Presencia de aminoácidos básicos en el dominio citoplasmático de los receptores de glicina y GABAa son críticos para modulación por Gβy y etanol.
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Date
2012
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Publisher
Universidad de Concepción.
Abstract
El etanol es una de las drogas de abuso mas ampliamente utilizadas a nivel
mundial generando cuantiosas pérdidas de dinero así como de vidas humanas
debido a su consumo. ¿Cómo el etanol, a concentraciones fisiológicamente
relevantes (< 100 mM), es capaz de producir sus efectos tanto a nivel sistémico
como a nivel celular? y ¿cuáles son los determinantes para que estos efectos se
produzcan? son aún desconocidos.
Se ha descrito que esta droga modula a los receptores de glicina (R-Gli),
GABAA (R-GABAA), GABAC (R-GABAC), serotonina tipo 3 (5-HT3) y nicotínicos de
acetilcolina (R-nACh), los cuales pertenecen a la superfamilia de los canales
iónicos activados por ligando (Cys-loop LGICs). Estudios realizados en animales
han demostrado una importante participación de los receptores de R-Gli y RGABAA
en algunos efectos sistémicos como la inducción de sueño, lo que da
relevancia a su estudio, así como su participación en importantes funciones fisiológicas que van desde el control motor hasta la generación de complejas
funciones cognitivas.
Proteínas intracelulares también han sido vinculadas a los efectos del etanol,
dentro de las cuales encontramos a las adenilil ciclasas (AC), la proteína quinisa A
(PKA), la proteína quinasa C (PKC), la fosfolipasa C (PLC) y recientemente a
proteínas G.
Estos dos blancos para la acción del etanol (receptores y proteínas
intracelulares) han sustentado la generación de dos hipótesis que han tratado de
explicar los efectos de esta droga a nivel celular. La primera de ellas se refiere a la
acción directa del etanol en los receptores tipo canales iónicos, mientras que la segunda hipótesis contempla una modulación indirecta de estos receptores a
través de proteínas efectoras intracelulares, las cuales serían en primera instancia
el blanco del etanol.
La modulación del R-Gli por etanol ha sido ampliamente descrita y aceptada, a
diferencia del R-GABAA, donde los numerosos estudios realizados no han logrado
establecer un mecanismo de acción común. En el R-Gli se han identificado
residuos claves de carácter básico (316-320, 385-386) presentes en el ICD, los
cuales serían cruciales para que esta modulación se lleve a cabo. A su vez, la
activación de Gβγ es crítica para la sensibilidad al etanol en este receptor. En el RGABAA
existen sub-unidades que poseen agrupaciones de aminoácidos básicos
homólogos a los encontrados en la sub-unidad α1 del R-Gli en su dominio
intracelular, lo cual permite postular un mecanismo similar de modulación al
encontrado en el R-Gli.
Por lo anterior es que nos propusimos estudiar si residuos básicos
presentes en los dominios intracelulares de los R-Gli y R-GABAA participan
en la interacción y modulación efectuada por Gβγ y etanol.
Para evaluar esta hipótesis realizamos experimentos de sobrexpresión de la
subunidad α1 del R-Gli WT y mutantes del residuo 385K con aminoácidos con
diferentes propiedades fisicoquímicas, encontrando que solo aminoácidos básicos
(K y R) mantienen la sensibilidad a etanol no alterándose la sensibilidad a otros
moduladores como neuroesteroides o anestésicos generales como α-xalona y
propofol respectivamente, donde todas las mutantes se expresan y comportan
farmacológicamente similares al receptor WT. Para el caso del R-GABAA, evaluamos la asociación de algunas de sus
subunidades con Gβγ, encontrando un patrón gradual de unión, donde la
subunidad α1 une Gβγ en forma similar a α1 del R-Gli; las subunidades γ2 y α6 lo
hacen en menor grado, mientras que α4 no presenta unión. Posteriormente,
decidimos construir una proteína quimérica entre las subunidades α1 del R-Gli y la
subunidad γ2 del R-GABAA, lo cual identificó a 2 regiones importantes para la
modulación por etanol en este receptor. Una de ellas comprende al dominio TM4,
que tendría implicancia en el gating del canal, mientras la segunda ubicada en el
dominio N-terminal del IL entre los residuos 309 y 313 sería importante para
preservar una estructura α-hélice de la región. Finalmente, la posición homóloga a
385K en el R-Gli (408 en el receptor quimérico) es fundamental para reestablecer el
efecto de etanol en el receptor α1-γ2. Todos estos hallazgos demuestran que la
presencia de: i) un gating energéticamente favorable, ii) una estructura α-hélice en la región N-terminal de IL y iii) un residuo básico en la posición homóloga 385 del
R-Gli son fundamentales para conferir sensibilidad a etanol en este receptor.
En conclusión, podemos decir que el carácter básico del residuo 385 es crucial
para la sensibilidad a etanol en α1 R-Gli, mientras el R-GABAA posee subunidades
capaces de interaccionar con Gβγ en forma similar a α1 R-Gli, lo cual podría
revelar un mecanismo de modulación similar para ambos receptores.
Description
Tesis para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas. Mención Biología Celular y Molecular.
Keywords
Aminoácidos, Alcohol, Receptores GABA-A.