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Diseño y desarrollo de un sistema inmunocromatográfico para la detección del virus de la diarrea viral bovina.
(Universidad de Concepción, 2025) Gutiérrez Mella, Nicolás Antonio; Camacho Casanova, Frank; Toledo Alonso, Jorge Roberto
El virus de la diarrea viral bovina es un problema sanitario en los planteles bovinos alrededor del mundo. Actualmente, con el desarrollo de los métodos de diagnósticos, ha sido posible la implementación de programas de control y erradicación para este patógeno basados en la detección de animales persistentemente infectados (PI). En nuestro país, según el Servicio Agrícola y Ganadero, la infección con este virus es de notificación obligatoria, pero no existe ningún programa para el control de esta enfermedad y tampoco dispositivos que permitan la evaluación de los animales en terreno. El objetivo de este proyecto es el diseño y generación de un sistema de detección rápida por inmunocromatografía (tira reactiva o prueba de flujo lateral) para el virus de la diarrea viral bovina. Para esto se produjo la proteína de la cápside viral Erns de manera recombinante en células de insecto, con la cual se realizó la inmunización de ratones y gallinas para la obtención de anticuerpos monoclonales IgG y aviares IgY, respectivamente. Los anticuerpos monoclonales obtenidos se marcaron con nanopartículas de oro (AuNPs), y los anticuerpos aviares IgY anti rErns e IgG anti-ratón se imprimieron en una membrana de nitrocelulosa para el montaje final del sistema inmunocromatográfico. El ensayo de flujo lateral propuesto detecta hasta 25 ng de la proteína rErns demostrando que puede convertirse en una herramienta para el diagnóstico de animales PI con el VDVB.
Desarrollo de un andamiaje de matriz extracelular para modelos de cáncer óseo.
(Universidad de Concepción, 2024) Verdugo Avello, Francisco Javier; Toledo Alonso, Jorge Roberto
Los tumores y las metástasis en el tejido óseo son un problema sanitario relevante debido a su impacto en la salud y el bienestar. Los tumores óseos metastásicos y tumores malignos con un diagnóstico tardío presentan una tasa de supervivencia reducida, siendo inferior a un año para los pacientes metastásicos. Es urgente la necesidad de desarrollar medidas complementarias para mejorar la eficacia de las terapias farmacológicas actuales y también el reducir la duración del tratamiento para evitar una carga económica creciente en los pacientes y en el sistema sanitario. Los modelos óseos tridimensionales in vitro tienen la capacidad de simular al microambiente óseo en el laboratorio con la posibilidad de introducir células derivadas de pacientes a partir de biopsias de tejido de cáncer óseo para estudiar tratamientos personalizados que puedan conducir a terapias más efectivas y personalizadas para los pacientes. Sin embargo, para lograr una traslación clínica de los resultados in vitro se requiere de un biomaterial que pueda reproducir la fisiopatología del tejido óseo en sus propiedades que permita a las células adherirse, sobrevivir, expandirse y generar procesos de relación con la matriz extracelular. El objetivo de este trabajo fue el desarrollar un andamio tridimensional que simule la matriz extracelular ósea con la capacidad de biofabricación de modelos de tejido óseo in vitro que simulen patologías tumorales. Para esto se trabajó con células asociadas al cáncer óseo y otras relevantes para conformar modelos más complejos, tales como de cáncer de mama (MCF7), osteosarcoma (Saos2), pre-osteoblastos (MC3T3-E1) y cultivo primario (células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo). El modelo de ingeniería de tejidos se basó en un enfoque de hidrogel de gelatina metacrilada con el empleo de un componente biológico, en este caso micropartículas descelularizadas de hueso humano como parte de un biomaterial compuesto que fue validado mediante caracterización físico-químicas y biológicas. Se desarrolló un hidrogel compuesto por gelatina metacrilada y micropartículas óseas humanas con comportamiento pseudoplástico. Estas propiedades fueron validadas mediante procedimientos de bioimpresión, mientras que la presencia de micro y nanopartículas óseas se confirmó mediante microscopía electrónica. La biocompatibilidad del hidrogel se evaluó a través de diversos ensayos para la cuantificación de la citocompatibilidad, incluyendo análisis por imágenes y mediciones moleculares. No se registraron efectos tóxicos, lo que indica que las células pudieron adherirse y proliferar dentro del andamiaje, manteniendo su viabilidad durante un período de hasta 30 días en cultivos celulares tridimensionales. Además, las diferentes validaciones demostraron ser compatible con procesos clínicos para distintos tipos de análisis celulares y moleculares. El hidrogel compuesto desarrollado en este trabajo contribuye a la inovación en la ingeniería de tejidos en el área músculo esqueletal, específicamente de biofabricación de tejido óseo y al reemplazo de modelos animales para estudios del tejido óseo por la sustitución de modelos in vitro.
Desarrollo de un anticuerpo de afinidad mejorada contra el antígeno HspX con potencial diagnóstico para tuberculosis.
(Universidad de Concepción, 2025) Mangui Catota, Bryan Alexander; Camacho Casanova, Frank
La tuberculosis es la segunda causa de muerte debido a enfermedades infecciosas a nivel mundial. Según datos de la Organización Mundial de la Salud (OMS), en promedio cada año se reportan 10 millones de nuevos casos y 1.3 millones de decesos. La creciente carga sanitaria mundial de la tuberculosis se ve agravada por el alarmante incremento del número de personas infectadas con VIH y de cepas multirresistentes a antibióticos. El mejor pronóstico de la tuberculosis se obtiene con el diagnóstico temprano de la infección, no obstante, los métodos diagnósticos habitualmente empleados (microscópicos, microbiológicos y moleculares) presentan importantes limitaciones: sensibilidad y especificidad variables, diagnóstico subóptimo y, un gran consumo de tiempo y recursos. En el presente trabajo se mejoró la afinidad de un anticuerpo dirigido contra el antígeno HspX derivado de MTB mediante mutagénesis parsimoniosa. Para ello, se seleccionaron posiciones candidatas a mutagénesis de las regiones CDR basándose en el modelado estructural del anticuerpo. Se introdujeron mutaciones en dieciocho posiciones dentro de cada CDR objetivo utilizando la estrategia de mutagénesis parsimoniosa. Posteriormente, se generaron bibliotecas de variantes scFv mediante el método de Kunkel. Tras varias rondas de selección, se analizaron las potenciales variantes con afinidad mejorada, evaluando sus secuencias de CDR y sustituciones de aminoácidos. Este enfoque permitió identificar ocho variantes que aumentaron la afinidad del anticuerpo. La variante más prometedora exhibió un valor IC50 de 38 nM y tenía dos sustituciones: Lys50 y Glu50, dentro del CDR-H2, que reflejaron un aumento de 28,14 veces en la afinidad de unión con respecto al anticuerpo original. Estos hallazgos brindan información valiosa sobre la ingeniería de anticuerpos y podrían contribuir al desarrollo de ensayos diagnósticos más sensibles y confiables para la tuberculosis.
Efectos de la activación de calpaínas mediada por el receptor p2x2 sobre la vía amiloidogénica en la enfermedad de Alzheimer.
(Universidad de Concepción, 2025) Gavilán Gavilán, Javiera Andrea; Fuentealba Arcos, Jorge
La Enfermedad de Alzheimer (EA) es el principal tipo de demencia que afecta a la población adulto mayor. Se postula que el acontecimiento clave en la patogénesis de esta enfermedad es la acumulación de péptido beta-amiloide (Aβ), que produce muerte neuronal en áreas como el hipocampo, la amígdala y la corteza cerebral, causando un deterioro cognitivo severo. Previamente, nuestro grupo demostró que tanto los aumentos en el Ca2+ intracelular, así como la disminución en los niveles proteínas sinápticas y en la viabilidad neuronal, inducidos por Aβ, eran prevenidos con un antagonista de los receptores purinérgicos P2X (P2XR). Y que, específicamente la subunidad P2X2R incrementa su expresión luego de la exposición crónica a Aβ, receptor que es altamente permeable a Ca2+. Entre las proteínas que participan en vías de señalización intracelular dependientes de Ca2+ están las calpaínas; proteasas citosólicas que pueden participar en la proteólisis de algunos sustratos para potenciar la formación de Aβ en la EA. Dados los antecedentes, en esta tesis nos propusimos estudiar la actividad de calpaínas mediada por la activación de los receptores purinérgicos P2X2 para determinar su impacto sobre la vía amiloidogénica y formación de Aβ, en modelos de sobreexpresión de P2X2R. Nuestros estudios en células PC-12 muestran que la activación de P2X2R produce un aumento específico en los niveles de calpaína-1 (146±6%), mientras que los niveles de calpaína-2 y el inhibidor de calpaínas endógeno: calpastatina, no se vieron afectados. La actividad proteasa de calpaínas también incrementó significativamente debido a la degradación de sus principales sustratos: espectrina (64±5%), p35 (128±3%), y el sustrato fluorescente de calpaínas Ac LLY-AFC (158±9%). A su vez, la proteólisis de p35 produjo el fragmento p25, que activa de forma permanente a la quinasa neuronal dependiente de ciclina 5 (Cdk5). Esta quinasa aumentó los niveles de STAT3 fosforilado (363±38%), un factor de transcripción de regulación positiva para BACE1; enzima que cumple un rol clave en la vía amiloidogénica de la proteína precursora amiloide (APP). En efecto, encontramos niveles elevados de BACE1 (124±5%), y el péptido Aβ (159±4%), que se evitaron con el uso del inhibidor de calpaínas MDL-28170. Niveles elevados de P2X2R (120±2%) y calpaína-1 (168±9%), también se encontraron en el hipocampo de ratones transgénicos APP/PS1. Sumado a la degradación de espectrina (68±5%) y p35 (165±13%), y niveles elevados de pSTAT3 (166±17%) que se asociaron con altos niveles de BACE1 (151±12%) y Aβ (132±6%), lo que implica que el eje de activación P2X2R/calpaína-1 está desregulado en este modelo animal de la EA, y probablemente contribuyendo a la acumulación de Aβ. Además, estos resultados mostraron tener una correlación con los aumentos en los niveles de P2X2R (176±22%) y calpaína-1 (150±12%) observados en muestras de corteza prefrontal de pacientes post-mortem con EA, específicamente en fracciones enriquecidas en membranas presinápticas, donde la mayor expresión de P2X2R podría contribuir a la actividad incrementada de calpaína-1 y la consecuente potenciación de la vía amiloidogénica. En resumen, nuestros resultados nos permiten proponer al eje P2X2R/calpaína 1 como un elemento relevante en la fisiopatología de la EA. Nuestros datos apuntan a un mecanismo de retroalimentación positiva, donde el péptido Aβ incrementa la expresión de P2X2R para producir más Aβ intracelular, y este incremento estaría mediado por un mecanismo dependiente de calpaína-1. Esto podría representar un punto de partida novedoso en la elaboración de nuevas estrategias terapéuticas que contribuyan al tratamiento de la EA.
Efecto de ácido dehidroascórbico sobre la activación de RIPK1, durante la degeneración de neuritas.
(Universidad de Concepción, 2024) Magdalena Parra, Rocío Fernanda; Nualart Santander, Francisco Javier
En el SNC, la vitamina C se encuentra fundamentalmente como ácido ascórbico (AA), su forma reducida, molécula que actúa como agente antioxidante en el cerebro y cuya homeostasis se mantiene debido al acoplamiento neurona astrocito, donde AA ingresa a las neuronas y es oxidado a ácido dehidroascórbico (DHA), el cual es liberado al medio extracelular y reciclado por los astrocitos, permitiendo la mantención de las concentraciones de vitamina C en el parénquima cerebral. Sin embargo, condiciones patológicas agudas que incrementen los niveles de especies oxidantes pueden favorecer la generación extracelular de DHA, cuya acumulación lleva a modificaciones en el metabolismo neuronal y la muerte necroptótica, dada por la activación de RIPK1, proteína de andamiaje fuertemente regulada y que ha sido asociada a la progresión de la esclerosis lateral amiotrófica (ALS); sin embargo, se desconoce si bajo estas condiciones crónicas, DHA puede llevar a la activación de RIPK1 y a la pérdida de neuritas y axones. Utilizando neurosferas in vitro, evaluamos el efecto de DHA sobre las neuritas, detectando una reducción significativa en su largo y ramificación, efecto prevenido tanto por la inhibición de RIPK1 como de caspasas, sugiriendo la activación de una vía apoptótica dependiendo de RIPK1. De forma similar, en neuronas motoras diferenciadas desde hiPSCs control y con una mutación en el gen C9ORF72, asociado a ALS, DHA incrementó la formación de varicosidades axonales, lo cual es prevenido por la inhibición de RIPK1, indicando un efecto que es reproducible en células humanas. Finalmente, utilizando el modelo animal de ALS, SOD1 G93A, observamos la presencia de astrogliosis reactiva en las astas ventrales de la médula espinal, evento asociado a un incremento en la expresión del transportador de AA, SVCT2, en astrocitos, y a la internalización del mismo en neuronas motoras, sugiriendo una pérdida del reciclamiento de vitamina C. Sin embargo, la inyección de DHA en el IV ventrículo de los animales disminuyó la expresión de SVCT2 en astrocitos, apuntando a una pérdida de características de gliosis reactiva que no está asociada a una mejora en la función motora. Por último, el análisis de marcadores de muerte mostró un incremento en la fosforilación de RIPK1 y el clivaje de caspasa-3 en neuronas motoras de médulas SOD1 G93A, junto con la ausencia de la proteína efectora de la necroptosis, MLKL, sugiriendo que la vía necroptótica sería prescindible para la progresión de ALS y, por el contrario, que la muerte neuronal observada en esta patología estaría asociada a la activación de una vía apoptótica dependiente de RIPK1.
Análisis de la dinámica transcripcional asociada al desarrollo y regeneración del hueso craneal de Xenopus tropicalis.
(Universidad de Concepción, 2024) Castillo Córdova, Héctor Benjamín; Marcellini Liotaud, Sylvain Guy Andre
Hasta la fecha, se desconoce si el programa de regulación génica involucrado en el desarrollo del hueso craneal de los anfibios se reactiva durante la regeneración ósea. Tras una lesión craneal, los renacuajos de Xenopus tropicalis reparan el daño formando un tejido mesenquimatoso no mineralizado a los 5 días post-lesión (5dpl), y posteriormente lo cubren con una capa delgada de hueso (15dpl). Para explorar la relación entre los mecanismos transcripcionales de la osificación craneal durante el desarrollo y la regeneración, realizamos experimentos duplicados de RNA-Seq y ATAC-Seq utilizando tres tipos de muestras: i) región regenerativa temprana (5dpl) y tardía (15dpl), ii) precursores osteogénicos no diferenciados (del mesénquima de larvas NF50) y osteoblastos diferenciados (de cráneos de larvas NF58), y iii) hígado, corazón y pulmón como controles no mineralizados. Determinamos que los osteoblastos en desarrollo poseen una lógica regulatoria bien conservada con los mamíferos, identificando 35 enhancers conservados que, en humano, contienen SNPs, asociados a fenotipos esqueléticos. Los análisis PCA del perfil transcriptómico y del paisaje de cromatina abierta revelan que la regeneración temprana es más similar a los osteoblastos que al mesénquima. Diseñamos un método novedoso para integrar datos de ATAC-seq y RNA-seq, definiendo siete clústeres que permitieron identificar genes sobreexpresados y sus regiones regulatorias específicas. Basados en ontología génica y enriquecimiento de TFBS, determinamos que la red transcripcional de la regeneración temprana está relacionada con la remodelación de la matriz (mmp13), el sistema inmune (spi1) y los precursores osteogénicos (sox2). Sin embargo, carece de los marcadores de patrón embrionario presentes en el mesénquima (nog). En los osteoblastos recién diferenciados de la regeneración tardía, dlx5 cumple un rol clave en la regulación, mientras que el programa genético de los osteoblastos maduros del desarrollo requiere del heterodímero Jun/Fos. En resumen, identificamos un conjunto de enhancers putativos y sus genes diana que se activan en pasos precisos durante el desarrollo y la regeneración del hueso craneal. Nuestros resultados sugieren que los osteoblastos se desdiferencian en un estado celular intermedio mediante la reactivación de genes de pluripotencia como sox2. Este estudio proporciona datos relevantes para entender los mecanismos moleculares que permiten al hueso de los anfibios formarse y regenerarse eficientemente tras un daño crítico.
Rol de la ubicación traslacional de elementos regulatorios de la transcripción sobre la acción de complejos remodeladores de cromatina dependientes de ATP.
(Universidad de Concepción, 2024) Gidi Faúndez, Cristián Alfredo; Gutiérrez Contreras, José Leonardo
La dinámica de la cromatina juega un rol fundamental en la regulación de genes eucariontes. Entre los principales actores que participan en esta dinámica, se encuentran los complejos remodeladores de cromatina dependientes de ATP. Se han descrito varios elementos que influencian la actividad de estos complejos, como factores de transcripción y determinadas secuencias de ADN con propiedades posicionadoras o excluyentes de nucleosomas. En este estudio proponemos que un factor de importancia en la dinámica de cromatina es el ordenamiento de elementos regulatorios en la cromatina, específicamente la ubicación de sitios de unión para factores de transcripción respecto de cores nucleosomales. Para estudiar este aspecto utilizamos un sistema experimental in vitro consistente en la medición de la actividad de complejos remodeladores de cromatina de S. cerevisiae (ySWI/SNF y ISW1a) sobre sondas mononucleosomales, en presencia o ausencia de factores de transcripción, cuyos sitios de unión están presentes bajo diferentes ordenamientos en las sondas mononucleosomales. En estos análisis encontramos que la extensión de ADN entre un core nucleosomal y un sitio de unión para un factor de transcripción que reclute a un complejo remodelador de cromatina afecta la actividad catalítica del complejo. Para el caso específico de ySWI/SNF, extensiones de ADN superiores a 40 pb entre un nucleosoma posicionado y el sitio de unión del factor de transcripción capaz de reclutar al complejo implican una caída significativa en la actividad del mismo. Por otro lado, en el caso del complejo ISW1a se encontró que un factor de transcripción puede impedir la actividad del complejo si su unión se da en el ADN linker hacia el cual el complejo esté movilizando al octámero de histonas. Nuestros resultados apuntan a la ubicación precisa de sitios para factores de transcripción, relativo a los cores nucleosomales vecinos, como un elemento determinante para la acción de complejos remodeladores de cromatina dependientes de ATP. Así, este ordenamiento y factores dependientes del microambiente celular, como la presencia y abundancia relativa de factores de transcripción y complejos remodeladores de cromatina, se presentan como agentes fundamentales en la dinámica de los paisajes nucleosomales vinculados a la regulación de la expresión de genes en organismos eucariontes.
Función matricelular de OSC-espondina en el líquido cefalorraquídeo embrionario: Identificación de nuevos interactores proteicos.
(Universidad de Concepción, 2024) Maurelia Gaete, Felipe Alonso; Caprile Elola-Olaso, Teresa
El sistema nervioso central se desarrolla a partir del tubo neural, una estructura hueca rodeada por neuroepitelio, dentro de la cual se encuentra el líquido cefalorraquídeo embrionario (LCRe). Numerosos estudios han demostrado una estrecha interrelación entre estos dos componentes, en donde las células neuroepiteliales secretan sustancias hacia el LCRe, y este a su vez, estimula la proliferación y diferenciación de estas células. Esto hace del LCRe un fluido biológico altamente dinámico durante el desarrollo embrionario temprano, con una composición que se ajusta a los requerimientos del neuroepitelio. Entre los componentes del LCRe se encuentran morfógenos, cuya función ha sido estudiada principalmente in vitro. Algunos de estos componentes incluyen a FGF-2, BMP-7, ácido retinoico, OSC-espondina y LDL, destacando que la inhibición o sobreexpresión de cualquiera de ellos afecta drásticamente (>50%) los procesos de diferenciación y proliferación neuroepitelial. Estos antecedentes sugieren que los factores descritos no actúan de forma independiente y sumatoria, sino que están interrelacionados in vivo, lo que permite un control más preciso en la diferenciación neuroepitelial. En la búsqueda de mecanismos que integren estos morfógenos, surge la posibilidad de que OSC-espondina actúe como una proteína matricelular, uniendo y modulando el efecto de diversos factores presentes en el LCRe. Las proteínas matricelulares se caracterizan por ser proteínas multidominio que interaccionan con proteínas de la matriz extracelular y de la membrana celular, modulando así la respuesta celular a factores extrínsecos. La OSC-espondina se caracteriza por su gran tamaño y por poseer múltiples dominios, los cuales han sido previamente caracterizados en otras proteínas matricelulares como facilitadores de la interacción con factores de la matriz extracelular, como es el caso de los dominios TSR, vWC y CTCK. Estos dominios se encuentran presentes una nueva variante proteica de OSCsp compuesta por su región C-terminal. En esta tesis, se identificaron las proteínas que interaccionan con la OSCsp nativa y con su región C-terminal recombinante mediante ensayos de inmunoprecipitación y “pulldown”, respectivamente. Las proteínas identificadas por espectrometría de masa revelaron que tanto la proteína completa como su región C-terminal interaccionan con moléculas morfogénicas, así como con proteínas que forman parte de estructuras complejas en el LCRe. Esto sugiere la existencia de un macro-complejo en el LCRe, donde la OSCsp desempeñaría un papel activo como una proteína adaptadora, que facilita la interacción con otras proteínas. Una vez caracterizadas las proteínas que interaccionan con la región C-terminal de OSCsp, se procedió a evaluar la funcionalidad de la interacción entre esta región con los componentes del LCRe. Para ello, se utilizó una estrategia in vitro en la que se trató a las células neuroprogenitoras N2A con la proteína recombinante, en conjunto con LCRe. La medición de señal asociada a proliferación reveló un efecto anti-proliferativo de la región C terminal al ser empleada en conjunto con LCRe en el tratamiento de las células N2A. Además, los parámetros morfogénicos permitieron atribuir un efecto anti-diferenciador de la región C terminal de OSCsp, caracterizado por una disminución en la longitud de las ramificaciones en las células N2A. Para verificar los efectos observados in vitro, se realizó la electroporación de la médula espinal de embriones de gallus gallus con un vector que expresa la región C-terminal de OSCsp. La comparación entre regiones con electroporación masiva y aquellas con electroporación discreta reveló una disminución significativa en los niveles de proliferación y diferenciación, evaluados mediante los marcadores pH3 y 3A10, respectivamente. Estos resultados son coherentes con los hallazgos obtenidos en el tratamiento de células N2A con la región C terminal de OSCsp. En conjunto, este trabajo proporciona una comprensión detallada de la participación de la región C-terminal de OSCsp en la interacción con los componentes del LCRe, así como una atribución de su función morfogénica.
Acciones de alcaloides de Gelsemium en receptores inhibitorios y en la función sináptica.
(Universidad de Concepción, 2023) Marileo Córdova, Ana María; Yévenes Crisóstomo, Gonzalo Enrique
Los receptores ionotrópicos de GABA del tipo A (GABAARs) y de glicina (GlyRs) son fundamentales para la inhibición sináptica en el sistema nervioso central (SNC). En la sinapsis, los neurotransmisores GABA y glicina activan GlyRs y GABAARs postsinápticos, permitiendo el influjo de iones cloruro y la hiperpolarización del potencial de membrana, controlando así la excitabilidad neuronal. Alteraciones en la neurotransmisión GABAérgica o glicinérgica se han asociado con trastornos prevalentes del SNC tales como epilepsia, depresión, ansiedad, dolor crónico, entre otros. La relevancia de la función GABAérgica ha sido resaltada por la buena eficacia de varios fármacos de uso clínico que poseen como blanco principal a los GABAARs. Por el contrario, actualmente no hay fármacos que tengan como blanco especifico a los GlyRs. Con relación a la farmacología de estos receptores, es importante mencionar que se han identificado diversos moduladores de GlyRs y GABAARs a partir de plantas y hongos. En este contexto, los alcaloides de las plantas de Gelsemium han demostrado efectos beneficiosos en diversas patologías del SNC. Sin embargo, estos compuestos han mostrado una alta toxicidad intrínseca, con un perfil toxicológico que sugiere posibles efectos a nivel neuronal. Los blancos moleculares de estos alcaloides en el SNC aún no están definidos. No obstante, existen estudios que han sugerido la posible participación de GlyRs y GABAARs en sus acciones. Este trabajo de tesis logró definir y caracterizar la actividad de los cuatro principales alcaloides del Gelsemium (gelsemina, gelsevirina, koumina y humantenmina) en GABAARs y GlyRs, y en la función sináptica de neuronas corticales. Utilizando registros electrofisiológicos de GABAARs y GlyRs recombinantes, se demostró que gelsemina, koumina y gelsevirina inhibieron las corrientes glicinérgicas y GABAérgicas a concentraciones micromolares. El análisis de las concentraciones inhibitorias medias (IC50) y del porcentaje de máxima inhibición mostró que los GlyRs poseen una sensibilidad mayor a estos alcaloides que los GABAARs. Contrariamente, humantenmina no modificó significativamente la actividad de GABAARs y GlyRs. Utilizando receptores quiméricos y mutados en combinación con técnicas bioinformáticas, se logró determinar que dos mutaciones puntuales en el sitio ortostérico fueron suficientes para generar GlyRs insensibles a gelsemina, koumina y gelsevirina, lo que sugiere que las acciones de estos alcaloides dependen únicamente de su unión al sitio ortostérico. Por otra parte, en el contexto de la sinapsis, se logró establecer que gelsemina disminuyó la frecuencia de los eventos sinápticos GABAérgicos y glutamatérgicos en miniatura de neuronas corticales, sin modificar significativamente la amplitud. De modo interesante, se obtuvieron resultados similares utilizando el alcaloide humantenmina, demostrando que la inhibición directa de GlyRs o GABAARs no es necesaria para los efectos sinápticos. Finalmente, estudios de fluorometría de Ca2+ intracelular lograron demostrar que gelsemina disminuyó la frecuencia de las señales espontaneas de Ca2+, sugiriendo que gelsemina, y posiblemente otros alcaloides del Gelsemium, modulan la sinapsis a través de la interacción con blancos moleculares presinápticos. En conjunto, los resultados de esta tesis proporcionan información novedosa sobre las acciones funcionales y los sitios moleculares de los principales alcaloides del Gelsemium en GABAARs y GlyRs. El perfil de actividad de gelsemina, koumina y gelsevirina en estos canales iónicos sugiere que estas interacciones pudieran estar asociadas a su toxicidad. Por el contrario, los resultados encontrados para humantemina y gelsemina a nivel neuronal sugieren que su actividad biológica estaría relacionada con blancos moleculares presinápticos, diferentes a GABAARs y GlyRs. Estas acciones sinápticas proporcionan una hipótesis novedosa para explicar los diversos efectos beneficiosos de los alcaloides del Gelsemium. En resumen, los resultados de este trabajo contribuyen a dilucidar, al menos en parte, los mecanismos involucrados en las acciones beneficiosas y tóxicas de los alcaloides del Gelsemium a nivel del SNC de mamíferos.
Efecto individual de antibióticos y en combinación con β-Cloro-l-Alanina en la expresión de factores de virulencia relacionados con la formación de biopelículas de Staphylococcus aureus resistente a meticilina de origen intrahospitalario.
(Universidad de Concepción, 2023) Quezada Aguiluz, Mario Andrés; González Rocha, Gerardo Enrique
Staphylococcus aureus es un importante patógeno bacteriano implicado en infecciones humanas y animales. Desde su aparición, al inicio de la era antibiótica, S. aureus resistente a meticilina (SARM) ha mostrado gran capacidad de incorporar genes que codifican determinantes de resistencia a múltiples antibióticos y un gran arsenal de factores de virulencia. Además, SARM representa un gran problema debido la persistencia de infecciones asociadas a dispositivos médicos, principalmente por la capacidad de formar biopelículas, permitiéndole resistir el tratamiento antibiótico, incluso en cepas que no presentan determinantes genéticos de resistencia, lo que finalmente ocasiona el retiro de la prótesis del paciente. En el último tiempo, se han probado alternativas al tratamiento terapéutico habitual, empleando combinaciones de antibióticos usados en la práctica clínica, o bien, utilizando compuestos capaces de desagregar biopelículas. En algunos aislados de SARM se ha demostrado que el uso de algunos antibióticos puede incluso aumentar la expresión de genes implicados en la formación de biopelículas, generando fenotipos hiperadhesivos. Por esta razón, es importante conocer la capacidad de formación de biopelículas y la epidemiología de las cepas de SARM circulantes en Chile. Recientemente, β-cloro-L-alanina (β-CLA), un compuesto con actividad antibacteriana, ha mostrado desagregar biopelículas de SARM en combinación con fosfomicina. Sin embargo, se desconoce el efecto de este compuesto en combinación con otros antibióticos usados en clínica sobre la expresión de los genes que codifican factores de virulencia asociados a la formación de biopelículas. Es por esto, que en esta tesis doctoral se planteó como objetivo general caracterizar las cepas de SARM provenientes de hospitales de Chile y determinar el efecto de antibióticos utilizados en el tratamiento de SARM y la combinación de ellos con β-CLA en la formación de biopelículas como también en la expresión de genes que codifican factores de virulencia asociados con esta capacidad de cepas de SARM aisladas en hospitales de Chile. Inicialmente, se trabajó con 50 cepas categorizadas por el Instituto de salud Pública de Chile como SARM hospitalarias, aisladas entre los años 2007 y 2017, las cuales fueron caracterizadas en función del perfil de susceptibilidad a linezolid, daptomicina y vancomicina; el tipo de cassette SCCmec; y tipificación molecular mediante macrorrestricción con enzima SmaI y electroforesis de campo pulsante (PFGE). Además se confirmó el fenotipo de meticilino resistencia mediante la prueba de susceptibilidad a cefoxitina y la detección del gen mecA por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional. Posteriormente, se realizó la secuenciación del genoma completo (Illumina® MiSeq) utilizando Unicycler v0.4.8 y Spades v3.15.4 para su ensamblaje, visualización con Bandage v0.8.1 y anotación genómica mediante Prokka. Se identificaron los loci tipo multilocus (MLST), spa type, se confirmó la tipificación del tipo de SCCmec, genes de resistencia a los antimicrobianos y genes de virulencia mediante SpeciesFinder 2.0, MLSTFinder 2.0, SCCmecFinder 1.2, spaTyper 1.0, ResFinder 4.1 y VirulenceFinder 2.0, respectivamente. La capacidad de formación de biopelículas se evaluó mediante ensayos de adherencia en placas de 96 pocillos, y la formación y erradicación de biopelículas en presencia de los antibióticos linezolid, daptomicina y vancomicina solos y asociados con β-CLA fue investigada en placas de poliestireno de 6 pocillos de fondo plano, con una lámina de acero inoxidable lisa, las que posteriormente se sometieron a tinción mediante LIVE/DEAD® Baclight™ Bacterial Viability Kit y analizadas por microscopía electrónica confocal (MEC), para evaluar viabilidad de las cepas y grosor de la biopelícula tras la exposición a los compuestos antibacterianos. Se confirmó el fenotipo meticilino resistente en las 50 cepas referidas por el ISP de Chile, además de la presencia del gen mecA. Se determinó que el 76% de las cepas de SARM presentaban el SCCmec tipo I, 14% SCCmec tipo II, 8% el SCCmec tipo IVa y 1 cepa (2%) el SCCmec tipo IVc. El MLST determinó que los tipos de secuencia (ST) prevalentes fueron el ST5 (76%), seguido de los ST105 (14%), ST8 (4%) y los ST5575, ST2802, y ST72 con 2% de prevalencia. El spa type t149 fue prevalente, encontrándose en el 33% de las cepas, seguido del t002 en el 12% de éstas. En cuanto al agr predominante, grupo agr era tipo II (30%) fue el más presente, y en la misma línea, la tipificación del polisacárido capsular determinó que el tipo capsular prevalente era el cap8 (82%), seguido de cap5 (18%). Sin embargo, se descartaron 5 cepas clasificadas originalmente como SARM de origen hospitalaria, pero la tipificación molecular de los SCCmec determinó su origen comunitario. Y de acuerdo al criterio de inclusión no se siguióo trabajando con estas cepas. Las cepas presentaron un perfil de multirresistencia, destacando un 98% de resistencia a los antibióticos del grupo MLSB, sobre 98% a quinolonas y 64% a gentamicina. No se encontraron cepas resistentes a cotrimoxazol, linezolid (LZD), vancomicina (VAN) o daptomicina (DAP). Concordantemente, las cepas presentaron una alta prevalencia de genes de resistencia a distintas familias de antibióticos, como son los que codifican enzimas modificantes de aminoglucósidos: aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia (82%), aad(6) y ant(6)-Ia (64%), aadD (16%), aadE (7%), ant(9)-Ia (98%), ant(4')-Ib (16%), sat4 (40%), aph(3')-IIIa (64%), enzimas metilasas: ermA (98%), ermC (4%), betalactamasa: blaZ (82%), rifampicina fosfotransferasa: rphB (91%), y dihidrofolato reductasa: dfrC (1%). Además, todas las cepas presentaron los genes fosB (resistencia a fosfomicina), norA, mgrA, mepA, mepR, sav1866 (resistencia a fluoroquinolonas), tet38 (resistencia a tetraciclinas) y el sistema regulador de 2 componentes arlRS. Respecto a la caracterización de genes que codifican factores de virulencia implicados en la formación de biopelículas, el 98% de las cepas presentaron el gen fnbA y 26% el gen fnbB (codifiantres de las proteínas de unión a fibronectina A y B, respectivamente); 98% el operón icaABCDR; 80% hly/hla y el todas portaban los genes hlb y hld, codificantes de las hemolisinas b y d, respectivamente. No se detectó la presencia del gen bap, ni de los operones pmsA y pmsB en ninguna de las 45 cepas ensayadas. Sobre el 85% de las cepas presentaron otros genes de virulencia asociados a la adhesión, producción de exoenzimas, toxinas, enterotoxinas y la captación de hierro. Los estudios de relación genética mostraron la presencia de 5 clados, destacando el clado principal con cepas portadoras del SCCmec I distribuídas en la zona centro sur de Chile entre los años 2012 al 2017. Los estudios de formación de biopelículas indicaron que sólo el 73% de las cepas eran productoras de biopelículas, y que el 55% y el 18% del total mostraron un índice de formación de biopelículas débil (DFBP) y moderado (MFBP), respectivamente. De estas cepas se seleccionó una de cada fenotipo y se realizaron ensayos de formación y erradicación de biopelículas en presencia de VAN, DAP, LZD y β-CLA separadamente, y en en combinación con este último. Los análisis de MEC indicaron que la cepa no formadora de biopelículas presentó un aumento de la biomasa viva de la biopelícula madura en concentraciones sub-CMI de VAN, DAP y β-CLA, y una disminución frente a LZD. Las cepas con fenotipo NFBP y MFBP mostraron un aumento en la lectura del espectro rojo cuando se expusieron a concentraciones sub-CMI de LZD, y de las combinaciones LZD + β-CLA, VAN + β-CLA y DAP + β-CLA (p= 0,019) y sub-CMI de VAN, DAP, β-CLA, LZD + β-CLA, VAN + β-CLA y DAP+ β-CLA (p=0,037), respectivamente; lo cual indica que a estas concentraciones ensayadas se induce la muerte celular dentro en la biopelícula, permitiendo además su desagregación. Las cepa con fenotipo DFBP no mostró cambios en la producción de biopelículas frente a los compuestos ensayados. Los ensayos de expresión de genes de virulencia no arrojaron resultados concluyentes con la metodología ensayada. Las cepas de SARM-AH referidas por el ISP de Chile analizadas en esta tesis, presentan prevalentemente, a nivel tanto fenotípico como genotípico, el perfil clásico del clon chileno/cordobés con un amplio arsenal de genes virulencia, principalmente codificantes de factores de adherencia, exoenzimas, toxinas y hemolisinas. Por otra parte, el uso de sub-CMI β-CLA, VAN y DAP contribuyen al a formación de biopelículas en una cepa con fenotipo no productor de biopelículas. El uso de combinaciones a concentraciones sub-CMI de 1 μg/mL LZD, y de las combinaciones de 1 μg/mL LZD +16 μg/mL β-CLA, 0,5 μg/mL VAN + 16 μg/mL β-CLA y 0,125 μg/mL de DAP + 16 μg/mL β-CLA, provocan una disminución de la formación de esta biopelícula, favoreciendo su erradicación.
El aumento de la actividad transamidante de TG2 potencia la vía amiloidogénica en modelos de la enfermedad de Alzheimer.
(Universidad de Concepción, 2023) Panes Fernández, Jessica Daniela; Fuentealba Arcos, Jorge
La Enfermedad de Alzheimer (EA) es la principal forma de demencia que afecta a los adultos mayores. Se caracteriza por una muerte neuronal progresiva en zonas de hipocampo, corteza y amígdala. Se postula que uno de los principales agentes tóxicos responsables de la neurodegeneración es la agregación tóxica del oligómeros del péptido β-amiloide (AβOs), ya que inducirían los principales eventos celulares con los que cursa esta patología, tales como dishomeostasis del Ca+2, disfunción mitocondrial, y la falla sináptica. TG2 es una enzima ubicua cuya función principal es la formación de enlaces isopeptídicos entre proteínas o péptidos, cuyo sitio catalítico se activa frente a concentraciones micromolares de Ca2+. Se ha descrito un aumento de la transcripción de TG2 en diferentes modelos transgénicos de la EA, así como en corteza de pacientes con EA. En esta tesis doctoral se evaluaron cambios en los niveles de TG2 en distintos modelos de la EA, y el efecto de la función transamidante de la enzima TG2 en la agregación del péptido Aβ, y sus principales efectos tóxicos en la función mitocondrial y neuronal. Observamos que los niveles de TG2 en el hipocampo de ratones J20 de 10 meses estaban aumentados (246 ± 17%), y que la actividad transamidante estaba potenciada (159 ± 20%), en comparación con animales WT de la misma edad. Observamos un aumento significativo de la expresión de TG2 en lisado total de hipocampo (286 ± 5 %,), y en fracción mitocondrial (313 ± 4 %) de ratones APP/PS1, en comparación con los ratones WT de la misma edad. Además, neuronas del hipocampo tratadas de forma crónica con oligómeros de Aβ (AβOs, 0.5 μM) mostraron un aumento de la inmunoreactividad de TG2 (146 ± 17%) en comparación con células no tratadas. Conjuntamente, evaluamos la capacidad de TG2 para promover los procesos de agregación del péptido Aβ, comparándola con la formación “autocatalítica” previamente estandarizada por nuestro grupo de investigación. La conversión amiloide inducida por TG2, mostró seguir una cinética hiperbólica exponencial, y fue capaz de inducir agregados con un tamaño medio de 7-13 unidades (∼28, 40, 52 kDa) que presentaban una alta citotoxicidad (85 ± 3 %). En tanto que, la formación autocatalítica mostró seguir una cinética sigmoidal, formando agregados más pequeños de tamaño de medio de 7 unidades (∼28 kDa) que presentaban una menor citotoxicidad (69 ± 3 %). El tratamiento agudo con AβTG2 indujo una rápida sobrecarga de Ca2+ citosólico (300 ± 22%) y Ca2+ mitocondrial (335 ± 43%). Utilizando la técnica de PLA, observamos que la formación del complejo IP3R/VDAC1 aumentó en las neuronas expuestas a AβTG2 bajo tratamientos crónicos (220 ± 12%). Mediante registros de patch clamp, observamos un aumento en la actividad neuronal (30 min, 257 ± 14%), que disminuyó bajo tratamientos crónicos (AβTG2 24h: 30 ± 5%). Nuestros análisis in silico mostraron que el dominio catalítico de TG2 puede interactuar con el péptido Aβ en la región N-terminal (ΔG: -10.9, Kd: 9.754e-006, Energía del complejo: -1504). De forma complementaria, quisimos evaluar la expresión de TG2 frente a la inhibición parcial del complejo mitocondrial I (MCI) con el fármaco CP2 (25 mg/kg/day) en ratones APP/PS1 sintomáticos de 24 meses, tratados durante 15 meses. Observamos que CP2 fue capaz de revertir la sobrexpresión de TG2 en animales APP/PS1 en comparación a los animales no tratados. Finalmente, quisimos correlacionar estos cambios con marcadores de función mitocondrial utilizando los mismos modelos animales. Demostramos que CP2 restaura la morfología mitocondrial, y la comunicación retículo-mitocondria, utilizando reconstrucciones tridimensionales de volúmenes obtenidas por microscopía electrónica en serie. En conjunto, nuestros resultados indican que cambios en la formación de agregados de Aβ en modelos de la EA estaría asociada a un incremento de la actividad transamidante de TG2, por lo que puede ser un potencial blanco para el desarrollo de estrategias farmacológicas en el tratamiento de la EA, y respaldan adicionalmente el desarrollo de inhibidores de TG2 como una estrategia para prevenir la agregación amiloide observada en la EA. Se requerirá avanzar en estudios adicionales, que profundicen en los mecanismos que regulan la transcripción de TG2, y los elementos involucrados en la aceleración de la vía amiloidogénica durante la progresión de la EA.
Rol de IIIG9 en la mantención de uniones adherentes y la polaridad de células ependimarias normales.
(Universidad de Concepción, 2023) Oviedo Iturra, María José; Salazar Martínez, Katterine Andrea
IIIG9 (PPP1R32/SAXO4) es la subunidad regulatoria 32 de la proteína fosfatasa-1 (PP1) de la cual existe escasa información sobre su función. En el sistema nervioso central (SNC) adulto, presenta una localización restringida a cilios móviles, en las uniones adherentes y el citosol de las células ependimarias. Reportes preliminares de esta tesis indicaron que la inhibición in vivo de IIIG9 en la pared ventricular adulta genera denudación ependimaria parcial y presencia de células no polarizadas que internalizan las cadherinas. Sin embargo, hasta la fecha se desconoce un mecanismo molecular que explique la acción de IIIG9 en los complejos proteicos que estabilizan las uniones adherentes. Además, es desconocida la relevancia de IIIG9 en la mantención de las uniones adherentes en las células progenitoras de la pared ventricular, llamadas glias radiales (RGC), y sus efectos en la formación de neuronas y otros tipos de células gliales, como astrocitos. En esta tesis postulamos que IIIG9 forma un complejo con la proteína fosfatasa-1 alfa y Par-3 (proteína de polaridad celular), promoviendo la mantención de las uniones adherentes durante la polarización y diferenciación de las células ependimarias. En el primer objetivo determinamos que IIIG9 se induce tempranamente en el periodo embrionario (E11), con una distribución polarizada hacia el cuerpo de la glia radial, junto a las cadherinas, PP1 alfa y Par-3. La distribución polarizada de estas proteínas se mantiene en la etapa postnatal (PN) y en el epéndimo adulto. Mediante análisis de inhibición in vivo en animales embrionarios (inyección adenoviral en E16 y análisis en cerebros PN4) reportamos un fenotipo de heterotopia ventricular, representado por cúmulos celulares que expresan marcadores de diversos linajes (glias radiales, precursores neurales y gliales). Este efecto fue acompañado de cambios en el patrón de distribución de las cadherinas respecto a la condición control. En zonas marginales de la corteza cerebral, se observaron cúmulos celulares sugiriendo la presencia de heterotopia cortical, rodeada de astrogliosis reactiva. Además, se observa una reducción del área inmunoreactiva para GFAP que sugiere una reducción en la población de astrocitos marginales. En nuestro segundo objetivo, reportamos la interacción entre IIIG9/E-cadherina, IIIG9/PP1 y Par-3/E-cadherina a nivel de los cilios y las regiones basolaterales de las células ependimarias. Similar a lo que observamos en un modelo in vitro de células MDCK polarizadas. Finalmente, mediante análisis de FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) determinamos la interacción entre IIIG9 y PP1 alfa en células HEK292T. En conclusión, nuestros hallazgos indican que IIIG9 (PPP1R32/SAXO4) promueve la mantención de la polaridad de la glía radial (célula troncal) y de las células ependimarias, a través de las uniones adherentes. Esta función podría ser dependiente de la interacción de IIIG9 con cadherinas, PP1y posiblemente con Par-3. Así la correcta función de IIIG9 podría limitar la aparición de patologías del desarrollo cerebral como la dislexia, la epilepsia, el autismo, entre otras; y del cerebro adulto como la hidrocefalia.
Cambios en la expresión y función del receptor de glicina en el Núcleo Accumbens durante el envejecimiento.
(Universidad de Concepción, 2023) Konar Nié, Macarena Sofía; Aguayo Hernández, Luis Gerardo
The nucleus accumbens (nAc) is a key brain structure in the reward system. The nAc receives and integrates afferent signaling fr om several brain regions. Inhibitory control is mediated by gamma aminobutyric acid receptors (GABA A ) and glycine receptors (GlyR). Reports from our laboratory demonstrated the presence of glycinergic synaptic currents, coming from a brain region not yet identified. This project aimed to determine the changes in glycinergic transmission in the nAc during aging. Two specific objectives were set: SO1: Characterize the temporary and sub cellular expression of GlyRs in the nAc of adult and aged mice, and SO2: Characterize the presence and functionality of the glycinergic input(s) that reach the nAc of adult a nd aged mice. Using Western blot, animals aged 12 and 18 months were found to show a significant reduction in the β subunit of GlyR, which allows the receptor to anchor to the synapse, and a decrease in α2 and α3 subunit mRNA using quantitative PCR. The ex pression of a Cre recombinase dependent retrograde virus in the nAc of GlyT2
Regulación transcripcional de NUAK1 por SALL2 frente a estrés metabólico.
(Universidad de Concepción, 2023) Álvarez Martínez-Conde, Claudia Isabel; Pincheira Barrera, Roxana Jacqueline; Castro Alma, Ariel Fernando
Metabolic stress in cancer is critical for migration, invasion, and metastasis. NUAK1, a member of the AMPK-related kinases (ARKs) family, is deregulated in some types of cancer. NUAK1 overexpression promotes cell migration, metastasis, and survival in different contexts, including metabolic stress. Data from our labora-tory show that NUAK1 is transcriptionally induced by glucose deprivation; however, the mechanisms involved in this response are unknown. It has been proposed that SALL2, a transcription factor with dual roles in cancer, may be implicated. Although SALL2 generally acts as a tumor suppressor, under conditions of metabolic stress, its expression increases and contributes to cell survival in MEF cells; however, the mechanism by which SALL2 exerts this role has not been reported. Bioinformatic analyses were performed using databases such as miPanda and R2, which showed a positive correlation between SALL2 and NUAK1 levels in several tissues. According-ly, we found SALL2 dependence for the increase of NUAK1 expression against meta-bolic stress due to glucose deficiency. To determine whether NUAK1 is a direct target of SALL2, we analyzed the promoter of human NUAK1 and mouse Nuak1, in which we found consensus SALL2 binding sites conserved in both species. Through lucifer-ase reporter gene assays, we demonstrated that SALL2 gain-of-function increas-es Nuak1 promoter activity, while chromatin immunoprecipitation (ChIP) studies showed that SALL2 binds to the NUAK1 promoter. Controversial trends were found when testing the pro-survival role of SALL2 against metabolic stress in different mod-els. The SALL2-dependent increase in cell survival was only observed in loss-of-function models (silencing), similar to previous data using wild-type and SALL2-deficient MEF cells. Moreover, our results suggest a dependence on NUAK1 for the pro-survival role of SALL2. Interestingly, NUAK1 inhibition under high glucose conditions induced vacuole formation corresponding to the phenotype of a type of cell death known as methuosis, which is more abundant in shCtrl cells than silenced (shSall2) cells. These data are consistent with previous observations from the labora-tory in colon cancer cells, associating SALL2 with the generation of methuosis. Our data suggest NUAK1 as a transcriptional target of SALL2 associated with cell survival under metabolic stress by glucose deprivation. Elucidating the nor-mal mechanisms of transcriptional regulation of NUAK1 is essential to understanding its dysregulation in cancer.
Evaluación de la capacidad de protección temprana de la variante Thiverval del virus de la Peste Porcina clásica y del rol de CD46 durante su entrada a la célula.
(Universidad de Concepción, 2023) Lamothe Reyes, Yaneysis; Sánchez Ramos, Oliberto; Figueroa Yévenes, Maximiliano Francisco
Classical Swine Fever is a multisystemic viral disease that exclusively affects pigs and generates significant economic losses. Its causative agent, the Classical Swine Fever virus, is a virus that exposes in its envelope the Erns, E1 and E2 proteins, which are involved in the initial union and entry into the cell. However, it is the interaction of E2 with one or more receptors on the cell membrane that mediates endocytosis of the virus. According to the evidence, the CD46 membrane protein is involved in this process, although it has been observed that some viral variants, after adaptation to cell culture, develop infection mechanisms independent of this protein. It is unknown if these variants use different mechanisms to enter the cell and if there are modifications in the E2 protein that could account for this phenomenon. Vaccination is a viable alternative to contain the spread of the virus and eventually eradicate it from those regions of the world where it remains endemic. In these contexts, modified live vaccines are widely used, based on virus variants that have been attenuated after numerous passages in culture. However, the appearance of variants of low or moderate virulence has been reported in areas where an active vaccination policy is carried out. These new variants favor the permanence of the virus in the swine population and the generation of chronic and persistent forms of the disease. It is believed that the immunological pressure exerted against vaccines used for many years, such as those based on the China-strain, has contributed to this phenomenon. Therefore, there is a need to evaluate new vaccine alternatives that are equally safe and effective in these scenarios. Thiverval is an attenuated variant of the Classical Swine Fever virus approved by the World Organization for Animal Health for vaccination against the disease. However, the safety and efficacy reports after in vivo studies with this variant date back to the 1970s and were obtained with techniques that are outdated to date. In addition, it is unknown whether the variant can be transmitted to non-vaccinated animals, its replication rate in tissues and organs, and its ability to confer clinical and virological protection in less than 7 days after a single dose. Updating the information regarding this variant and evaluating its ability to confer early protection may favor the use of vaccines based on this strain in settings where disease control has been difficult. On the other hand, it is unknown if the mutations that led to the attenuation of this variant generate changes in the interaction with CD46. This knowledge constitutes a useful tool for the potential development of viral variants that can be used as vaccines, using methods that directly modify the virus entry mechanism with possible cross-sectional use in other veterinary diseases. Therefore, the general objective of this research was to evaluate the early protection capacity of the Thiverval variant of the Classical Swine Fever virus and the role of CD46 during its entry into the cell. To assess the protective effect of the vaccine, two groups of animals were immunized with the Thiverval variant 16 days apart, and a contact group and a control group were also included in the study. All the animals were challenged with Margarita, a highly virulent CSFV variant, at 21- or 5-days post immunization (dpi). The results of this study show that the Thiverval variant has a low replication rate in the organism and that it is not transmitted to the contact group. It also induces the expression of IFN-α and the humoral response against E2 and Erns, the main proteins of the virus envelope. Neutralizing antibodies are detected from day 14 post immunization and clinical protection against exacerbated symptoms of the disease is achieved with only 5 dpi. In addition, the formulation controls viral replication after challenge, virologically protecting the animals. The role of CD46 during viral infection was assessed in vitro by pre-incubating cells with dilutions of an anti-CD46 polyclonal serum prior to the addition of Thiverval. A 1/20 dilution did not generate complete inhibition of Thiverval infection, however, when the Margarita variant was used, the infection rate was practically nil. This suggests the existence of CD46-independent entry mechanisms after attenuation. An in-silico analysis of the E2 structure of the Thiverval variant showed how the presence of mutations in the region previously defined as important for the interaction with CD46 could be affecting the interaction with the receptor. The results obtained in this work demonstrate the early protection capacity of the Thiverval variant against infection by the virus, which makes it an attractive alternative for the control of the disease in endemic areas. In addition, this research lays the groundwork for further investigation of whether mutations that affect a virus's initial interaction with its cell-entry receptors could be responsible for its attenuation. This would open the doors to the possibility of artificially creating attenuated variants for vaccine purposes using an approach based on protein structure and altering the interaction of the virus with its natural receptor.
Desarrollo y Caracterización de un prototipo de hormona folículo estimulante bovina de simple cadena (BscFSH), para reproducción asistida en rumiantes.
(Universidad de Concepción, 2023) Cabezas Ávila, Óscar Ignacio; Sánchez Ramos, Oliberto
La transferencia de embriones permite la diseminación de características genéticas desde animales de alto rendimiento hacia los rebaños bovinos de producción, tanto lecheros como de carne. Para su uso se implementan protocolos de superovulación, que actualmente, utilizan diversas glicoproteínas que no son especie específicas, siendo la hormona folículo estimulante (FSH) extraída de pituitaria de cerdo, la más utilizada actualmente. Sin embargo, esta FSH porcina tiene varias limitantes. Entre ellas, una vida media en circulación de 5 h, contaminación de hormona luteinizante y otras proteínas del extracto, se realizan 8 frecuencias de aplicación en 4 días, lo que precisa un mayor manejo animal y genera estrés, incidiendo significativamente en la respuesta ovárica y la obtención de embriones transferibles. En este trabajo se diseñó y caracterizó una variante recombinante de cadena única, derivada de la hormona folículo estimulante bovina (bscFSH). Esta variante se diseñó considerando las secuencias aminoacídicas de las cadenas alfa y beta de la FSH nativa de Bos taurus, covalentemente unidas mediante un espaciador de 33 aminoácidos y conteniendo un total de 6 sitios potenciales de N-glicosilación, con estructuras altamente sialiladas. La hormona se produjo en un clon de células CHO genéticamente transformadas y se purificó en un único paso de cromatografía de afinidad, obteniéndose con un 97% de pureza. La bscFSH presentó un tiempo medio de residencia de 66,44 h y un tiempo de vida media en circulación de 44,16 h, administrada por vía intramuscular. Esto nos permitió desarrollar protocolos de superovulación en bovinos con la mitad de la frecuencia de aplicaciones (4 administraciones) utilizada actualmente con las FSH derivadas de pituitaria de cerdo, y obteniendo una mayor cantidad de embriones transferibles. La nueva hormona desarrollada induce una respuesta ovárica eficiente, permite un manejo más amigable, tiene un alto nivel de pureza y está libre de contaminantes animales, evitando posibles zoonosis, y disminuyendo la respuesta inmune y estrés animal.
Asociación de SALL2 y vía WNT/β-CATENINA en cáncer de colon.
(Universidad de Concepción, 2023) Quiroz Lagos, Aracelly Scarlet; Pincheira Barrera, Roxana Jacqueline
SALL2 es un factor de transcripción implicado en el desarrollo embrionario, y funcionalmente se relaciona con la regulación de la proliferación, migración y supervivencia celular. Análisis de datos masivos de cáncer versus tejidos normales indican que el ARNm de SALL2 se encuentra significativamente disminuido en el cáncer colorrectal (CCR), un tipo de cáncer caracterizado por la hiperactivación de la vía Wnt/β-catenina. De manera interesante, análisis previos de Inmunoprecipitación de cromatina-secuenciación (ChIPseq) del laboratorio sugirien que SALL2 regula genes asociados con la vía Wnt. Sin embargo, a la fecha no se ha caracterizado la expresión proteica de SALL2 en tejidos de colon normal o CCR. Por otra parte, se desconoce el rol de SALL2 en CCR y su relación con la vía Wnt. Para caracterizar la expresión de SALL2 en tejidos de colon, se construyó un tissue microarray usando 130 biopsias de archivo del Hospital Guillermo Gantt Benavente incluyendo colon normal, adenoma y CCR, y se evaluó la expresión y localización de SALL2 mediante inmunohistoquímica. Encontramos que SALL2 se expresa en el núcleo y el citoplasma del epitelio, y en el estroma del colon normal se expresa en fibroblastos. Sin embargo, su expresión está disminuida en el adenoma y ausente en el CCR, coincidiendo con los resultados bioinformáticos previos. En biopsias de CCR observamos una correlación negativa entre la expresión de SALL2 y la expresión de β-catenina nuclear en el frente migratorio, un marcador pronóstico. Esta correlacion se confirmó en células CCR con ganancia y pérdida de función de SALL2 a través de inmunofluorescncia y fraccionamiento subcelular. Además, evaluamos la dependencia de SALL2 en la expresión de blancos de la vía Wnt por Western blot y qRT-PCR, encontrando una correlación positiva entre SALL2 y AXIN2, un importante regulador negativo de la vía Wnt. El análisis del promotor de AXIN2 identificó varios sitios de unión putativos de SALL2. A nivel mecanístico demostramos que la inducción de SALL2 en modelos celulares doxiciclina inducible, aumenta la actividad del promotor de AXIN2. A través de ChIP-PCR demostramos que SALL2 se une a la porción proximal del promotor de AXIN2, lo que confirma una regulación transcripcional dependiente de SALL2. Finalmente, mostramos que el eje SALL2-AXIN2 es necesario para la respuesta de supervivencia a XAV939, un inhibidor de la vía Wnt. En conclusión, nuestro estudio confirma que SALL2 regula positivamente la transcripción de AXIN2. Se propone que la pérdida de la expresión de SALL2 durante la progresión del CCR contribuye a la disminución de los niveles de AXIN2, lo que contribuye a la hiperactivación de la vía Wnt.
Influencia de secuencias de ADN en procesos activos que determinan el posicionamiento nucleosomal.
(Universidad de Concepción, 2023) Amigo Bastías, Roberto Antonio; Gutiérrez Contreras, José Leonardo
La posición de los nucleosomas tiene un gran impacto en procesos celulares que involucran interacción proteína-ADN, como es el caso de la replicación, reparación y transcripción. En Saccharomyces cerevisiae los promotores de genes se encuentran enriquecidos en secuencias homopoliméricas de ADN denominados tractos poli (dA:dT), las cuales se relacionan con la presencia de regiones libres de nucleosomas (NDRs). En otros organismos, como ratón y humano, la presencia de tractos poli (dA:dT) es menor y su distribución es más amplia; sin embargo, mantienen su capacidad de excluir nucleosomas, lo que podría significar que existen mecanismos comunes que se han conservado durante la evolución. ¿Cómo se forman y mantienen los NDRs? Estudios a nivel de genoma completo han determinado que los complejos remodeladores de cromatina dependientes de ATP juegan un papel clave en este fenómeno, donde existen complejos denominados “despejadores”, que abren y forman los NDRs, y complejos denominados “cubridores”, que cierran los NDRs. Además, otros estudios han encontrado una relación entre la acción de los complejos remodeladores de cromatina dependientes de ATP y la presencia de los tractos poli (dA:dT), donde la acción de factores de transcripción también estaría implicada. Sin embargo, aún se desconocen los mecanismos moleculares de la comunicación que existe entre los diferentes elementos que se encuentran en los NDRs. Por este motivo, en el presente trabajo buscamos determinar la influencia de los tractos poli (dA:dT) sobre la actividad remodeladora de nucleosomas de los complejos ISW1a, RSC y ySWI/SNF, los cuales cumplen diferentes roles en la mantención de los NDRs. Además, estudiamos cómo factores de transcripción pueden influir en la dinámica entre estas secuencias y los complejos estudiados. Para llevar a cabo nuestro estudio, usamos sondasmononucleoso-males reconstituidas in vitro que poseían diferentes configuraciones de los tractos poli (dA:dT), con las que se ejecutaron ensayos de remodelación analizando la acción de los complejos purificados. En nuestros resultados hallamos que estas secuencias pueden afectar de manera directa varios aspectos de la acción de estos complejos, como: la unión al nucleosoma, la intensidad de la actividad de remodelación y la dirección en que ejecutan ésta. Además, observamos que la orientación de los tractos poli (dA:dT) afecta diferencialmente a los complejos remodeladores de cromatina estudiados. Por otro lado, encontramos que los factores de transcripción podrían ejercer efectos diferenciales sobre ISW1a y RSC. Estos resultados realzan la importancia y el impacto que tienen los tractos poli (dA:dT) en el posicionamiento nucleosomal y ayudan a dilucidar los mecanismos mediante los cuales estas secuencias ejercen sus efectos.
Microbiota en salmón del atlántico: Evaluación del rol de la comunidad microbiana en peces de cultivo y su relación con la salud durante el ciclo productivo.
(Universidad de Concepción, 2022) Morales Rivera, María Fernanda; Gallardo Escárate, Cristian
There is a growing concern to ensure this animal welfare in aquaculture. To this effect, intestinal microbiota is a promising field to evaluate and improve welfare. This is because it has great relevance in the host influencing, for example, the digestive and immune systems. In this sense, in addition to taxonomy, there has been a growing interest in knowing the metabolic functionality of microbial communities, because it offers advantages when evaluating the effect of changes in the environment. The objective of this thesis was to establish whether the taxonomic and functional structure of the microbial community in Atlantic salmon provides us with tools to evaluate animal welfare during the production process. For this work, the sequencing of the V1-V9 16S rRNA region using Nanopore MinION was used. Subsequently, taxonomic assignments were made using the "Epi2Me de Oxford Nanopore" platform or the "NanoCLUST" tool. In addition, the "Vegan" package in the "R studio" program was used to calculate the alpha diversity and the estimation of uniformity by the Pielou index. The microbial community structure was analyzed using Bray-Curtis with a principal coordinates analysis (PCoA). Finally, functional prediction of the metagenome was performed by PICRUSt2 using the MetaCyc database. For the first analysis, the taxonomy of gut samples from Atlantic salmon with abdominal distension (AD), without abdominal distension (no_AD) and water samples from the intake (Mouth), decanter (Deca), inlets and outlets of the biofilter (BF) of a freshwater aquaculture recirculation system (RAS) was determined. This was to identify the microbiota in affected and diseased fish during an epidemic outbreak following a vaccination event. Gut samples from fish with (DA) yielded the lowest diversity indices, along with a dominance of Proteobacteria. In addition, Aliivibrio wodanis is the main pathogen present in DA fish and a probable etiological agent of diseased fish. On the other hand, the microbiota of non-AD fish have a higher contribution in pathways related to amino acid metabolism and short-chain fatty acid fermentation, which is indicative of better health compared to AD fish. Additionally, the contribution to the metabolism of inorganic compounds was determined using the "KEGG Orthology" database for the construction of metabolic maps with the "KEGG Mapper" tool focused on nitrogen and sulfur metabolism. As a result, we found that sulfide metabolism is the most represented in DA weights. In addition, denitrification and nitrification processes are found to be favored in the DECA water sample over the others. This is closely related to the role it plays. Subsequently, the taxonomy of smolts during their transfer to seawater under different treatments was evaluated and, the functional metagenomics of the gut microbiota of the fish was analyzed. This included a sampling group subjected to feeding with a functional diet (FD) prior to the transfer process to seawater. The objective was to evaluate whether a gradual change in salinity (GSC) prior to seawater transfer favors microbiota diversity over an osmotic shock (SS). As a result, we found that microbial richness and diversity were higher in fish subjected to GSC, suggesting a positive association between microbial community and fish health. In addition, bacteria of the genus Vibrio are present in the gut samples of fish in seawater that were not present in freshwater or during GSC. In addition, fish feeding with a FD prior to salt shock show less abundance of this genus. In terms of metabolic functionality, the biosynthesis of amino acids such as valine, leucine and isoleucine are found to be favored in fish previously feeding with a FD. On the other hand, the degradation of essential amino acids is favored feeding with a FD and SS fish. On the other hand, the degradation of drugs, contaminants and other aromatic compounds is favored in FD-fed fish and in fish subjected to GSC. Finally, the microbiota of Caligus rogercresseyi from different areas of southern Chile was studied as a potential reservoir of pathogens that can affect Atlantic salmon. For this purpose, from the taxonomic results, those that correspond to fish pathogenic bacteria were filtered and the diversity indexes were determined. As a result, pathogens belonging to the genus Tenacibaculum were identified. Additionally, the abundance and diversity of pathogens is directly related to the biomass of salmon produced in each of the zones. In summary, knowledge of the taxonomic and functional structure of the gut microbiota allows us to evaluate which fish are healthier than others. This provides us with a tool to recognize signs of disease. It also allows us to evaluate the microbiological quality of the water and provides us with information on the microbiota of potential total pathogens, both in the water and in other parasites such as Caligus rogercresseyi.
El Aumento de D-Glucosa Extracelular Modifica el Estado de Metilación Global del ADN y la Función de Adhesión de las Células Progenitoras de Endotelio Humano Tempranas.
(Universidad de Concepción, 2023) Fernández Garcés, Paulina Carola Tálitha; Gutiérrez Gallegos, Soraya Elisa
Diabetes mellitus tipo 2 (DM2), constituye una enfermedad metabólica atribuida a factores genéticos y ambientales, que afecta las funciones angiogénicas de las Células Progenitoras Endoteliales Humanas (hEPC) las cuales no logran ser restauradas en respuesta a un buen control glicémico, manteniendo así, alterada su función en el tiempo. Por lo tanto, es probable que la exposición permanente a un ambiente con niveles de glucosa superiores a los valores plasmáticos normales (5mM o 90mg/dl), produzca alteraciones a nivel epigenético que puedan explicar la mantención de las alteraciones angiogénicas en las EPC. En la presente investigación, hEPC fueron cultivadas durante 4 días (hEPC4d) en 5mM (90mg/dl) de D-Glucosa, concentración equivalente a valores plasmáticos normales, 10mM (180mg/dl) para simular una concentración de DGlucosa considerada como "clínicamente aceptable" en pacientes diabéticos, y 20mM (360mg/dl) de D-glucosa para simular un ambiente hiperglicémico en pacientes diabéticos. Posteriormente, se evaluó la capacidad de adhesión de las células a una matriz de fibronectina. Para evaluar si las concentraciones de Dglucosa tenían impacto en los niveles de metilación global del ADN de hEPC-4d, se midieron los niveles de 5-metilcitosina (5mC), 5 hidroximetilcitosina (5hmC) y los niveles de expresión de los genes TET1 y TET2. Los resultados obtenidos indican que la suplementación del medio de cultivo con 20mM de D-Glucosa resulta en una disminución de la adhesión celular y adicionalmente, al cultivar las células hEPC-4d en 10mM y 20mM se puede observar una hipometilación global del ADN, y un aumento de 5hmC. Estos cambios en el patrón de metilación no fueron acompañados por cambios en los niveles de ARNm de los genes TET1 y TET2. Por lo tanto, se concluye que 20mM de D-glucosa genera una hipometilación del genoma en las hEPC-4d y una disminución de su capacidad de adhesión, fenómeno independiente de los niveles de expresión de los genes TET1 y TET2. Aunque la concentración de D-Glucosa considerada como glicemia "clínicamente aceptable" en un paciente diabético (10mM o 180mg/dl), no produce cambios significativos en la adhesión de hEPC-4d, sí se observa una hipometilación global del genoma, que podría ser la responsable de la alteración de las funciones angiogénicas de estas células en pacientes que, desde el punto de vista clínico, tienen un buen control en los niveles plasmáticos de glucosa.

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