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Efecto de ácido dehidroascórbico sobre la activación de RIPK1, durante la degeneración de neuritas.
(Universidad de Concepción, 2024) Magdalena Parra, Rocío Fernanda; Nualart Santander, Francisco Javier
En el SNC, la vitamina C se encuentra fundamentalmente como ácido ascórbico (AA), su forma reducida, molécula que actúa como agente antioxidante en el cerebro y cuya homeostasis se mantiene debido al acoplamiento neurona astrocito, donde AA ingresa a las neuronas y es oxidado a ácido dehidroascórbico (DHA), el cual es liberado al medio extracelular y reciclado por los astrocitos, permitiendo la mantención de las concentraciones de vitamina C en el parénquima cerebral. Sin embargo, condiciones patológicas agudas que incrementen los niveles de especies oxidantes pueden favorecer la generación extracelular de DHA, cuya acumulación lleva a modificaciones en el metabolismo neuronal y la muerte necroptótica, dada por la activación de RIPK1, proteína de andamiaje fuertemente regulada y que ha sido asociada a la progresión de la esclerosis lateral amiotrófica (ALS); sin embargo, se desconoce si bajo estas condiciones crónicas, DHA puede llevar a la activación de RIPK1 y a la pérdida de neuritas y axones. Utilizando neurosferas in vitro, evaluamos el efecto de DHA sobre las neuritas, detectando una reducción significativa en su largo y ramificación, efecto prevenido tanto por la inhibición de RIPK1 como de caspasas, sugiriendo la activación de una vía apoptótica dependiendo de RIPK1. De forma similar, en neuronas motoras diferenciadas desde hiPSCs control y con una mutación en el gen C9ORF72, asociado a ALS, DHA incrementó la formación de varicosidades axonales, lo cual es prevenido por la inhibición de RIPK1, indicando un efecto que es reproducible en células humanas. Finalmente, utilizando el modelo animal de ALS, SOD1 G93A, observamos la presencia de astrogliosis reactiva en las astas ventrales de la médula espinal, evento asociado a un incremento en la expresión del transportador de AA, SVCT2, en astrocitos, y a la internalización del mismo en neuronas motoras, sugiriendo una pérdida del reciclamiento de vitamina C. Sin embargo, la inyección de DHA en el IV ventrículo de los animales disminuyó la expresión de SVCT2 en astrocitos, apuntando a una pérdida de características de gliosis reactiva que no está asociada a una mejora en la función motora. Por último, el análisis de marcadores de muerte mostró un incremento en la fosforilación de RIPK1 y el clivaje de caspasa-3 en neuronas motoras de médulas SOD1 G93A, junto con la ausencia de la proteína efectora de la necroptosis, MLKL, sugiriendo que la vía necroptótica sería prescindible para la progresión de ALS y, por el contrario, que la muerte neuronal observada en esta patología estaría asociada a la activación de una vía apoptótica dependiente de RIPK1.
Análisis de la dinámica transcripcional asociada al desarrollo y regeneración del hueso craneal de Xenopus tropicalis.
(Universidad de Concepción, 2024) Castillo Córdova, Héctor Benjamín; Marcellini Liotaud, Sylvain
Hasta la fecha, se desconoce si el programa de regulación génica involucrado en el desarrollo del hueso craneal de los anfibios se reactiva durante la regeneración ósea. Tras una lesión craneal, los renacuajos de Xenopus tropicalis reparan el daño formando un tejido mesenquimatoso no mineralizado a los 5 días post-lesión (5dpl), y posteriormente lo cubren con una capa delgada de hueso (15dpl). Para explorar la relación entre los mecanismos transcripcionales de la osificación craneal durante el desarrollo y la regeneración, realizamos experimentos duplicados de RNA-Seq y ATAC-Seq utilizando tres tipos de muestras: i) región regenerativa temprana (5dpl) y tardía (15dpl), ii) precursores osteogénicos no diferenciados (del mesénquima de larvas NF50) y osteoblastos diferenciados (de cráneos de larvas NF58), y iii) hígado, corazón y pulmón como controles no mineralizados. Determinamos que los osteoblastos en desarrollo poseen una lógica regulatoria bien conservada con los mamíferos, identificando 35 enhancers conservados que, en humano, contienen SNPs, asociados a fenotipos esqueléticos. Los análisis PCA del perfil transcriptómico y del paisaje de cromatina abierta revelan que la regeneración temprana es más similar a los osteoblastos que al mesénquima. Diseñamos un método novedoso para integrar datos de ATAC-seq y RNA-seq, definiendo siete clústeres que permitieron identificar genes sobreexpresados y sus regiones regulatorias específicas. Basados en ontología génica y enriquecimiento de TFBS, determinamos que la red transcripcional de la regeneración temprana está relacionada con la remodelación de la matriz (mmp13), el sistema inmune (spi1) y los precursores osteogénicos (sox2). Sin embargo, carece de los marcadores de patrón embrionario presentes en el mesénquima (nog). En los osteoblastos recién diferenciados de la regeneración tardía, dlx5 cumple un rol clave en la regulación, mientras que el programa genético de los osteoblastos maduros del desarrollo requiere del heterodímero Jun/Fos. En resumen, identificamos un conjunto de enhancers putativos y sus genes diana que se activan en pasos precisos durante el desarrollo y la regeneración del hueso craneal. Nuestros resultados sugieren que los osteoblastos se desdiferencian en un estado celular intermedio mediante la reactivación de genes de pluripotencia como sox2. Este estudio proporciona datos relevantes para entender los mecanismos moleculares que permiten al hueso de los anfibios formarse y regenerarse eficientemente tras un daño crítico.
Rol de la ubicación traslacional de elementos regulatorios de la transcripción sobre la acción de complejos remodeladores de cromatina dependientes de ATP.
(Universidad de Concepción, 2024) Gidi Faúndez, Cristian Alfredo; Gutiérrez Contreras, José Leonardo
La dinámica de la cromatina juega un rol fundamental en la regulación de genes eucariontes. Entre los principales actores que participan en esta dinámica, se encuentran los complejos remodeladores de cromatina dependientes de ATP. Se han descrito varios elementos que influencian la actividad de estos complejos, como factores de transcripción y determinadas secuencias de ADN con propiedades posicionadoras o excluyentes de nucleosomas. En este estudio proponemos que un factor de importancia en la dinámica de cromatina es el ordenamiento de elementos regulatorios en la cromatina, específicamente la ubicación de sitios de unión para factores de transcripción respecto de cores nucleosomales. Para estudiar este aspecto utilizamos un sistema experimental in vitro consistente en la medición de la actividad de complejos remodeladores de cromatina de S. cerevisiae (ySWI/SNF y ISW1a) sobre sondas mononucleosomales, en presencia o ausencia de factores de transcripción, cuyos sitios de unión están presentes bajo diferentes ordenamientos en las sondas mononucleosomales. En estos análisis encontramos que la extensión de ADN entre un core nucleosomal y un sitio de unión para un factor de transcripción que reclute a un complejo remodelador de cromatina afecta la actividad catalítica del complejo. Para el caso específico de ySWI/SNF, extensiones de ADN superiores a 40 pb entre un nucleosoma posicionado y el sitio de unión del factor de transcripción capaz de reclutar al complejo implican una caída significativa en la actividad del mismo. Por otro lado, en el caso del complejo ISW1a se encontró que un factor de transcripción puede impedir la actividad del complejo si su unión se da en el ADN linker hacia el cual el complejo esté movilizando al octámero de histonas. Nuestros resultados apuntan a la ubicación precisa de sitios para factores de transcripción, relativo a los cores nucleosomales vecinos, como un elemento determinante para la acción de complejos remodeladores de cromatina dependientes de ATP. Así, este ordenamiento y factores dependientes del microambiente celular, como la presencia y abundancia relativa de factores de transcripción y complejos remodeladores de cromatina, se presentan como agentes fundamentales en la dinámica de los paisajes nucleosomales vinculados a la regulación de la expresión de genes en organismos eucariontes.
Función matricelular de OSC-espondina en el líquido cefalorraquídeo embrionario: Identificación de nuevos interactores proteicos.
(Universidad de Concepción, 2024) Maurelia Gaete, Felipe Alonso; Caprile Elola-Olaso, Teresa
El sistema nervioso central se desarrolla a partir del tubo neural, una estructura hueca rodeada por neuroepitelio, dentro de la cual se encuentra el líquido cefalorraquídeo embrionario (LCRe). Numerosos estudios han demostrado una estrecha interrelación entre estos dos componentes, en donde las células neuroepiteliales secretan sustancias hacia el LCRe, y este a su vez, estimula la proliferación y diferenciación de estas células. Esto hace del LCRe un fluido biológico altamente dinámico durante el desarrollo embrionario temprano, con una composición que se ajusta a los requerimientos del neuroepitelio. Entre los componentes del LCRe se encuentran morfógenos, cuya función ha sido estudiada principalmente in vitro. Algunos de estos componentes incluyen a FGF-2, BMP-7, ácido retinoico, OSC-espondina y LDL, destacando que la inhibición o sobreexpresión de cualquiera de ellos afecta drásticamente (>50%) los procesos de diferenciación y proliferación neuroepitelial. Estos antecedentes sugieren que los factores descritos no actúan de forma independiente y sumatoria, sino que están interrelacionados in vivo, lo que permite un control más preciso en la diferenciación neuroepitelial. En la búsqueda de mecanismos que integren estos morfógenos, surge la posibilidad de que OSC-espondina actúe como una proteína matricelular, uniendo y modulando el efecto de diversos factores presentes en el LCRe. Las proteínas matricelulares se caracterizan por ser proteínas multidominio que interaccionan con proteínas de la matriz extracelular y de la membrana celular, modulando así la respuesta celular a factores extrínsecos. La OSC-espondina se caracteriza por su gran tamaño y por poseer múltiples dominios, los cuales han sido previamente caracterizados en otras proteínas matricelulares como facilitadores de la interacción con factores de la matriz extracelular, como es el caso de los dominios TSR, vWC y CTCK. Estos dominios se encuentran presentes una nueva variante proteica de OSCsp compuesta por su región C-terminal. En esta tesis, se identificaron las proteínas que interaccionan con la OSCsp nativa y con su región C-terminal recombinante mediante ensayos de inmunoprecipitación y “pulldown”, respectivamente. Las proteínas identificadas por espectrometría de masa revelaron que tanto la proteína completa como su región C-terminal interaccionan con moléculas morfogénicas, así como con proteínas que forman parte de estructuras complejas en el LCRe. Esto sugiere la existencia de un macro-complejo en el LCRe, donde la OSCsp desempeñaría un papel activo como una proteína adaptadora, que facilita la interacción con otras proteínas. Una vez caracterizadas las proteínas que interaccionan con la región C-terminal de OSCsp, se procedió a evaluar la funcionalidad de la interacción entre esta región con los componentes del LCRe. Para ello, se utilizó una estrategia in vitro en la que se trató a las células neuroprogenitoras N2A con la proteína recombinante, en conjunto con LCRe. La medición de señal asociada a proliferación reveló un efecto anti-proliferativo de la región C terminal al ser empleada en conjunto con LCRe en el tratamiento de las células N2A. Además, los parámetros morfogénicos permitieron atribuir un efecto anti-diferenciador de la región C terminal de OSCsp, caracterizado por una disminución en la longitud de las ramificaciones en las células N2A. Para verificar los efectos observados in vitro, se realizó la electroporación de la médula espinal de embriones de gallus gallus con un vector que expresa la región C-terminal de OSCsp. La comparación entre regiones con electroporación masiva y aquellas con electroporación discreta reveló una disminución significativa en los niveles de proliferación y diferenciación, evaluados mediante los marcadores pH3 y 3A10, respectivamente. Estos resultados son coherentes con los hallazgos obtenidos en el tratamiento de células N2A con la región C terminal de OSCsp. En conjunto, este trabajo proporciona una comprensión detallada de la participación de la región C-terminal de OSCsp en la interacción con los componentes del LCRe, así como una atribución de su función morfogénica.
Acciones de alcaloides de Gelsemium en receptores inhibitorios y en la función sináptica.
(Universidad de Concepción, 2023) Marileo Córdova, Ana María; Yévenes Crisóstomo, Gonzalo
Los receptores ionotrópicos de GABA del tipo A (GABAARs) y de glicina (GlyRs) son fundamentales para la inhibición sináptica en el sistema nervioso central (SNC). En la sinapsis, los neurotransmisores GABA y glicina activan GlyRs y GABAARs postsinápticos, permitiendo el influjo de iones cloruro y la hiperpolarización del potencial de membrana, controlando así la excitabilidad neuronal. Alteraciones en la neurotransmisión GABAérgica o glicinérgica se han asociado con trastornos prevalentes del SNC tales como epilepsia, depresión, ansiedad, dolor crónico, entre otros. La relevancia de la función GABAérgica ha sido resaltada por la buena eficacia de varios fármacos de uso clínico que poseen como blanco principal a los GABAARs. Por el contrario, actualmente no hay fármacos que tengan como blanco especifico a los GlyRs. Con relación a la farmacología de estos receptores, es importante mencionar que se han identificado diversos moduladores de GlyRs y GABAARs a partir de plantas y hongos. En este contexto, los alcaloides de las plantas de Gelsemium han demostrado efectos beneficiosos en diversas patologías del SNC. Sin embargo, estos compuestos han mostrado una alta toxicidad intrínseca, con un perfil toxicológico que sugiere posibles efectos a nivel neuronal. Los blancos moleculares de estos alcaloides en el SNC aún no están definidos. No obstante, existen estudios que han sugerido la posible participación de GlyRs y GABAARs en sus acciones. Este trabajo de tesis logró definir y caracterizar la actividad de los cuatro principales alcaloides del Gelsemium (gelsemina, gelsevirina, koumina y humantenmina) en GABAARs y GlyRs, y en la función sináptica de neuronas corticales. Utilizando registros electrofisiológicos de GABAARs y GlyRs recombinantes, se demostró que gelsemina, koumina y gelsevirina inhibieron las corrientes glicinérgicas y GABAérgicas a concentraciones micromolares. El análisis de las concentraciones inhibitorias medias (IC50) y del porcentaje de máxima inhibición mostró que los GlyRs poseen una sensibilidad mayor a estos alcaloides que los GABAARs. Contrariamente, humantenmina no modificó significativamente la actividad de GABAARs y GlyRs. Utilizando receptores quiméricos y mutados en combinación con técnicas bioinformáticas, se logró determinar que dos mutaciones puntuales en el sitio ortostérico fueron suficientes para generar GlyRs insensibles a gelsemina, koumina y gelsevirina, lo que sugiere que las acciones de estos alcaloides dependen únicamente de su unión al sitio ortostérico. Por otra parte, en el contexto de la sinapsis, se logró establecer que gelsemina disminuyó la frecuencia de los eventos sinápticos GABAérgicos y glutamatérgicos en miniatura de neuronas corticales, sin modificar significativamente la amplitud. De modo interesante, se obtuvieron resultados similares utilizando el alcaloide humantenmina, demostrando que la inhibición directa de GlyRs o GABAARs no es necesaria para los efectos sinápticos. Finalmente, estudios de fluorometría de Ca2+ intracelular lograron demostrar que gelsemina disminuyó la frecuencia de las señales espontaneas de Ca2+, sugiriendo que gelsemina, y posiblemente otros alcaloides del Gelsemium, modulan la sinapsis a través de la interacción con blancos moleculares presinápticos. En conjunto, los resultados de esta tesis proporcionan información novedosa sobre las acciones funcionales y los sitios moleculares de los principales alcaloides del Gelsemium en GABAARs y GlyRs. El perfil de actividad de gelsemina, koumina y gelsevirina en estos canales iónicos sugiere que estas interacciones pudieran estar asociadas a su toxicidad. Por el contrario, los resultados encontrados para humantemina y gelsemina a nivel neuronal sugieren que su actividad biológica estaría relacionada con blancos moleculares presinápticos, diferentes a GABAARs y GlyRs. Estas acciones sinápticas proporcionan una hipótesis novedosa para explicar los diversos efectos beneficiosos de los alcaloides del Gelsemium. En resumen, los resultados de este trabajo contribuyen a dilucidar, al menos en parte, los mecanismos involucrados en las acciones beneficiosas y tóxicas de los alcaloides del Gelsemium a nivel del SNC de mamíferos.
Efecto individual de antibióticos y en combinación con β-Cloro-l-Alanina en la expresión de factores de virulencia relacionados con la formación de biopelículas de Staphylococcus aureus resistente a meticilina de origen intrahospitalario.
(Universidad de Concepción, 2023) Quezada Aguiluz, Mario Andrés; González Rocha, Gerardo
Staphylococcus aureus es un importante patógeno bacteriano implicado en infecciones humanas y animales. Desde su aparición, al inicio de la era antibiótica, S. aureus resistente a meticilina (SARM) ha mostrado gran capacidad de incorporar genes que codifican determinantes de resistencia a múltiples antibióticos y un gran arsenal de factores de virulencia. Además, SARM representa un gran problema debido la persistencia de infecciones asociadas a dispositivos médicos, principalmente por la capacidad de formar biopelículas, permitiéndole resistir el tratamiento antibiótico, incluso en cepas que no presentan determinantes genéticos de resistencia, lo que finalmente ocasiona el retiro de la prótesis del paciente. En el último tiempo, se han probado alternativas al tratamiento terapéutico habitual, empleando combinaciones de antibióticos usados en la práctica clínica, o bien, utilizando compuestos capaces de desagregar biopelículas. En algunos aislados de SARM se ha demostrado que el uso de algunos antibióticos puede incluso aumentar la expresión de genes implicados en la formación de biopelículas, generando fenotipos hiperadhesivos. Por esta razón, es importante conocer la capacidad de formación de biopelículas y la epidemiología de las cepas de SARM circulantes en Chile. Recientemente, β-cloro-L-alanina (β-CLA), un compuesto con actividad antibacteriana, ha mostrado desagregar biopelículas de SARM en combinación con fosfomicina. Sin embargo, se desconoce el efecto de este compuesto en combinación con otros antibióticos usados en clínica sobre la expresión de los genes que codifican factores de virulencia asociados a la formación de biopelículas. Es por esto, que en esta tesis doctoral se planteó como objetivo general caracterizar las cepas de SARM provenientes de hospitales de Chile y determinar el efecto de antibióticos utilizados en el tratamiento de SARM y la combinación de ellos con β-CLA en la formación de biopelículas como también en la expresión de genes que codifican factores de virulencia asociados con esta capacidad de cepas de SARM aisladas en hospitales de Chile. Inicialmente, se trabajó con 50 cepas categorizadas por el Instituto de salud Pública de Chile como SARM hospitalarias, aisladas entre los años 2007 y 2017, las cuales fueron caracterizadas en función del perfil de susceptibilidad a linezolid, daptomicina y vancomicina; el tipo de cassette SCCmec; y tipificación molecular mediante macrorrestricción con enzima SmaI y electroforesis de campo pulsante (PFGE). Además se confirmó el fenotipo de meticilino resistencia mediante la prueba de susceptibilidad a cefoxitina y la detección del gen mecA por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional. Posteriormente, se realizó la secuenciación del genoma completo (Illumina® MiSeq) utilizando Unicycler v0.4.8 y Spades v3.15.4 para su ensamblaje, visualización con Bandage v0.8.1 y anotación genómica mediante Prokka. Se identificaron los loci tipo multilocus (MLST), spa type, se confirmó la tipificación del tipo de SCCmec, genes de resistencia a los antimicrobianos y genes de virulencia mediante SpeciesFinder 2.0, MLSTFinder 2.0, SCCmecFinder 1.2, spaTyper 1.0, ResFinder 4.1 y VirulenceFinder 2.0, respectivamente. La capacidad de formación de biopelículas se evaluó mediante ensayos de adherencia en placas de 96 pocillos, y la formación y erradicación de biopelículas en presencia de los antibióticos linezolid, daptomicina y vancomicina solos y asociados con β-CLA fue investigada en placas de poliestireno de 6 pocillos de fondo plano, con una lámina de acero inoxidable lisa, las que posteriormente se sometieron a tinción mediante LIVE/DEAD® Baclight™ Bacterial Viability Kit y analizadas por microscopía electrónica confocal (MEC), para evaluar viabilidad de las cepas y grosor de la biopelícula tras la exposición a los compuestos antibacterianos. Se confirmó el fenotipo meticilino resistente en las 50 cepas referidas por el ISP de Chile, además de la presencia del gen mecA. Se determinó que el 76% de las cepas de SARM presentaban el SCCmec tipo I, 14% SCCmec tipo II, 8% el SCCmec tipo IVa y 1 cepa (2%) el SCCmec tipo IVc. El MLST determinó que los tipos de secuencia (ST) prevalentes fueron el ST5 (76%), seguido de los ST105 (14%), ST8 (4%) y los ST5575, ST2802, y ST72 con 2% de prevalencia. El spa type t149 fue prevalente, encontrándose en el 33% de las cepas, seguido del t002 en el 12% de éstas. En cuanto al agr predominante, grupo agr era tipo II (30%) fue el más presente, y en la misma línea, la tipificación del polisacárido capsular determinó que el tipo capsular prevalente era el cap8 (82%), seguido de cap5 (18%). Sin embargo, se descartaron 5 cepas clasificadas originalmente como SARM de origen hospitalaria, pero la tipificación molecular de los SCCmec determinó su origen comunitario. Y de acuerdo al criterio de inclusión no se siguióo trabajando con estas cepas. Las cepas presentaron un perfil de multirresistencia, destacando un 98% de resistencia a los antibióticos del grupo MLSB, sobre 98% a quinolonas y 64% a gentamicina. No se encontraron cepas resistentes a cotrimoxazol, linezolid (LZD), vancomicina (VAN) o daptomicina (DAP). Concordantemente, las cepas presentaron una alta prevalencia de genes de resistencia a distintas familias de antibióticos, como son los que codifican enzimas modificantes de aminoglucósidos: aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia (82%), aad(6) y ant(6)-Ia (64%), aadD (16%), aadE (7%), ant(9)-Ia (98%), ant(4')-Ib (16%), sat4 (40%), aph(3')-IIIa (64%), enzimas metilasas: ermA (98%), ermC (4%), betalactamasa: blaZ (82%), rifampicina fosfotransferasa: rphB (91%), y dihidrofolato reductasa: dfrC (1%). Además, todas las cepas presentaron los genes fosB (resistencia a fosfomicina), norA, mgrA, mepA, mepR, sav1866 (resistencia a fluoroquinolonas), tet38 (resistencia a tetraciclinas) y el sistema regulador de 2 componentes arlRS. Respecto a la caracterización de genes que codifican factores de virulencia implicados en la formación de biopelículas, el 98% de las cepas presentaron el gen fnbA y 26% el gen fnbB (codifiantres de las proteínas de unión a fibronectina A y B, respectivamente); 98% el operón icaABCDR; 80% hly/hla y el todas portaban los genes hlb y hld, codificantes de las hemolisinas b y d, respectivamente. No se detectó la presencia del gen bap, ni de los operones pmsA y pmsB en ninguna de las 45 cepas ensayadas. Sobre el 85% de las cepas presentaron otros genes de virulencia asociados a la adhesión, producción de exoenzimas, toxinas, enterotoxinas y la captación de hierro. Los estudios de relación genética mostraron la presencia de 5 clados, destacando el clado principal con cepas portadoras del SCCmec I distribuídas en la zona centro sur de Chile entre los años 2012 al 2017. Los estudios de formación de biopelículas indicaron que sólo el 73% de las cepas eran productoras de biopelículas, y que el 55% y el 18% del total mostraron un índice de formación de biopelículas débil (DFBP) y moderado (MFBP), respectivamente. De estas cepas se seleccionó una de cada fenotipo y se realizaron ensayos de formación y erradicación de biopelículas en presencia de VAN, DAP, LZD y β-CLA separadamente, y en en combinación con este último. Los análisis de MEC indicaron que la cepa no formadora de biopelículas presentó un aumento de la biomasa viva de la biopelícula madura en concentraciones sub-CMI de VAN, DAP y β-CLA, y una disminución frente a LZD. Las cepas con fenotipo NFBP y MFBP mostraron un aumento en la lectura del espectro rojo cuando se expusieron a concentraciones sub-CMI de LZD, y de las combinaciones LZD + β-CLA, VAN + β-CLA y DAP + β-CLA (p= 0,019) y sub-CMI de VAN, DAP, β-CLA, LZD + β-CLA, VAN + β-CLA y DAP+ β-CLA (p=0,037), respectivamente; lo cual indica que a estas concentraciones ensayadas se induce la muerte celular dentro en la biopelícula, permitiendo además su desagregación. Las cepa con fenotipo DFBP no mostró cambios en la producción de biopelículas frente a los compuestos ensayados. Los ensayos de expresión de genes de virulencia no arrojaron resultados concluyentes con la metodología ensayada. Las cepas de SARM-AH referidas por el ISP de Chile analizadas en esta tesis, presentan prevalentemente, a nivel tanto fenotípico como genotípico, el perfil clásico del clon chileno/cordobés con un amplio arsenal de genes virulencia, principalmente codificantes de factores de adherencia, exoenzimas, toxinas y hemolisinas. Por otra parte, el uso de sub-CMI β-CLA, VAN y DAP contribuyen al a formación de biopelículas en una cepa con fenotipo no productor de biopelículas. El uso de combinaciones a concentraciones sub-CMI de 1 μg/mL LZD, y de las combinaciones de 1 μg/mL LZD +16 μg/mL β-CLA, 0,5 μg/mL VAN + 16 μg/mL β-CLA y 0,125 μg/mL de DAP + 16 μg/mL β-CLA, provocan una disminución de la formación de esta biopelícula, favoreciendo su erradicación.
El aumento de la actividad transamidante de TG2 potencia la vía amiloidogénica en modelos de la enfermedad de Alzheimer.
(Universidad de Concepción, 2023) Panes Fernández, Jessica Daniela; Fuentealba Arcos, Jorge
La Enfermedad de Alzheimer (EA) es la principal forma de demencia que afecta a los adultos mayores. Se caracteriza por una muerte neuronal progresiva en zonas de hipocampo, corteza y amígdala. Se postula que uno de los principales agentes tóxicos responsables de la neurodegeneración es la agregación tóxica del oligómeros del péptido β-amiloide (AβOs), ya que inducirían los principales eventos celulares con los que cursa esta patología, tales como dishomeostasis del Ca+2, disfunción mitocondrial, y la falla sináptica. TG2 es una enzima ubicua cuya función principal es la formación de enlaces isopeptídicos entre proteínas o péptidos, cuyo sitio catalítico se activa frente a concentraciones micromolares de Ca2+. Se ha descrito un aumento de la transcripción de TG2 en diferentes modelos transgénicos de la EA, así como en corteza de pacientes con EA. En esta tesis doctoral se evaluaron cambios en los niveles de TG2 en distintos modelos de la EA, y el efecto de la función transamidante de la enzima TG2 en la agregación del péptido Aβ, y sus principales efectos tóxicos en la función mitocondrial y neuronal. Observamos que los niveles de TG2 en el hipocampo de ratones J20 de 10 meses estaban aumentados (246 ± 17%), y que la actividad transamidante estaba potenciada (159 ± 20%), en comparación con animales WT de la misma edad. Observamos un aumento significativo de la expresión de TG2 en lisado total de hipocampo (286 ± 5 %,), y en fracción mitocondrial (313 ± 4 %) de ratones APP/PS1, en comparación con los ratones WT de la misma edad. Además, neuronas del hipocampo tratadas de forma crónica con oligómeros de Aβ (AβOs, 0.5 μM) mostraron un aumento de la inmunoreactividad de TG2 (146 ± 17%) en comparación con células no tratadas. Conjuntamente, evaluamos la capacidad de TG2 para promover los procesos de agregación del péptido Aβ, comparándola con la formación “autocatalítica” previamente estandarizada por nuestro grupo de investigación. La conversión amiloide inducida por TG2, mostró seguir una cinética hiperbólica exponencial, y fue capaz de inducir agregados con un tamaño medio de 7-13 unidades (∼28, 40, 52 kDa) que presentaban una alta citotoxicidad (85 ± 3 %). En tanto que, la formación autocatalítica mostró seguir una cinética sigmoidal, formando agregados más pequeños de tamaño de medio de 7 unidades (∼28 kDa) que presentaban una menor citotoxicidad (69 ± 3 %). El tratamiento agudo con AβTG2 indujo una rápida sobrecarga de Ca2+ citosólico (300 ± 22%) y Ca2+ mitocondrial (335 ± 43%). Utilizando la técnica de PLA, observamos que la formación del complejo IP3R/VDAC1 aumentó en las neuronas expuestas a AβTG2 bajo tratamientos crónicos (220 ± 12%). Mediante registros de patch clamp, observamos un aumento en la actividad neuronal (30 min, 257 ± 14%), que disminuyó bajo tratamientos crónicos (AβTG2 24h: 30 ± 5%). Nuestros análisis in silico mostraron que el dominio catalítico de TG2 puede interactuar con el péptido Aβ en la región N-terminal (ΔG: -10.9, Kd: 9.754e-006, Energía del complejo: -1504). De forma complementaria, quisimos evaluar la expresión de TG2 frente a la inhibición parcial del complejo mitocondrial I (MCI) con el fármaco CP2 (25 mg/kg/day) en ratones APP/PS1 sintomáticos de 24 meses, tratados durante 15 meses. Observamos que CP2 fue capaz de revertir la sobrexpresión de TG2 en animales APP/PS1 en comparación a los animales no tratados. Finalmente, quisimos correlacionar estos cambios con marcadores de función mitocondrial utilizando los mismos modelos animales. Demostramos que CP2 restaura la morfología mitocondrial, y la comunicación retículo-mitocondria, utilizando reconstrucciones tridimensionales de volúmenes obtenidas por microscopía electrónica en serie. En conjunto, nuestros resultados indican que cambios en la formación de agregados de Aβ en modelos de la EA estaría asociada a un incremento de la actividad transamidante de TG2, por lo que puede ser un potencial blanco para el desarrollo de estrategias farmacológicas en el tratamiento de la EA, y respaldan adicionalmente el desarrollo de inhibidores de TG2 como una estrategia para prevenir la agregación amiloide observada en la EA. Se requerirá avanzar en estudios adicionales, que profundicen en los mecanismos que regulan la transcripción de TG2, y los elementos involucrados en la aceleración de la vía amiloidogénica durante la progresión de la EA.
Rol de IIIG9 en la mantención de uniones adherentes y la polaridad de células ependimarias normales.
(Universidad de Concepción, 2023) Oviedo Iturra, María José; Salazar Martínez, Katterine
IIIG9 (PPP1R32/SAXO4) es la subunidad regulatoria 32 de la proteína fosfatasa-1 (PP1) de la cual existe escasa información sobre su función. En el sistema nervioso central (SNC) adulto, presenta una localización restringida a cilios móviles, en las uniones adherentes y el citosol de las células ependimarias. Reportes preliminares de esta tesis indicaron que la inhibición in vivo de IIIG9 en la pared ventricular adulta genera denudación ependimaria parcial y presencia de células no polarizadas que internalizan las cadherinas. Sin embargo, hasta la fecha se desconoce un mecanismo molecular que explique la acción de IIIG9 en los complejos proteicos que estabilizan las uniones adherentes. Además, es desconocida la relevancia de IIIG9 en la mantención de las uniones adherentes en las células progenitoras de la pared ventricular, llamadas glias radiales (RGC), y sus efectos en la formación de neuronas y otros tipos de células gliales, como astrocitos. En esta tesis postulamos que IIIG9 forma un complejo con la proteína fosfatasa-1 alfa y Par-3 (proteína de polaridad celular), promoviendo la mantención de las uniones adherentes durante la polarización y diferenciación de las células ependimarias. En el primer objetivo determinamos que IIIG9 se induce tempranamente en el periodo embrionario (E11), con una distribución polarizada hacia el cuerpo de la glia radial, junto a las cadherinas, PP1 alfa y Par-3. La distribución polarizada de estas proteínas se mantiene en la etapa postnatal (PN) y en el epéndimo adulto. Mediante análisis de inhibición in vivo en animales embrionarios (inyección adenoviral en E16 y análisis en cerebros PN4) reportamos un fenotipo de heterotopia ventricular, representado por cúmulos celulares que expresan marcadores de diversos linajes (glias radiales, precursores neurales y gliales). Este efecto fue acompañado de cambios en el patrón de distribución de las cadherinas respecto a la condición control. En zonas marginales de la corteza cerebral, se observaron cúmulos celulares sugiriendo la presencia de heterotopia cortical, rodeada de astrogliosis reactiva. Además, se observa una reducción del área inmunoreactiva para GFAP que sugiere una reducción en la población de astrocitos marginales. En nuestro segundo objetivo, reportamos la interacción entre IIIG9/E-cadherina, IIIG9/PP1 y Par-3/E-cadherina a nivel de los cilios y las regiones basolaterales de las células ependimarias. Similar a lo que observamos en un modelo in vitro de células MDCK polarizadas. Finalmente, mediante análisis de FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) determinamos la interacción entre IIIG9 y PP1 alfa en células HEK292T. En conclusión, nuestros hallazgos indican que IIIG9 (PPP1R32/SAXO4) promueve la mantención de la polaridad de la glía radial (célula troncal) y de las células ependimarias, a través de las uniones adherentes. Esta función podría ser dependiente de la interacción de IIIG9 con cadherinas, PP1y posiblemente con Par-3. Así la correcta función de IIIG9 podría limitar la aparición de patologías del desarrollo cerebral como la dislexia, la epilepsia, el autismo, entre otras; y del cerebro adulto como la hidrocefalia.
Cambios en la expresión y función del receptor de glicina en el Núcleo Accumbens durante el envejecimiento.
(Universidad de Concepción., 2023) Konar Nié, Macarena Sofía; Aguayo Hernández, Luis
The nucleus accumbens (nAc) is a key brain structure in the reward system. The nAc receives and integrates afferent signaling fr om several brain regions. Inhibitory control is mediated by gamma aminobutyric acid receptors (GABA A ) and glycine receptors (GlyR). Reports from our laboratory demonstrated the presence of glycinergic synaptic currents, coming from a brain region not yet identified. This project aimed to determine the changes in glycinergic transmission in the nAc during aging. Two specific objectives were set: SO1: Characterize the temporary and sub cellular expression of GlyRs in the nAc of adult and aged mice, and SO2: Characterize the presence and functionality of the glycinergic input(s) that reach the nAc of adult a nd aged mice. Using Western blot, animals aged 12 and 18 months were found to show a significant reduction in the β subunit of GlyR, which allows the receptor to anchor to the synapse, and a decrease in α2 and α3 subunit mRNA using quantitative PCR. The ex pression of a Cre recombinase dependent retrograde virus in the nAc of GlyT2
Regulación transcripcional de NUAK1 por SALL2 frente a estrés metabólico.
(Universidad de Concepción., 2023) Álvarez Martínez-Conde, Claudia Isabel; Pincheira Barrera, Roxana; Castro Alma, Ariel
El estrés metabólico en cáncer es un paso crítico para la migración, invasión y metástasis. NUAK1, un miembro de la familia de quinasas relacionadas a AMPK (ARKs), se encuentra desregulado en algunos tipos de cáncer. Su sobreexpresión promueve migración, metástasis y supervivencia celular frente a distintos contex-tos, incluyendo estrés metabólico. Datos de nuestro laboratorio muestran que NUAK1 es inducido transcripcionalmente frente a la carencia de glucosa; sin embar-go, se desconocen los mecanismos que participan en esta respuesta. Se ha pro-puesto que SALL2, un factor de transcripción con roles duales en el cáncer podría estar involucrado. Aunque SALL2 generalmente actúa como un supresor tumoral, en condiciones de estrés metabólico su expresión aumenta y contribuye a la supervi-vencia en células MEF; sin embargo, el mecanismo mediante el cual SALL2 ejerce este rol no ha sido reportado. Para investigar la relación entre NUAK1 y SALL2, se realizaron análisis bioinformáticos utilizando bases de datos como miPanda y R2, los cuales mostraron una correlación positiva entre los niveles de SALL2 y NUAK1 en varios tejidos. De acuerdo con esos análisis, encontramos una dependencia de SALL2 para el incremento en la expresión de NUAK1 frente a estrés metabólico por carencia de glucosa. Con el fin de determinar si NUAK1 es un blanco directo de SALL2, se analizó el promotor de NUAK1 humano y Nuak1 de ratón, en los cuales se encontraron sitios consenso de unión a SALL2 conservados entre ambas especies. Ensayos de gen reportero de luciferasa demostraron que la ganancia de función de SALL2 incrementa la actividad del promotor Nuak1, mientras que estudios de inmu-noprecipitación de cromatina (ChIP) demostraron que SALL2 se une al promotor NUAK1. Al comprobar el rol pro-supervivencia de SALL2 ante estrés metabólico en diferentes modelos, se encontraron tendencias controversiales. Solo se observó el incremento en la supervivencia celular dependiente de SALL2 en modelos de pérdida de función (silenciamiento), y la tendencia fue similar a los datos previos usando células MEF silvestres y deficientes de Sall2. Más aún, nuestros estudios sugieren que existe una dependencia de NUAK1 para el rol pro-supervivencia de SALL2. De forma interesante, la inhibición de NUAK1 en condiciones de alta glucosa, induce la formación de vacuolas que se corresponden con el fenotipo de un tipo de muerte ce-lular conocida como methuosis, las cuales son más abundantes en células shCtrl respecto a las silenciadas (shSall2). Estos datos se condicen con observaciones pre-vias del laboratorio en células de cáncer de colon, asociándose SALL2 con la gene-ración de methuosis. En conjunto, nuestros datos sugieren a NUAK1 como un blanco transcripcional de SALL2 asociado a la supervivencia celular frente a estrés metabólico por carencia de glucosa. Dilucidar los mecanismos normales de regulación transcripcional de NUAK1 es esencial para comprender su desregulación en cáncer.
Evaluación de la capacidad de protección temprana de la variante Thiverval del virus de la Peste Porcina clásica y del rol de CD46 durante su entrada a la célula.
(Universidad de Concepción., 2023) Lamothe Reyes, Yaneysis; Sánchez Ramos, Oliberto; Figueroa Yévenes, Maximiliano
Classical Swine Fever is a multisystemic viral disease that exclusively affects pigs and generates significant economic losses. Its causative agent, the Classical Swine Fever virus, is a virus that exposes in its envelope the Erns, E1 and E2 proteins, which are involved in the initial union and entry into the cell. However, it is the interaction of E2 with one or more receptors on the cell membrane that mediates endocytosis of the virus. According to the evidence, the CD46 membrane protein is involved in this process, although it has been observed that some viral variants, after adaptation to cell culture, develop infection mechanisms independent of this protein. It is unknown if these variants use different mechanisms to enter the cell and if there are modifications in the E2 protein that could account for this phenomenon. Vaccination is a viable alternative to contain the spread of the virus and eventually eradicate it from those regions of the world where it remains endemic. In these contexts, modified live vaccines are widely used, based on virus variants that have been attenuated after numerous passages in culture. However, the appearance of variants of low or moderate virulence has been reported in areas where an active vaccination policy is carried out. These new variants favor the permanence of the virus in the swine population and the generation of chronic and persistent forms of the disease. It is believed that the immunological pressure exerted against vaccines used for many years, such as those based on the China-strain, has contributed to this phenomenon. Therefore, there is a need to evaluate new vaccine alternatives that are equally safe and effective in these scenarios. Thiverval is an attenuated variant of the Classical Swine Fever virus approved by the World Organization for Animal Health for vaccination against the disease. However, the safety and efficacy reports after in vivo studies with this variant date back to the 1970s and were obtained with techniques that are outdated to date. In addition, it is unknown whether the variant can be transmitted to non-vaccinated animals, its replication rate in tissues and organs, and its ability to confer clinical and virological protection in less than 7 days after a single dose. Updating the information regarding this variant and evaluating its ability to confer early protection may favor the use of vaccines based on this strain in settings where disease control has been difficult. On the other hand, it is unknown if the mutations that led to the attenuation of this variant generate changes in the interaction with CD46. This knowledge constitutes a useful tool for the potential development of viral variants that can be used as vaccines, using methods that directly modify the virus entry mechanism with possible cross-sectional use in other veterinary diseases. Therefore, the general objective of this research was to evaluate the early protection capacity of the Thiverval variant of the Classical Swine Fever virus and the role of CD46 during its entry into the cell. To assess the protective effect of the vaccine, two groups of animals were immunized with the Thiverval variant 16 days apart, and a contact group and a control group were also included in the study. All the animals were challenged with Margarita, a highly virulent CSFV variant, at 21- or 5-days post immunization (dpi). The results of this study show that the Thiverval variant has a low replication rate in the organism and that it is not transmitted to the contact group. It also induces the expression of IFN-α and the humoral response against E2 and Erns, the main proteins of the virus envelope. Neutralizing antibodies are detected from day 14 post immunization and clinical protection against exacerbated symptoms of the disease is achieved with only 5 dpi. In addition, the formulation controls viral replication after challenge, virologically protecting the animals. The role of CD46 during viral infection was assessed in vitro by pre-incubating cells with dilutions of an anti-CD46 polyclonal serum prior to the addition of Thiverval. A 1/20 dilution did not generate complete inhibition of Thiverval infection, however, when the Margarita variant was used, the infection rate was practically nil. This suggests the existence of CD46-independent entry mechanisms after attenuation. An in-silico analysis of the E2 structure of the Thiverval variant showed how the presence of mutations in the region previously defined as important for the interaction with CD46 could be affecting the interaction with the receptor. The results obtained in this work demonstrate the early protection capacity of the Thiverval variant against infection by the virus, which makes it an attractive alternative for the control of the disease in endemic areas. In addition, this research lays the groundwork for further investigation of whether mutations that affect a virus's initial interaction with its cell-entry receptors could be responsible for its attenuation. This would open the doors to the possibility of artificially creating attenuated variants for vaccine purposes using an approach based on protein structure and altering the interaction of the virus with its natural receptor.
Desarrollo y Caracterización de un prototipo de hormona folículo estimulante bovina de simple cadena (BscFSH), para reproducción asistida en rumiantes.
(Universidad de Concepción, 2023) Cabezas Ávila, Oscar Ignacio; Sánchez Ramos, Oliberto
La transferencia de embriones permite la diseminación de características genéticas desde animales de alto rendimiento hacia los rebaños bovinos de producción, tanto lecheros como de carne. Para su uso se implementan protocolos de superovulación, que actualmente, utilizan diversas glicoproteínas que no son especie específicas, siendo la hormona folículo estimulante (FSH) extraída de pituitaria de cerdo, la más utilizada actualmente. Sin embargo, esta FSH porcina tiene varias limitantes. Entre ellas, una vida media en circulación de 5 h, contaminación de hormona luteinizante y otras proteínas del extracto, se realizan 8 frecuencias de aplicación en 4 días, lo que precisa un mayor manejo animal y genera estrés, incidiendo significativamente en la respuesta ovárica y la obtención de embriones transferibles. En este trabajo se diseñó y caracterizó una variante recombinante de cadena única, derivada de la hormona folículo estimulante bovina (bscFSH). Esta variante se diseñó considerando las secuencias aminoacídicas de las cadenas alfa y beta de la FSH nativa de Bos taurus, covalentemente unidas mediante un espaciador de 33 aminoácidos y conteniendo un total de 6 sitios potenciales de N-glicosilación, con estructuras altamente sialiladas. La hormona se produjo en un clon de células CHO genéticamente transformadas y se purificó en un único paso de cromatografía de afinidad, obteniéndose con un 97% de pureza. La bscFSH presentó un tiempo medio de residencia de 66,44 h y un tiempo de vida media en circulación de 44,16 h, administrada por vía intramuscular. Esto nos permitió desarrollar protocolos de superovulación en bovinos con la mitad de la frecuencia de aplicaciones (4 administraciones) utilizada actualmente con las FSH derivadas de pituitaria de cerdo, y obteniendo una mayor cantidad de embriones transferibles. La nueva hormona desarrollada induce una respuesta ovárica eficiente, permite un manejo más amigable, tiene un alto nivel de pureza y está libre de contaminantes animales, evitando posibles zoonosis, y disminuyendo la respuesta inmune y estrés animal.
Asociación de SALL2 y vía WNT/β-CATENINA en cáncer de colon.
(Universidad de Concepción, 2023) Quiroz Lagos, Aracelly Scarlet; Pincheira Barrera, Roxana Jacqueline
SALL2 es un factor de transcripción implicado en el desarrollo embrionario, y funcionalmente se relaciona con la regulación de la proliferación, migración y supervivencia celular. Análisis de datos masivos de cáncer versus tejidos normales indican que el ARNm de SALL2 se encuentra significativamente disminuido en el cáncer colorrectal (CCR), un tipo de cáncer caracterizado por la hiperactivación de la vía Wnt/β-catenina. De manera interesante, análisis previos de Inmunoprecipitación de cromatina-secuenciación (ChIPseq) del laboratorio sugirien que SALL2 regula genes asociados con la vía Wnt. Sin embargo, a la fecha no se ha caracterizado la expresión proteica de SALL2 en tejidos de colon normal o CCR. Por otra parte, se desconoce el rol de SALL2 en CCR y su relación con la vía Wnt. Para caracterizar la expresión de SALL2 en tejidos de colon, se construyó un tissue microarray usando 130 biopsias de archivo del Hospital Guillermo Gantt Benavente incluyendo colon normal, adenoma y CCR, y se evaluó la expresión y localización de SALL2 mediante inmunohistoquímica. Encontramos que SALL2 se expresa en el núcleo y el citoplasma del epitelio, y en el estroma del colon normal se expresa en fibroblastos. Sin embargo, su expresión está disminuida en el adenoma y ausente en el CCR, coincidiendo con los resultados bioinformáticos previos. En biopsias de CCR observamos una correlación negativa entre la expresión de SALL2 y la expresión de β-catenina nuclear en el frente migratorio, un marcador pronóstico. Esta correlacion se confirmó en células CCR con ganancia y pérdida de función de SALL2 a través de inmunofluorescncia y fraccionamiento subcelular. Además, evaluamos la dependencia de SALL2 en la expresión de blancos de la vía Wnt por Western blot y qRT-PCR, encontrando una correlación positiva entre SALL2 y AXIN2, un importante regulador negativo de la vía Wnt. El análisis del promotor de AXIN2 identificó varios sitios de unión putativos de SALL2. A nivel mecanístico demostramos que la inducción de SALL2 en modelos celulares doxiciclina inducible, aumenta la actividad del promotor de AXIN2. A través de ChIP-PCR demostramos que SALL2 se une a la porción proximal del promotor de AXIN2, lo que confirma una regulación transcripcional dependiente de SALL2. Finalmente, mostramos que el eje SALL2-AXIN2 es necesario para la respuesta de supervivencia a XAV939, un inhibidor de la vía Wnt. En conclusión, nuestro estudio confirma que SALL2 regula positivamente la transcripción de AXIN2. Se propone que la pérdida de la expresión de SALL2 durante la progresión del CCR contribuye a la disminución de los niveles de AXIN2, lo que contribuye a la hiperactivación de la vía Wnt.
Influencia de secuencias de ADN en procesos activos que determinan el posicionamiento nucleosomal.
(Universidad de Concepción, 2023) Amigo Bastías, Roberto Antonio; Gutiérrez Contreras, José Leonardo
La posición de los nucleosomas tiene un gran impacto en procesos celulares que involucran interacción proteína-ADN, como es el caso de la replicación, reparación y transcripción. En Saccharomyces cerevisiae los promotores de genes se encuentran enriquecidos en secuencias homopoliméricas de ADN denominados tractos poli (dA:dT), las cuales se relacionan con la presencia de regiones libres de nucleosomas (NDRs). En otros organismos, como ratón y humano, la presencia de tractos poli (dA:dT) es menor y su distribución es más amplia; sin embargo, mantienen su capacidad de excluir nucleosomas, lo que podría significar que existen mecanismos comunes que se han conservado durante la evolución. ¿Cómo se forman y mantienen los NDRs? Estudios a nivel de genoma completo han determinado que los complejos remodeladores de cromatina dependientes de ATP juegan un papel clave en este fenómeno, donde existen complejos denominados “despejadores”, que abren y forman los NDRs, y complejos denominados “cubridores”, que cierran los NDRs. Además, otros estudios han encontrado una relación entre la acción de los complejos remodeladores de cromatina dependientes de ATP y la presencia de los tractos poli (dA:dT), donde la acción de factores de transcripción también estaría implicada. Sin embargo, aún se desconocen los mecanismos moleculares de la comunicación que existe entre los diferentes elementos que se encuentran en los NDRs. Por este motivo, en el presente trabajo buscamos determinar la influencia de los tractos poli (dA:dT) sobre la actividad remodeladora de nucleosomas de los complejos ISW1a, RSC y ySWI/SNF, los cuales cumplen diferentes roles en la mantención de los NDRs. Además, estudiamos cómo factores de transcripción pueden influir en la dinámica entre estas secuencias y los complejos estudiados. Para llevar a cabo nuestro estudio, usamos sondasmononucleoso-males reconstituidas in vitro que poseían diferentes configuraciones de los tractos poli (dA:dT), con las que se ejecutaron ensayos de remodelación analizando la acción de los complejos purificados. En nuestros resultados hallamos que estas secuencias pueden afectar de manera directa varios aspectos de la acción de estos complejos, como: la unión al nucleosoma, la intensidad de la actividad de remodelación y la dirección en que ejecutan ésta. Además, observamos que la orientación de los tractos poli (dA:dT) afecta diferencialmente a los complejos remodeladores de cromatina estudiados. Por otro lado, encontramos que los factores de transcripción podrían ejercer efectos diferenciales sobre ISW1a y RSC. Estos resultados realzan la importancia y el impacto que tienen los tractos poli (dA:dT) en el posicionamiento nucleosomal y ayudan a dilucidar los mecanismos mediante los cuales estas secuencias ejercen sus efectos.
Microbiota en salmón del atlántico: Evaluación del rol de la comunidad microbiana en peces de cultivo y su relación con la salud durante el ciclo productivo.
(Universidad de Concepción., 2022) Morales Rivera, María Fernanda; Gallardo Escárate, Cristian
Existe una creciente preocupación en garantizar el bienestar animal en la acuicultura. A tal efecto, la microbiota intestinal es un campo prometedor para evaluar y mejorar este bienestar. Lo anterior debido a que posee una gran relevancia en el hospedero influenciando, por ejemplo, el sistema digestivo e inmune. En ese sentido, además de la taxonomía, ha crecido el interés por conocer la funcionalidad metabólica de las comunidades microbianas, debido a que ofrece ventajas al momento de evaluar el efecto sobre los cambios en el entorno. El objetivo de esta tesis fue establecer si la estructura taxonómica y funcional de la comunidad microbiana en salmón del Atlántico brinda herramientas para evaluar el bienestar animal durante el proceso productivo. Para este trabajo, se utilizó la secuenciación de la región V1-V9 del gen del ARNr 16S mediante Nanopore MinION. Posterior a ello, la asignaciones taxonómicas se realizaron mediante la plataforma “Epi2Me de Oxford Nanopore” o por la herramienta “NanoCLUST”. Además, para el cálculo de diversidad taxonómica se utilizó el paquete “Vegan” en el programa “R studio”, con el cual se calculó la diversidad alfa y la estimación de uniformidad por el índice de Pielou. La estructura de la comunidad microbiana se analizó utilizando Bray-Curtis con un análisis de coordenadas principales (PCoA). Por último, la predicción funcional del metagenoma se realizó mediante PICRUSt2 utilizando la bases de datos MetaCyc. Para el primer análisis, se determinó la taxonomía de muestras de intestino de salmón del Atlántico con distención abdominal (DA), sin distención abdominal (no_DA) y muestras de agua de la Bocatoma (Boca), decantador (Deca), entradas y salidas del biofiltro (BF) de un sistema de recirculación acuícola (RAS) de agua dulce. Esto para identificar la microbiota en peces afectados y enfermos durante un brote epidémico posterior a un evento de vacunación. Las muestras de intestino de los peces con (DA) fueron las que menores índices de diversidad presentaron, junto con una dominancia de Proteobacteria. Además, Aliivibrio wodanis es el principal patógeno presente en los peces con DA y un probable agente etiológico de los peces enfermos. Por otro lado, la microbiota de los peces no_DA poseen una mayor contribución en los pathway relacionados con metabolismo de aminoácidos y fermentación de ácidos grasos de cadena corta, lo que es indicativo de una mejor salud con respecto a los peces con DA. Adicionalmente, se determinó la contribución al metabolismo de compuestos inorgánicos utilizando la base de datos de “KEGG Ortology” para la construcción de mapas metabólicos con la herramienta “KEGG Mapper” enfocados en el metabolismo del nitrógeno y sulfuro. Como resultado, encontramos que el metabolismo del sulfuro es el más representado en peces DA. Además, los procesos de desnitrificación y nitrificación se encuentran favorecidos en la muestra de agua Deca, por sobre las otras, lo que tiene estrecha relación con el rol que posee. Posterior a esto, se evaluó la taxonomía de smolts durante su transferencia al agua de mar bajo diferentes tratamientos y se analizó la metagenómica funcional de la microbiota del intestino de los peces. Esto incluyó un grupo de muestreo sometido a la alimentación mediante una dieta funcional (FD) previo al proceso de transferencia al agua de mar. Todo lo anterior, con el objetivo de evaluar si un cambio gradual en la salinidad (GSC) previo a la transferencia de agua de mar favorece la diversidad de la microbiota por sobre un shock osmótico (SS). Como resultado, encontramos que la riqueza y diversidad microbiana fueron mayores en los peces sometidos a GSC, lo que sugiere una asociación positiva entre la comunidad microbiana y la salud de los peces. Además, se hacen presentes bacterias del género Vibrio en las muestras de intestino de los peces en agua de mar que no estaban presentes en agua dulce ni durante el GSC. Además, los peces alimentados con FD previo a un choque salino, presentan menos abundancia de este género. En cuanto a la funcionalidad metabólica, la biosíntesis de aminoácidos como valina, leucina e isoleucina se encuentran favorecidos en los peces previamente alimentados con FD. Por otro lado, la degradación de aminoácidos esenciales está favorecida en los peces alimentados con FD y en los sometidos a un SS. Por otro lado, la degradación de drogas, contaminantes y otros compuestos aromáticos se encuentran favorecidos en los peces alimentados con FD y en los peces sometidos GSC. Para finalizar, se estudió la microbiota de Caligus rogercresseyi de diferentes zonas del sur de Chile, como potencial reservorio de patógenos que pueden afectar al salmón del Atlántico. Para ello, de los resultados taxonómicos, se filtraron aquellos que corresponden a bacterias patógenas de peces y se determinaron los índices de diversidad. Se identificaron patógenos pertenecientes al género Tenacibaculum. Adicionalmente, la abundancia y diversidad de patógenos está directamente relacionada con la biomasa de salmón producida en cada una de las zonas. En resumen, el conocimiento de la estructura taxonómica y funcional de la microbiota del intestino nos permite evaluar que peces poseen un mejor estado de salud con respecto a otros. Brindándonos una herramienta para reconocer signos de enfermedad. Además, nos permite evaluar la calidad microbiológica del agua y nos brinda información sobre la microbiota de patógenos potenciales totales, tanto en el agua como en otros parásitos como C. rogercresseyi.
El Aumento de D-Glucosa Extracelular Modifica el Estado de Metilación Global del ADN y la Función de Adhesión de las Células Progenitoras de Endotelio Humano Tempranas.
(Universidad de Concepción, 2023) Fernández Garcés, Paulina Carola Tálitha ; Gutiérrez Gallegos, Soraya Elisa
Diabetes mellitus tipo 2 (DM2), constituye una enfermedad metabólica atribuida a factores genéticos y ambientales, que afecta las funciones angiogénicas de las Células Progenitoras Endoteliales Humanas (hEPC) las cuales no logran ser restauradas en respuesta a un buen control glicémico, manteniendo así, alterada su función en el tiempo. Por lo tanto, es probable que la exposición permanente a un ambiente con niveles de glucosa superiores a los valores plasmáticos normales (5mM o 90mg/dl), produzca alteraciones a nivel epigenético que puedan explicar la mantención de las alteraciones angiogénicas en las EPC. En la presente investigación, hEPC fueron cultivadas durante 4 días (hEPC4d) en 5mM (90mg/dl) de D-Glucosa, concentración equivalente a valores plasmáticos normales, 10mM (180mg/dl) para simular una concentración de DGlucosa considerada como "clínicamente aceptable" en pacientes diabéticos, y 20mM (360mg/dl) de D-glucosa para simular un ambiente hiperglicémico en pacientes diabéticos. Posteriormente, se evaluó la capacidad de adhesión de las células a una matriz de fibronectina. Para evaluar si las concentraciones de Dglucosa tenían impacto en los niveles de metilación global del ADN de hEPC-4d, se midieron los niveles de 5-metilcitosina (5mC), 5 hidroximetilcitosina (5hmC) y los niveles de expresión de los genes TET1 y TET2. Los resultados obtenidos indican que la suplementación del medio de cultivo con 20mM de D-Glucosa resulta en una disminución de la adhesión celular y adicionalmente, al cultivar las células hEPC-4d en 10mM y 20mM se puede observar una hipometilación global del ADN, y un aumento de 5hmC. Estos cambios en el patrón de metilación no fueron acompañados por cambios en los niveles de ARNm de los genes TET1 y TET2. Por lo tanto, se concluye que 20mM de D-glucosa genera una hipometilación del genoma en las hEPC-4d y una disminución de su capacidad de adhesión, fenómeno independiente de los niveles de expresión de los genes TET1 y TET2. Aunque la concentración de D-Glucosa considerada como glicemia "clínicamente aceptable" en un paciente diabético (10mM o 180mg/dl), no produce cambios significativos en la adhesión de hEPC-4d, sí se observa una hipometilación global del genoma, que podría ser la responsable de la alteración de las funciones angiogénicas de estas células en pacientes que, desde el punto de vista clínico, tienen un buen control en los niveles plasmáticos de glucosa.
Producción de nanopartículas de selenio en Pantoea agglomerans y Lactiplantibacillus plantarum y su aplicación biotecnológica como suplemento dietético para peces salmónidos.
(Universidad de Concepción., 2022) Yáñez Lemus, Francisco Orlando; Campos Araneda, Víctor Leandro
El selenio (Se) es un micronutriente traza esencial para la salud de humanos, animales y microorganismos. Las nanopartículas de selenio (Se0Nps) atraen el interés de la ciencia y de diferentes áreas industriales debido a su biocompatibilidad, biodisponibilidad y baja toxicidad. Por lo tanto, debido a su mayor bioactividad, las Se0Nps se están utilizando en diversas aplicaciones biomédicas y productivas. En general, Se0Nps pueden ser sintetizadas mediante métodos físicos, químicos y biológicos. Sin embargo, las Se0Nps sintetizadas biológicamente demuestran una mayor compatibilidad con órganos y tejidos, humanos y animales. El objetivo del presente estudio fue biosintetizar Se0Nps en Pantoea agglomerans UC032 y Lactiplantibacillus plantarum S14 y evaluar su potencial biotecnológico como suplemento nutricional para el mejoramiento del estado oxidativo, desempeño inmunológico y parámetros productivos en truchas arcoíris (Oncorhynchus mykiss) de cultivo. Evaluamos el efecto de las Se0Nps funcionalizadas con L-cisteína (Se0Nps/L-Cys), como suplemento nutricional, sobre el estado inmunológico, oxidativo y parámetros productivos en O. mykiss. TEM y SEM-EDS mostraron la acumulación de Se0Nps esféricas compuestas por selenio elemental (Se0) como depósitos intracelulares y extracelulares en Pantoea agglomerans UC-32. La capacidad antioxidante in vitro de Se0Nps/L-Cys fue significativamente más eficiente en la captura de ROS que Se0Nps y Na2SeO3. También evaluamos el efecto de Se0Nps/L-Cys sobre la viabilidad celular y el estrés oxidativo en las líneas celulares RTgill-W1 y RTS-11 y cultivo celular T-PHKM de O. mykiss. Se0Nps/L-Cys mostró ser menos tóxica y con mayor actividad antioxidante comparada con Se0Nps y Na2SeO3. Finalmente, la dieta Se0Nps /L-Cys tuvo un efecto significativamente mayor en la actividad de la lisozima plasmática y la actividad del estallido respiratorio (respuesta inmunitaria innata), en la actividad de la Gpx tisular (estado oxidativo) y en la acumulación de reservas energéticas y bienestar (parámetro productivo) en los peces cuando se comparó con el efecto de las Se0Nps y del Na2SeO3. También obtuvimos bacterias ácido-lácticas (LAB) a partir del contenido intestinal de trucha arcoíris. De estas, se seleccionaron candidatos probióticos con capacidad de biosintetizar Se0Nps. Para determinar la potencialidad probiótica, cada cepa LAB fue evaluada mediante caracterización morfológica y las siguientes pruebas: actividad antimicrobiana, susceptibilidad antibiótica, actividad hemolítica, catalasa, hidrofobicidad, viabilidad a pH bajo y tolerancia a sales biliares. Dos cepas de LAB (S4 y S14) cumplieron con características de probióticos potenciales, pero la cepa S14 redujo Na2SeO3 y biosintetizó Se0Nps. La cepa S14 se identificó, mediante análisis de ADNr 16S, como Lactiplantibacillus plantarum. Mediante microscopía electrónica se observó Se0Nps de 98 a 245 nm de diámetro ubicadas en la superficie celular de S14. La dieta de la trucha arcoíris fue suplementada con 108 UFC g-1 de materia seca de alimento de Lp plantarum S14 enriquecida con Se0Nps (LABS14-Se0Nps) o sólo con 108 UFC g-1 de materia seca de alimento de Lp. plantarum S14 (LABS14) durante 30 días. Los días 0, 15 y 30 se tomó medidas morfométricas y muestras sanguíneas y el día 30 además, se obtuvo tejido hepático y muscular de ambos grupos, más controles (sin suplementación dietética). La suplementación dietaria con LABS14-Se0Nps mejoró significativamente las actividades de la lisozima plasmática, el estallido respiratorio, la Gpx tisular y parámetros productivos en comparación con los peces suplementados con LABS14 y los controles. Consideramos que las Se0Nps/L-Cys y las LABS14-Se0Nps son un aporte biotecnológico fácil de implementar, con un reducido impacto ambiental y con potencialidad de ser usadas por la industria salmonicultora como un suplemento nutricional capaz de mejorar parámetros fisiológicos y productivos en la trucha arcoíris. En consecuencia, las hipótesis planteadas en esta tesis fueron aceptadas.
Estudio del efecto de la activación de la vía de señalización Wnt canónica sobre la regeneración de la unión neuromuscular.
(Universidad de Concepción., 2022) Bermedo García, Francisca; Henríquez Hohmann, Juan Pablo
La unión neuromuscular (UNM) es una sinapsis periférica compuesta por un terminal nervioso, una especialización de la fibra muscular y células de Schwann terminales. Aun cuando la UNM puede sufrir daño a causa de patologías o lesiones a los nervios periféricos, esta sinapsis posee mayores capacidades regenerativas que las sinapsis centrales. En modelos murinos, luego de daño mecánico por aplastamiento del nervio, la reinervación de los dominios postsinápticos conduce a una recuperación funcional exitosa, mientras que, en humanos, el daño a nervios periféricos frecuentemente resulta en una recuperación funcional ineficiente. La caracterización del nicho regenerativo de la UNM denervada, así como de las proteínas y vías de señalización que participan de la mantención de este nicho, es fundamental para explicar y potencialmente intervenir con el objetivo de lograr mejores resultados en la recuperación funcional de la UNM. Una de las vías de señalización que participa durante el desarrollo y maduración de la UNM, y que se activa en los músculos denervados luego de daño al nervio, es la vía de señalización Wnt canónica. Sin embargo, se desconoce cuál es la consecuencia morfológica y funcional de la activación de la vía de señalización Wnt durante la regeneración de la UNM. A partir de resultados previos que indican que la activación de la vía Wnt canónica resulta en una desorganización de las sinapsis neuromusculares, la hipótesis de este trabajo de tesis es que la regeneración funcional de la sinapsis neuromuscular depende de adaptaciones morfológicas perdurables y es regulada negativamente por la activación de la vía de señalización Wnt canónica. Para probar esta hipótesis, el objetivo general de este estudio fue estudiar el comportamiento morfológico y funcional a largo plazo en la regeneración de la UNM y el efecto de la XVI activación de la vía de señalización Wnt canónica en el proceso, considerando dos objetivos específicos: i) identificar los fenotipos morfológicos de los tres componentes celulares y la función a largo plazo durante la regeneración de la UNM del levator auris longus (LAL); y ii) estudiar el efecto de la activación e inhibición farmacológica de la señalización Wnt canónica sobre la morfología de los tres componentes celulares y la función durante la regeneración de la UNM del músculo LAL. Para caracterizar la regeneración de la UNM, hemos realizado un estudio comparativo detallado de las consecuencias a corto y largo plazo de la denervación irreversible (crónica) y reversible (parcial) de la UNM en el músculo craneal LAL de ratón. Nuestros hallazgos revelan la existencia de alteraciones morfológicas en las UNMs regeneradas que persisten aun después de largos periodos de tiempo luego de la reinervación y recuperación de la transmisión sináptica. Además, combinando análisis morfométricos y de estabilidad postsináptica, pudimos discriminar dos formas distintas de fragmentación de la UNM, una estable-definida y una inestable borrosa, que se correlacionan con su potencial de regeneración. Por otra parte, determinamos que la activación de la vía de señalización Wnt canónica retrasa la reinervación de los dominios postsinápticos y que las UNMs reinervadas muestran defectos en la transmisión sináptica. Aun cuando la inhibición de la secreción de los ligandos Wnt no resulta en mejoras significativas importantes sobre la regeneración de la UNM, la inhibición específica de la vía Wnt canónica tiene positivos sobre la recuperación de la transmisión sináptica durante la regeneración de la UNM. En conjunto, nuestros datos muestran que existen cambios permanentes en la XVII morfología de la UNM luego de su regeneración y que, en lugar de ser predictivos del declive de la UNM, estas adaptaciones morfológicas pueden representar una respuesta adaptativa eficiente para una adecuada recuperación funcional. De forma interesante, la vía Wnt canónica tiene efectos negativos sobre la regeneración de la UNM luego de daño al nervio, mientras su inhibición juega un efecto benéfico sobre la regeneración de esta sinapsis. Las adaptaciones morfológicas y el efecto de la vía Wnt sobre la UNM son relevantes para estudios futuros que desarrollen estrategias destinadas a restaurar la función motora luego de daño a los nervios periféricos.
Actividad anticancerígena y antioxidante in vitro de polisacáridos ácidos obtenidos desde hongos pertenecientes a la familia Hymenochaetaceae asociados a bosque nativo de Chile.
(Universidad de Concepción., 2022) Albornoz Muñoz, Verónica Agustina; Campos Araneda, Víctor Leandro; Becerra A., José
El cáncer es una de las principales causas de muerte a nivel mundial. Su padecimiento puede estar vinculado con factores hereditarios, o verse favorecido por malos hábitos como el consumo excesivo de alcohol, de tabaco, o la exposición prolongada a componentes químicos, entre otros factores. Estas condiciones aumentan la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), desencadenando stress oxidativo, el cual produce daños en el material genético que pueden inducir el desarrollo de cáncer. Los tratamientos convencionales aplicados para esta enfermedad, como la quimioterapia, presentan un alto costo monetario y un gran deterioro al estilo de vida de los pacientes; por lo que la búsqueda de nuevos tratamientos o compuestos, naturales o sintéticos, que puedan emplearse satisfactoriamente en el control del cáncer han despertado un gran interés en los científicos. Los polisacáridos de origen fúngico han demostrado presentar una amplia gama de actividades biológicas, tales como actividad antibacteriana, hipoglucémica, inmunomoduladora, antioxidante y anticancerígena. El nivel de actividad anticancerígena que presentan los polisacáridos fúngicos está relacionado con sus características físicoquímicas, incluyendo su composición monomérica y los grupos funcionales asociados a la cadena principal de glucanos. En este trabajo se evaluará la capacidad antioxidante y citotóxica contra líneas celulares tumorales, de los polisacáridos ácidos de cuatro cepas fúngicas, pertenecientes a la familia Hymenochaetaceae presente en bosques nativos del sur de Chile. Los polisacáridos ácidos serán obtenidos desde las cepas FQ1645 (Nothophellinus andinopatagonicus), FQ1626 y FQ1640 (Phylloporia boldo), y FQ1648 (posible Fomitiporia sp.), por medio de una precipitación selectiva con Cetavlon. Los polisacáridos obtenidos (NAAPs, PBAP26 y PBAP40, y APFQ48, respectivamente) fueron caracterizados por análisis infrarrojo con transformada de Fourier (FT-IR). La actividad anticancerígena in vitro fue determinada por análisis de citotoxicidad con MTT y citometría de flujo. Además, la capacidad antioxidante de los polisacáridos fue 15 evaluada usando los radicales libres sintéticos DPPH y ABTS. El análisis de FT IR permitió identificar la presencia de enlaces α y β-glicosídicos tanto en PBAP40 como en APFQ48; mientras que los picos correspondientes a grupos sulfatos fueron evidenciados en NAAPs y APFQ48. Los ensayos de citotoxicidad contra líneas celulares tumorales mostraron que tres de los polisacáridos estudiados (NAAPs, PBAP40 y APFQ48) presentan un mayor efecto contra la línea celular HL-60, con valores de IC50 de 767.16 µg mL-1 , 127.85 µg mL-1 y 800 µg mL-1 , respectivamente. Por su parte, el polisacárido PBAP26 presenta una mayor actividad citotóxica contra la línea celular tumoral HCT-116, con un valor de IC50 de 535.83 µg mL-1 . La evaluación del efecto citotóxico de los polisacáridos contra una línea celular no tumoral permitió evidenciar que todos los polisacáridos ácidos analizados presentan un efecto proliferante en la línea celular HGF-1, obteniéndose valores de supervivencia mayores al 100% con las mayores concentraciones de polisacáridos usadas. En cuanto al efecto de los polisacáridos sobre el ciclo celular de la línea celular HL-60, se pudo observar que todos los polisacáridos producen un aumento de eventos en la fase Sub G1, suponiendo un efecto de arresto de células en esta fase del ciclo celular. Los ensayos de actividad antioxidante evidenciaron que los polisacáridos ácidos de las cuatro cepas en estudio presentan una mayor capacidad reductora del radical DPPH en comparación con el radical ABTS; y que los polisacáridos PBAP40 y APFQ48 presentan la mayor actividad antioxidante con valores de 24.53% y 27.31% de actividad antioxidante, respectivamente. Los polisacáridos analizados presentan una significativa actividad anticancerígena in vitro contra las líneas celulares empleadas, HCT-116, MCF-7 y HL-60, especialmente contra esta última. La bioactividad presentada por NAAPs, PBAP26, PBAP40 y APFQ48 podría estar dada por la presencia de grupos funcionales como grupos sulfatos, así como la existencia de β-glucanos.
Aumento en la expresión de P2X2 inducido por el péptido aβ, su impacto en la endocitosis de APP y en la distribución de Fe65 en la enfermedad de alzheimer.
(Universidad de Concepción., 2021) Godoy Rivera, Pamela Andrea; Fuentealba Arcos, Jorge
La Enfermedad de Alzheimer (EA) es el principal tipo de demencia que afecta a la población adulta mayor y se postula que el principal agente tóxico en la patología de esta enfermedad neurodegeneratitva es el péptido β-amiloide (Aβ). Específicamente, serían los oligómeros solubles del péptido (Aβo) los que provocan los principales efectos neurotóxicos como son la falla sináptica y disfunción mitocondrial. Además, se ha propuesto que estos oligómeros son capaces de formar un poro no selectivo en la membrana plasmática, lo que genera entre otras cosas, la dishomeostasis del Ca2+ intracelular. En nuestro grupo se pudo establecer que este poro también permite la salida de ATP al medio extracelular, potenciando el rol de esta molécula como neurotransmisor, y por ese motivo, en este trabajo quisimos estudiar el impacto que ese incremento tendría en la señalización purinérgica. Es conocido que los receptores purinérgicos cumplen diferentes roles en la comunicación celular en el sistema nervioso central, y en particular, los receptores ionotrópicos P2XR, han sido descritos en roles tan relevantes como la neuroinflamacion (P2X7R), en esta misma familia se encuentra el P2X2R, asociado a una función principalmente neuronal, y cuyas dos isoformas principales son P2X2a y P2X2b. La primera contiene la secuencia completa de la proteína, mientras que la segunda no tiene 69 aminoácidos del extremo C-terminal; cabe señalar que por este motivo solo P2X2a interacciona con Fe65, proteína adaptadora que transloca al núcleo donde activa la transcripción del coactivador 1 α del receptor activado por proliferadores de peroxisoma (PGC-1α), regulador maestro de la biogénesis mitocondrial, entre otros. En paralelo, Fe65 puede interaccionar adicionalmente, con la proteína precursora amiloide (APP), y se postula que regula el tráfico y procesamiento proteolítico de esta. APP puede ser proteolizada por la vía amiloidogénica (que da origen al péptido Aβ) y no amiloidogénica. Ambos procesamientos ocurren en distintos compartimentos celulares; la vía amiloidogénica ocurre principalmente en compartimentos con pH más ácido, como endosomas, mientras que la no amiloidogénica ocurre principalmente en la membrana plasmática. Por este motivo, el tráfico y endocitosis de APP son eventos celulares relevantes para la producción del péptido Aβ, que podrían condicionar la toxicidad amiloide y la fisiopatología de la EA. Este trabajo se basa en la evidencia previa del laboratorio, donde se ha demostrado la sobreexpresión de P2X2R tras la exposición a Aβo, y se enfocó en estudiar posibles consecuencias celulares y moleculares, asociadas a este aumento de la expresión de P2X2R. De los resultados obtenidos, confirmamos que P2X2R aumenta en modelos celulares tratados con Aβo y en el cerebro de pacientes con la EA. Específicamente, nuestros estudios en modelos celulares, nos sugieren que la isoforma P2X2a se expresa principalmente. Además, observamos que tanto la exposición a Aβo como la sobreexpresión de P2X2a, generan una disminución de la razón núcleo-citosol (N-C) de Fe65 y en los niveles totales de PGC-1α. Finalmente, en neuronas hipocampales expuestas a Aβo observamos un aumento en la co-localización de APP con Rab5, un marcador de endosomas tempranos, que sugiere un aumento en la endocitosis de esta proteína. Mientras que en células PC12 observamos un aumento en los niveles de Aβ luego de la sobreexpresión de P2X2R. En resumen, nuestros resultados nos permiten plantear la participación del P2X2R, y de la neurotransmisión purinérgica, como elementos relevantes en los mecanismos fisiopatológicos desencadenados por Aβo en la EA, que involucran cambios en reguladores de la función mitocondrial, y del proceso endocitico de APP, con lo cual el P2X2R, se presenta como una nueva e interesante diana farmacológica para el desarrollo de nuevas estrategias experimentales, que reduzcan la toxicidad del péptido amiloide, o frenen el ciclo de toxicidad mediado por la mayor producción de Aβ. Se requerirá avanzar en estudios adicionales, que profundicen en los mecanismos que activan la sobreexpresión de los receptores purinérgicos, y los elementos involucrados en la activación de la vía amiloidogenica.

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