Browsing by Author "Castro Maldonado, Patricio Alejandro"
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Item Evaluación de la presencia y actividad del sistema endocannabinoide, y los receptores PPAR y TRPV1 en el proceso de neurulación de X. laevis.(Universidad de Concepción, 2024) Torres Toro, Angel Javier; Castro Maldonado, Patricio Alejandro; Burgos Arias, Carlos FelipeEn la actualidad se ha asociado epidemiológicamente al consumo de marihuana durante la gestación, con la aparición de las principales malformaciones congénitas del Sistema Nervioso Central (SNC), donde se encuentran los Defectos del tubo neural (DTN) (Reece & Hulse, 2019). Comprender acerca de la influencia de fitocannabinoides como Tetrahidrocannabinol (THC) y Cannabidiol (CBD), la participación de la señalización endocannabinoide y como esta interviene en el desarrollo del SNC, específicamente, en el proceso de neurulación, es esencial para comprender como los cannabinoides pueden inducir la presencia de DTN. De lo anterior, el objetivo del presente trabajo es determinar la participación del Sistema endocannabinoide (SEC) y de algunos posibles blancos de acción directos e indirectos (receptor cannabinoide 1 (CB1), receptor activado por proliferadores de peroxisomas alfa (PPARα), receptor activado por proliferadores de peroxisomas gama (PPARγ) y receptor de potencial transitorio sensible a la temperatura, subtipo vanilloide 1 (TRPV1)) de moléculas cannabinoides durante el proceso de neurulación en Xenopus laevis a través de experimentos de RT-qPCR, la elaboración de modelos bioinformáticos predictivos y tratamientos farmacológicos. Nuestros resultados indican la presencia de todos los transcritos de interés evaluados (CB1, N-acil fosfatidiletanolamina fosfolipasa D (NAPE-PLD), diacilglicerol lipasa alfa (DAGL), PPARα, PPARγ y TRPV1) en el proceso de neurulación de Xenopus laevis. La elaboración de modelos predictivos bioinformáticos indica que CBD interaccionaría con CB1 y PPARα, al igual que GW6471 con PPARα, ambas drogas con parámetros similares entre las proteínas humanas y de Xenopus. Luego, la administración de CBD afecta el cierre correcto del Tubo neural (TN) de manera dependiente de la 13 concentración y la administración de GW6471 un antagonista de PPARα sugiere que este fármaco no tiene efectos teratogénicos en los embriones al ser administrado en neurulación. En conclusión, los resultados nos señalan que la señalización endocannabinoide participaría durante el proceso de neurulación de Xenopus laevis y que su alteración por medio de la presencia de CBD podría inducir malformaciones que se evidencian en estadios larvales posteriores.Item Presencia de aminoácidos básicos en el dominio citoplasmático de los receptores de glicina y GABAa son críticos para modulación por Gβy y etanol.(Universidad de Concepción., 2012) Castro Maldonado, Patricio Alejandro; Aguayo Hernández, Luis GerardoEl etanol es una de las drogas de abuso mas ampliamente utilizadas a nivel mundial generando cuantiosas pérdidas de dinero así como de vidas humanas debido a su consumo. ¿Cómo el etanol, a concentraciones fisiológicamente relevantes (< 100 mM), es capaz de producir sus efectos tanto a nivel sistémico como a nivel celular? y ¿cuáles son los determinantes para que estos efectos se produzcan? son aún desconocidos. Se ha descrito que esta droga modula a los receptores de glicina (R-Gli), GABAA (R-GABAA), GABAC (R-GABAC), serotonina tipo 3 (5-HT3) y nicotínicos de acetilcolina (R-nACh), los cuales pertenecen a la superfamilia de los canales iónicos activados por ligando (Cys-loop LGICs). Estudios realizados en animales han demostrado una importante participación de los receptores de R-Gli y RGABAA en algunos efectos sistémicos como la inducción de sueño, lo que da relevancia a su estudio, así como su participación en importantes funciones fisiológicas que van desde el control motor hasta la generación de complejas funciones cognitivas. Proteínas intracelulares también han sido vinculadas a los efectos del etanol, dentro de las cuales encontramos a las adenilil ciclasas (AC), la proteína quinisa A (PKA), la proteína quinasa C (PKC), la fosfolipasa C (PLC) y recientemente a proteínas G. Estos dos blancos para la acción del etanol (receptores y proteínas intracelulares) han sustentado la generación de dos hipótesis que han tratado de explicar los efectos de esta droga a nivel celular. La primera de ellas se refiere a la acción directa del etanol en los receptores tipo canales iónicos, mientras que la segunda hipótesis contempla una modulación indirecta de estos receptores a través de proteínas efectoras intracelulares, las cuales serían en primera instancia el blanco del etanol. La modulación del R-Gli por etanol ha sido ampliamente descrita y aceptada, a diferencia del R-GABAA, donde los numerosos estudios realizados no han logrado establecer un mecanismo de acción común. En el R-Gli se han identificado residuos claves de carácter básico (316-320, 385-386) presentes en el ICD, los cuales serían cruciales para que esta modulación se lleve a cabo. A su vez, la activación de Gβγ es crítica para la sensibilidad al etanol en este receptor. En el RGABAA existen sub-unidades que poseen agrupaciones de aminoácidos básicos homólogos a los encontrados en la sub-unidad α1 del R-Gli en su dominio intracelular, lo cual permite postular un mecanismo similar de modulación al encontrado en el R-Gli. Por lo anterior es que nos propusimos estudiar si residuos básicos presentes en los dominios intracelulares de los R-Gli y R-GABAA participan en la interacción y modulación efectuada por Gβγ y etanol. Para evaluar esta hipótesis realizamos experimentos de sobrexpresión de la subunidad α1 del R-Gli WT y mutantes del residuo 385K con aminoácidos con diferentes propiedades fisicoquímicas, encontrando que solo aminoácidos básicos (K y R) mantienen la sensibilidad a etanol no alterándose la sensibilidad a otros moduladores como neuroesteroides o anestésicos generales como α-xalona y propofol respectivamente, donde todas las mutantes se expresan y comportan farmacológicamente similares al receptor WT. Para el caso del R-GABAA, evaluamos la asociación de algunas de sus subunidades con Gβγ, encontrando un patrón gradual de unión, donde la subunidad α1 une Gβγ en forma similar a α1 del R-Gli; las subunidades γ2 y α6 lo hacen en menor grado, mientras que α4 no presenta unión. Posteriormente, decidimos construir una proteína quimérica entre las subunidades α1 del R-Gli y la subunidad γ2 del R-GABAA, lo cual identificó a 2 regiones importantes para la modulación por etanol en este receptor. Una de ellas comprende al dominio TM4, que tendría implicancia en el gating del canal, mientras la segunda ubicada en el dominio N-terminal del IL entre los residuos 309 y 313 sería importante para preservar una estructura α-hélice de la región. Finalmente, la posición homóloga a 385K en el R-Gli (408 en el receptor quimérico) es fundamental para reestablecer el efecto de etanol en el receptor α1-γ2. Todos estos hallazgos demuestran que la presencia de: i) un gating energéticamente favorable, ii) una estructura α-hélice en la región N-terminal de IL y iii) un residuo básico en la posición homóloga 385 del R-Gli son fundamentales para conferir sensibilidad a etanol en este receptor. En conclusión, podemos decir que el carácter básico del residuo 385 es crucial para la sensibilidad a etanol en α1 R-Gli, mientras el R-GABAA posee subunidades capaces de interaccionar con Gβγ en forma similar a α1 R-Gli, lo cual podría revelar un mecanismo de modulación similar para ambos receptores.