relevancia de la señalización de glutamato para la formación correcta del sistema nervioso central durante el desarrollo.Item Participación y rol de conexinas en la liberación de ATP en el proceso de neurulación en Xenopus laevis.(Universidad de Concepción, 2020) Tovar, Lina Mariana; Castro Maldonado, Patricio AlejandroLa neurulación es un proceso crucial en la formación del sistema nervioso central (SNC), y corresponde a uno de los primeros eventos de desarrollo embrionario en vertebrados (3 ra semana de gestación en humanos y 14,5 a 21,5 horas en Xenopus laevis). Este proceso comienza con el plegamiento y fusión de la placa neural que dará lugar a la formación de tubo neural y posterior desarrollo del cerebro y medula espinal, involucrando procesos como la migración y proliferación celular. Alteraciones en este proceso generan defectos del tubo neural (DTN), los que pueden ser causados por factores ambientales y genéticos. Las conexinas (Cxs) son una familia de 21 proteínas transmembrana que forman hemicanales (HCs) y uniones comunicantes (gap junction) en vertebrados. Varios estudios han demostrado la participación de hemicanales en la comunicación celular permitiendo la liberación de ATP, glutamato y NAD+ , moléculas que regulan la migración celular y estabilizan la transmisión sináptica. Por otro lado, se ha demostrado que cambios en el estado de fosforilación y/o cambios en el potencial redox intracelular activan la apertura de hemicanales en diferentes tipos celulares. Algunas Cxs (Cx46, Cx43, Cx32 y Cx26) han sido asociadas a procesos de proliferación, migración y diferenciación en diferentes etapas de desarrollo, sugiriendo una participación dinámica de estas proteínas durante el desarrollo del SNC. La hipótesis de esta tesis pretende elucidar si los hemicanales formados por conexinas (ej., GJα3/GJβ1) participan en la liberación de ATP desde células de la placa neural durante el proceso de neurulación en Xenopus laevis. Los datos obtenidos en esta tesis permiten demostrar: (i) la presencia relevante de Cx46, Cx32, en estadios de neurulación y que su bloqueo farmacológico con CBX y ENX ocasiona defectos en el cierre del tubo neural (DTN). (ii) Las Cxs son funcionales como hemicanales y participan en la liberación de ATP, y su apertura es regulada transitoriamente por FGF2 y/o potenciales redox intracelulares (DTT), desencadenado potencialmente la activación de la señalización purinérgica. Por último, a través de estudios in silico se determinó dos posibles sitios (sitio N y sitio E) de interacción entre Cx46/CBX y Cx46/ENX, los cuales se localizan en los dominios N-terminal y EL2 sitos altamente conservados entre las distintas isoformas de Cxs. Con este trabajo de tesis se genera una aproximación del rol de los hemicanales de Cxs y los mecanismos moleculares involucrados en su apertura durante el proceso de neurulación, y que en este caso involucran la regulación de la vía de señalización de FGF2, potenciales redox intracelulares y eventualmente la señalización purinérgica. Proponemos que, los hemicanales de Cxs regulan la liberación de ATP y eventualmente otras moléculas como glutamato en el proceso de neurulación y que su bloqueo farmacológico participa en la generación DTN, que serían ocasionados por alteraciones en la señalización purinérgica y/o glutamatérgica.Item Presencia de aminoácidos básicos en el dominio citoplasmático de los receptores de glicina y GABAa son críticos para modulación por Gβy y etanol.(Universidad de Concepción, 2012) Castro Maldonado, Patricio Alejandro; Aguayo Hernández, Luis GerardoEl etanol es una de las drogas de abuso mas ampliamente utilizadas a nivel mundial generando cuantiosas pérdidas de dinero así como de vidas humanas debido a su consumo. ¿Cómo el etanol, a concentraciones fisiológicamente relevantes (< 100 mM), es capaz de producir sus efectos tanto a nivel sistémico como a nivel celular? y ¿cuáles son los determinantes para que estos efectos se produzcan? son aún desconocidos. Se ha descrito que esta droga modula a los receptores de glicina (R-Gli), GABAA (R-GABAA), GABAC (R-GABAC), serotonina tipo 3 (5-HT3) y nicotínicos de acetilcolina (R-nACh), los cuales pertenecen a la superfamilia de los canales iónicos activados por ligando (Cys-loop LGICs). Estudios realizados en animales han demostrado una importante participación de los receptores de R-Gli y RGABAA en algunos efectos sistémicos como la inducción de sueño, lo que da relevancia a su estudio, así como su participación en importantes funciones fisiológicas que van desde el control motor hasta la generación de complejas funciones cognitivas. Proteínas intracelulares también han sido vinculadas a los efectos del etanol, dentro de las cuales encontramos a las adenilil ciclasas (AC), la proteína quinisa A (PKA), la proteína quinasa C (PKC), la fosfolipasa C (PLC) y recientemente a proteínas G. Estos dos blancos para la acción del etanol (receptores y proteínas intracelulares) han sustentado la generación de dos hipótesis que han tratado de explicar los efectos de esta droga a nivel celular. La primera de ellas se refiere a la acción directa del etanol en los receptores tipo canales iónicos, mientras que la segunda hipótesis contempla una modulación indirecta de estos receptores a través de proteínas efectoras intracelulares, las cuales serían en primera instancia el blanco del etanol. La modulación del R-Gli por etanol ha sido ampliamente descrita y aceptada, a diferencia del R-GABAA, donde los numerosos estudios realizados no han logrado establecer un mecanismo de acción común. En el R-Gli se han identificado residuos claves de carácter básico (316-320, 385-386) presentes en el ICD, los cuales serían cruciales para que esta modulación se lleve a cabo. A su vez, la activación de Gβγ es crítica para la sensibilidad al etanol en este receptor. En el RGABAA existen sub-unidades que poseen agrupaciones de aminoácidos básicos homólogos a los encontrados en la sub-unidad α1 del R-Gli en su dominio intracelular, lo cual permite postular un mecanismo similar de modulación al encontrado en el R-Gli. Por lo anterior es que nos propusimos estudiar si residuos básicos presentes en los dominios intracelulares de los R-Gli y R-GABAA participan en la interacción y modulación efectuada por Gβγ y etanol. Para evaluar esta hipótesis realizamos experimentos de sobrexpresión de la subunidad α1 del R-Gli WT y mutantes del residuo 385K con aminoácidos con diferentes propiedades fisicoquímicas, encontrando que solo aminoácidos básicos (K y R) mantienen la sensibilidad a etanol no alterándose la sensibilidad a otros moduladores como neuroesteroides o anestésicos generales como α-xalona y propofol respectivamente, donde todas las mutantes se expresan y comportan farmacológicamente similares al receptor WT. Para el caso del R-GABAA, evaluamos la asociación de algunas de sus subunidades con Gβγ, encontrando un patrón gradual de unión, donde la subunidad α1 une Gβγ en forma similar a α1 del R-Gli; las subunidades γ2 y α6 lo hacen en menor grado, mientras que α4 no presenta unión. Posteriormente, decidimos construir una proteína quimérica entre las subunidades α1 del R-Gli y la subunidad γ2 del R-GABAA, lo cual identificó a 2 regiones importantes para la modulación por etanol en este receptor. Una de ellas comprende al dominio TM4, que tendría implicancia en el gating del canal, mientras la segunda ubicada en el dominio N-terminal del IL entre los residuos 309 y 313 sería importante para preservar una estructura α-hélice de la región. Finalmente, la posición homóloga a 385K en el R-Gli (408 en el receptor quimérico) es fundamental para reestablecer el efecto de etanol en el receptor α1-γ2. Todos estos hallazgos demuestran que la presencia de: i) un gating energéticamente favorable, ii) una estructura α-hélice en la región N-terminal de IL y iii) un residuo básico en la posición homóloga 385 del R-Gli son fundamentales para conferir sensibilidad a etanol en este receptor. En conclusión, podemos decir que el carácter básico del residuo 385 es crucial para la sensibilidad a etanol en α1 R-Gli, mientras el R-GABAA posee subunidades capaces de interaccionar con Gβγ en forma similar a α1 R-Gli, lo cual podría revelar un mecanismo de modulación similar para ambos receptores.