Tesis Doctorado

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Participación de los mediadores proinflamatorios producidos por las células de Kupffer en el daño de hepatocitos en ratas sometidas a shock por torniquete.
(Universidad de Concepción., 2000) Vega Vargas, Virginia Loreto
El síndrome de shock se caracteriza por la generación de un estado hipotensivo severo que resulta en el desarrollo de la falla orgánica múltiple (FOM). Con el fin de estudiar los mecanismos involucrados en el desencadenamiento de la FOM hemos estandarizado un modelo de shock en ratas que consiste en la generación de isquemia/reperfusión en las extremidades posteriores, lo que resulta en la aparición de un daño local que se hace extensivo hacia otros órganos. Resultados previos de nuestro laboratorio han mostrado la existencia de un estrés oxidativo hepático agudo en ratas sometidas a shock por torniquete. El objetivo de este trabajo fue evaluar la participación de las células de Küpffer en el desarrollo del daño hepático. Ratas hembras Sprague-Dawley fueron sometidas a shock por torniquete con o sin pretratamiento con cloruro de gadolinio (GdCl3), sustancia que inactiva y/o destruye a las células de Küpffer. Nuestros resultados muestran que como consecuencia de la reperfusión de las extremidades posteriores se produce la activación de las células de Küpffer lo que resulta en un incremento en el clearance de carbón coloidal y en la síntesis y secreción de citoquinas proinflamatorias (TNF-, IL-1 e IL-6) hacia la circulación. Conjuntamente, observamos que la activación de las células de Küpffer desencadena un estrés oxidativo hepático caracterizado por la disminución en los niveles de GSH y SOD tisular y por un aumento en los productos derivados de la peroxidación lipídica (TBARS) y por la liberación de las transaminasas a la circulación. Además, los resultados señalan que la infiltración leucocitaria del hígado así como las alteraciones hematológicas reportadas en este modelo de shock son consecuencia de la activación de los macrófagos hepáticos. Es importante destacar que el pretratamiento de los animales con GdCl3 previene todas las alteraciones señaladas e incrementa la sobrevida de los animales sometidos a shock por torniquete. Por otra parte, demostramos que la liberación de la xantino oxidasa (XO) desde las extremidades reperfundidas hacia la circulación resulta en un incremento en los niveles de XO circulante y en la activación de las 9 9 células de Küpffer, lo que sugiere que esta enzima sería uno de los mediadores endógenos responsables de la propagación del daño asociado a la isquemia/reperfusión de las extremidades posteriores. Del mismo modo, los estudios in vitro señalan que la XO induce la secreción de mediadores proinflamatorios (TNF-, IL-1 e IL-6) y óxido nítrico en las células de Küpffer provenientes de animales controles. Además, se observó que el cultivo de hepatocitos provenientes de animales controles con medio de cultivo condicionado proveniente de estas células y con XO resulta en alteraciones oxidativas similares a las observadas en los cultivos de hepatocitos provenientes de animales sometidos a shock por torniquete. Estos resultados nos permiten concluir que: a) el daño oxidativo hepático depende de la activación de las células de Küpffer y b) la XO es uno de los mediadores endógenos involucrados en la activación de estas células.
Caracterización molecular de una adenilil ciclasa de oocito de Xenpus laevis, estudio de estructura-función.
(Universidad de Concepción., 2000) Torrejón Quezada, Marcela Eliana; Olate Aravena, Juan
El objetivo general de este trabajo de tesis fue caracterizar a nivel molecular una adenilil ciclasa (A.C.) de oocito de Xenopus laevis y su interacción con otros componentes que participan en el sistema de transducción de señal. Para ello utilizamos sistemas de expresión en células en cultivo (sistema heterólogo), el cual nos permitió realizar estudios de actividad de A.C. en respuesta a GppNHp, forskolina, AlF4- y Ca2+/CaM. Posteriormente, los estudios realizados a través de la técnica de doble híbrido, nos permitieron analizar la interacción entre las regiones citosólicas C1 y C2 de la A.C. de X. laevis y las subunidades Gs silvestres, mutantes y quimeras. Se obtuvo el gen completo que codifica para una adenilil ciclasa (A.C.) de oocito de X. laevis. El cDNA posee un tamaño de 4.372 pares de bases y contiene un marco de lectura abierto para una proteína de 1.355 aminoácidos. La comparación de la secuencia de aminoácidos deducida con secuencias de A.C. de mamífero, mostró un bajo índice de identidad (19,7%-24,2%), excepto con la A.C. de tipo IX de ratón (70%). A través de análisis de transcripción reversa y PCR se detectó expresión del mRNA durante la oogénesis, pero no durante estados tempranos de la embriogénesis (mórula y blástula), indicando probablemente su participación en el proceso de maduración. La expresión de la A.C. de X. laevis en células en cultivo COS-7 y HEK293 resultó en un aumento de la actividad basal, la cual fue estimulada notoriamente por Gpp(NH)p y NaF, pobremente por forskolina e insensible a calcio-calmodulina. Este tipo de regulación es similar al mostrado por la A.C. de tipo IX de ratón, por lo que ambas A.C. representarían una nueva isoforma de A.C. Utilizando el sistema de doble híbrido en levadura se analizó la interacción física entre los dominios C1 y C2 de la A.C. y la proteína Gs. Se encontró interacción entre C2 y entre C1 y C2, pero no entre C1, lo que está de acuerdo con las estructuras cristalinas previamente descritas para este tipo de complejos. También se observó interacción solamente entre el dominio C2 y la especie activa de Gs (G-GTP), lo que concuerda plenamente con estudios previos de tipo cristalográficos y bioquímicos. Todos estos resultados indican que la A.C. de X. laevis pertenece a un nuevo isotipo de enzima dentro de esta gran familia de proteínas que es regulada positivamente por la especie activa de la proteína Gs a través de su dominio citosólico C2.
Resolución de la estructura terciaria de R-ficoeritrina de Gracilaria chilensis.
(Universidad de Concepción., 2000) Contreras Martel, Carlos; Bunster Balocchi, Marta Cecilia
El conocimiento de la estructura tridimensional de las proteínas ha sido una importante herramienta, tanto en el pasado como en el presente, para la comprensión de muchos fenómenos biológicos y juega un papel crucial en la biología molecular actual. La determinación de la estructura de proteínas por difracción de rayos-X constituye una poderosa técnica para su análisis estructural a nivel atómico, lo que permite correlacionar la estructura con la función. El presente trabajo se enfocó a la determinación de la estructura terciaria de R-ficoeritrina de Gracilaria chilensis, proteína encargada de captar y transferir la energía luminosa en el ficobilisoma. El análisis de la estructura permite plantear un modelo de conducción de luz para esta proteína. R-ficoeritrina está constituida por dos tipos de cadenas: y , y por cadenas de unión que forman el agregado 6. La estructura tridimensional de este hexámero se logró mediante cristalografía y difracción de rayos-X. Se obtuvieron datos a 2,7 y 2,2 Å de resolución para sendos cristales. En ambos casos se obtuvieron los mismos parámetros de celda unidad (a=b=187 Å, c=59 Å; ==90º, =120º) y el grupo espacial R3. Los datos de la mayor resolución presentaron el fenómeno de macla. El problema de la fase se resolvió por reemplazo molecular empleando la estructura de R-PE de Polysiphonia urceolata. La solución de la estructura para el cristal maclado se realizó mediante el programa SHELX-97. Los factores R y Rfree obtenido al finalizar el refinamiento fueron 0,16 y 0,25 respectivamente. Cada uno de los residuos aminoacídicos de las cadenas y fueron correctamente asignados, siendo posteriormente confirmado por secuenciación química parcial de ambas Resolución de la estructura terciaria de R-ficoeritrina de Gracilaria chilensis. Resumen XV cadenas. Se reconocieron claramente en los mapas de densidad electrónica dos cromóforos en la cadena (82 y 139), tres en la (82, 158 y 50/61) y una metilación sobre 72N. Además, se logró asignar una región helicoidal de seis residuos de la cadena de unión . En base al análisis estructural de los cromóforos se plantean posibles rutas de transferencia de energía en R-ficoeritrina de Gracilaria chilensis, considerando la ubicación y las distancias intercromóforos. Las coordenadas de R-PE de Gracilaria chilensis fueron depositadas en el Protein Data Bank (1eyx.pdb), constituyendo la primera estructura tridimensional de una proteína resuelta en Chile.
Análisis del mecanismo de remodelamiento nucleosomal asociado con la expresión temporal de genes de histonas alfa durante la embriogénesis temprana del erizo de mar tetrapygus niger.
(Universidad de Concepción., 2001) Medina Díaz, Ricardo Felipe; Montecino Leonard, Martín Alejandro
La regulación transcripcional en eucariontes ocurre en el contexto de la cromatina y está fuertemente influenciada por las barreras impuestas por la estructura nucleosomal. Entonces, una pregunta fundamental en biología es saber ¿cómo el genoma eucariótico es manipulado en el ambiente cromatínico?. In vivo, existe una asociación directa entre la remodelación de la estructura de la cromatina y la expresión regulada de genes eucarióticos. En la presente Tesis Doctoral se estudiaron los cambios que sufre la estructura cromatínica y las interacciones de factores de transcripción como consecuencia de la expresión de los genes de histonas tempranas en erizo de mar. Este modelo presenta grandes ventajas ya que en él es posible el estudio de los mecanismos involucrados en la regulación temporal de la expresión génica durante el desarrollo embrionario. En este sistema, luego de la fecundación, se expresan secuencialmente a distintos tiempos del desarrollo embrionario los genes de las histonas CS, histonas tempranas e histonas tardías. Durante este trabajo se clonó y secuenció el gen de la histona temprana H3 del erizo de mar Tetrapygus niger y se determinó su patrón de expresión, el cual se inicia al estado de 16 células, alcanza un máximo al estado de 128 células y luego declina al estado de larva Pluteus. Se encontró además un sitio hipersensible a DNasa I localizado en la posición –90 de la región promotora de este gen, el cual sólo se detectó cuando se observaron los máximos niveles del mRNA de la histona temprana H3. Se identificó el elemento regulador TnH3CCAAT (nt –94/–77), que incluye al sitio hipersensible a DNasa I, como el responsable de unir un complejo proteico presente al estado de 128 células y cuyo componente de unión al DNA es el factor de transcripción homeodominio CDP/cut. Se estableció un protocolo de purificación de complejos remodeladores de cromatina que pudieran tener un rol en la activación transcripcional temporal. Además, se identificó un complejo de características bioquímicas similares que incluye a CDP/cut como componente de unión al DNA, en un estado del desarrollo embrionario en el cual no se observa expresión del gen de la histona temprana H3 de T. niger. En base a estos resultados se postula un modelo que pretende explicar este cambio en el patrón de expresión de este gen en términos de complejos proteicos que contienen a CDP/cut como componente de unión al DNA y de estructura cromatínica durante el desarrollo embrionario de erizo de mar. Se estudió también el posible rol del remodelamiento de la estructura de la cromatina espermática inmediatamente después de producida la fecundación. Este proceso requiere un remodelamiento de la estructura de la cromatina espermática y el reemplazo de las proteínas histónicas espermáticas por histonas CS de origen materno. En este período tan particular del desarrollo embrionario es necesaria una fuerte decondensación del pronúcleo masculino altamente compactado, con el fin de reestablecer la diploidía del genoma del embrión. En el presente trabajo también se describe por primera vez la presencia de una actividad remodeladora de cromatina dependiente de energía en citoplasma, pero no en núcleo, de óvulos sin fecundar. Esta actividad remodeladora de cromatina contendría como componente catalítico una subunidad relacionada a ISWI. No se detectaron proteínas relacionadas a SWI2/SNF2 tanto en citoplasma como en núcleo de óvulos sin fecundar. Estos resultados nos llevan a postular un modelo en el cual se incluye a esta actividad remodeladora de cromatina, conjuntamente con otras actividades enzimáticas y que explicarían el fenómeno de decondensación del pronúcleo masculino posfecundación.
Estudio de la expresión y función de transportadores de hexosas y vitamina C en células ependimarias normales y tumorales.
(Universidad de Concepción., 2001) García Robles, María de los Angeles; Nualart Santander, Francisco
Los transportadores de glucosa (GLUTs) cumplen una importante función en la adquisición de glucosa a nivel cerebral. La isoforma GLUT1 está presente en las células endoteliales de la BBB y en la barrera de sangre-LCR presente en los plexos coroideos. En neuronas el principal transportador presente es GLUT3. Existe muy poca información de la expresión de GLUTs en las células ependimarias que revisten las paredes ventriculares. Entre las células ependimarias especializadas destacan los tanicitos, células que se localizan en los órganos circunventriculares como la eminencia media. Los tanicitos pueden ser clasificados en 1, 2, 1 y 2, sólo los tanicitos 2 se unen a través de “tight junctions” formando la barrera LCR-eminencia media. Se estudió la expresión y función de GLUTs en tanicitos hipotalámicos de ratón a través de inmunocitoquímica, hibridación in situ y la determinación de parámetros cinéticos. Encontramos una elevada expresión de GLUT1 en tanicitos  y 1, y en los tanicitos 2 una muy baja expresión. Además, detectamos la expresión de conexina 43 y del transportador de lactato MCT1. La expresión de GFAP (marcador de astrocitos) demostró que existe un bajo contenido de astrocitos en las áreas hipotalámicas en que se localizan los tanicitos  y 1. Implementamos cultivos primarios de tanicitos aislados desde hipotálamo de ratón y demostramos que sobrexpresan GLUT1, expresan MCT1 y liberan lactato en respuesta a neurotransmisores como nerepinefrina y glutamato. Por esta razón especulamos que los tanicitos pueden acoplarse metabolicamente con las neuronas de la región del hipotálamo. La microscopía confocal nos permitió determinar que los tanicitos  expresan GLUT2, isoforma que además transporta fructosa y que se expresa principalmente en tejidos que participan en el “sensing” de glucosa. A la fecha, la expresión de GLUT2 en el hipotálamo ha sido demostrada solo por hibridación in situ, no hay datos funcionales que demuestren que GLUT2 se exprese en neuronas o células gliales (tanicitos). Usamos inmunocitoquímica y análisis cinéticos de captación de hexosas para estudiar la expresión de GLUTs en tanicitos hipotalámicos. La microscopía confocal confirma la reacción positiva en el área próximal y distal de los tanicitos . Los tanicitos en cultivos presentaron reacción positiva con anti-GLUT1 y 2. Los ensayos de captación de 2-DOG demostraron que expresan dos sistemas transportadores con Kms de 3 y 40 mM, que corresponden a las descritas para GLUT1 y GLUT2, respectivamente. También logramos establecer que los tanicitos incorporan fructosa, confirmando la presencia de un transportador de fructosa en estas células. Nuestros resultados demuestran que los tanicitos expresan GLUT2. Debido a que los tanicitos están en contacto directo con neuronas, el LCR y vasos sanguíneos hipotalámicos, hipotetizamos que pueden tener la capacidad de detectar y responder a cambios en la concentración de glucosa extracelular y activar la liberación neuronal de factores específicos al fluido extracelular. En el sistema nervioso existe una elevada concentración de vitamina C. Análisis cinéticos de la captación de vitamina C han demostrado que células especializadas incorporan la forma reducida de la vitamina C, ácido ascórbico (AA), a través de un co-transportador de AA/Na+. Recientemente se han clonado dos isoformas de estos transportadores (SVCT1 y 2), estos transportadores incorporan AA con una alta afinidad, SVCT2 es una proteína que se ha detectado principalmente en ojo y cerebro. Varias de las isoformas de los GLUTs transportan eficientemente ácido deshidroascórbico (DHA), la forma oxidada de la vitamina C. Demostramos que SVCT2 es expresado en tanicitos in situ e in vitro. La incorporación de la forma reducida de la vitamina C, en tanicitos, es dependiente de sodio y presenta una Km de 20 M. Los tanicitos también transportan DHA, molécula que es neurotóxica para el sistema nervioso, de tal forma, que los tanicitos pueden realizar una función neuroprotectora reciclando la vitamina C oxidada. Los plexos coroideos están localizados en la región rostral de los ventrículos cerebrales, donde forman la barrera sangre-LCR. La glucosa es transportada por GLUT1 y la vitamina C por SVCT2. Nosotros analizamos la expresión y función de GLUTs y SVCTs en células de papiloma de plexos coroideos humanos. Los análisis inmunocitoquímicos y de hibridación in situ demostraron que estas células mantienen la expresión y la localización basolateral de GLUT1. Por otra parte, las células tumorales no presentaron la capacidad de transportar AA. Sin embargo, las células de los plexos coroideos incorporaron DHA a través de GLUT1. Dado que, en la sangre la vitamina C se encuentra principalmente en la forma reducida, nuestros resultados sugieren que la vitamina C es oxidada extracelularmente, en el tejido circundante por un efecto “bystander”, asociado a la presencia de células estromales y la producción de anión superóxido. Además, las células de los plexos coroideos expresan p47PHOX , una subunidad de la enzima NADPH oxidasa, lo que indica que ellas producen anión superóxido permitiendoles generar DHA.
Historia de la vegetación andina en los valles de Alto Biobío y Lonquimay, Chile centro-sur 38°-39°S), durante el Holoceno estudio paleoecológico basado en el análisis de polen.
(Universidad de Concepción, 2001) Rondanelli Reyes, Mauricio; Marticorena P., Clodomiro
Rol de integrones y cassettes genéticos en la resistencia de acinetobacter baumannii a antibióticos aminoglicósidos.
(Universidad de Concepción., 2002) González Rocha, Gerardo Enrique
Acinetobacter baumannii es un microorganismo que constituye un serio problema hospitalario, por ser agente causal de variadas infecciones nosocomiales, principalmente en pacientes inmunodeprimidos en las unidades de cuidados intensivos. El principal problema de esta bacteria es su elevada y amplia resistencia a los antibióticos comúnmente usados en terapia antiinfecciosa, incluyendo antibióticos -lactámicos, aminoglicósidos y quinolonas. Los antibióticos aminoglicósidos constituyen un grupo importante de compuestos bactericidas que, asociados a los antibióticos -lactámicos, logran efectos sinérgicos, especialmente sobre bacilos Gram negativos. Esta propiedad determina su amplio uso a nivel hospitalario, ejerciendo una fuerte presión selectiva que ha llevado a una rápida y creciente selección de bacterias resistentes. El principal mecanismo de resistencia a estos antibacterianos se basa en la síntesis de enzimas modificantes de aminoglicósidos (EMAs) que acetilan grupos amidógenos o fosforilan o adenilan ciertos grupos hidroxilos. Los genes de EMAs son variados y pueden localizarse en plásmidos, transposones o cassettes genéticos de resistencia insertos en integrones. Estos últimos, constituyen una familia de elementos genéticos potencialmente móviles capaces de integrar y expresar genes de resistencia a antibióticos. La multiresistencia que presentan las cepas de A. baumannii no ha podido ser totalmente fundamentada en la presencia de plásmidos de resistencia, ya que aquellos detectados en esta bacteria no siempre se relacionan con la resistencia a antibióticos. En esta Tesis se evaluó la actividad de amikacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, tobramicina, estreptomicina, trimetoprim, cloranfenicol, sulfametoxazol y tetraciclina sobre 486 cepas de A. baumannii aisladas en diversos hospitales de Chile entre 1990 y 1998. El perfil de EMAs de las cepas se dedujo a partir de su patrón de resistencia a antibióticos aminoglicósidos, pero también se intentó la identificación de los genes que codifican estas enzimas en algunas cepas. Se determinó la prevalencia de integrones de las clases 1, 2 y 3 en 254 cepas y se caracterizó la zona variable de integrones clase 1 y clase 2 en un grupo seleccionado de ellas. Los resultados indicaron que las cepas de A. baumannii aisladas en hospitales chilenos presentan elevada resistencia a los antibióticos aminoglicósidos, especialmente a gentamicina (> 85 %), estreptomicina (> 87 %) y neomicina (> 80 %), con amikacina como el antibiótico más activo, pero con frecuencia de resistencia elevada (> 50 %). La mayor frecuencia de cepas resistentes se encontró entre las cepas de 1994 (> 90 %). Frente a todos los aminoglicósidos el nivel de resistencia fue elevado, con valores de CMI50 que sobrepasan el límite de resistencia establecidos. Todas las cepas fueron resistentes a cloranfenicol y la resistencia a trimetoprim y sulfametoxazol fue elevada (> 85 %). Tetraciclina exhibió niveles de resistencia moderados, con valores de CMI50 que variaron entre 4 g/ml y 16 g/ml; sin embargo, la frecuencia de cepas resistentes fue elevada. La mayor frecuencia de resistencia a todos los antibióticos se encontró en las cepas del biotipo 9 ( 75 %). Experimentos de curación permitieron relacionar un plásmido de más de 30 kb con la resistencia a amikacina, neomicina y kanamicina, específicamente por la pérdida del gen aph(3’)VIa en las cepas curadas. La mayoría de las cepas posee integrones (68,1 %), siendo más prevalente la clase 2 (64,2 %), principalmente en las cepas del biotipo 9. La mayoría de los integrones caracterizados presentó una estructura similar a la encontrada en el transposón Tn7, ya que en ellos se detectaron los cassettes genéticos dfrA1 y ant(3”)Ia. En una cepa se comprobó, además, la integración del gen cat, que codifica resistencia a cloranfenicol, entre los genes intI2 y dfrA1. En otra cepa, no fue posible determinar los genes insertos en esta región. Sólo once cepas (4,3 %) del biotipo 6 presentaron un integrón clase 1. En todas ellas se encontró el cassette genético aac(6’)Ib inserto en la zona variable, justificando la resistencia a amikacina, tobramicina y netilmicina. No se detectaron integrones clase 3 en las cepas de A. baumannii estudiadas. La resistencia a amikacina, netilmicina y tobramicina, fue mayor en cepas con integrón que en aquellas que no los poseen, pero frente al resto de los antibióticos no hubo grandes diferencias entre ambos grupos de cepas. Los patrones de resistencia fueron más amplios en las cepas con integrón, incluyendo a siete o más antibióticos. En las cepas con integrón clase 2 los patrones de resistencia a los antibióticos aminoglicósidos permitió deducir una gran variedad de EMAs, siendo ANT(3”)-Ia y AAC(3) las prevalentes, con frecuencias de 98,8 % y 87,5 %, respectivamente. En menor frecuencia (68,8 %) se dedujo las enzimas APH(3’) y AAC(6’)Ib. En las cepas sin integrón las enzimas más frecuentes fueron ANT(3”)-I ó APH(3”)-I, AAC(3) y APH(3’) (96,3 %, 57,5 % y 43,8 %, respectivamente). La EMA APH(3’)-V, no descrita con anterioridad en Acinetobacter spp., fue inferida en once cepas intI2+ y en dos cepas sin integrón. Además, la EMA ANT(4’)-II, igualmente no informada anteriormente en esta bacteria, se dedujo en dos cepas intI2+. Los resultados de este estudio demuestran que la elevada resistencia de cepas de A. baumannii, aisladas en hospitales de Chile, se fundamenta en la síntesis de una variada gama de EMAs, cuyos genes no siempre están codificados en cassettes genéticos de resistencia insertos en un integrón.
Participación de mastocitos y componentes de sistemas proteolíticos en el desarrollo de neoplasias cérvico-uterinas.
(Universidad de Concepción., 2002) Cabanillas Sáez, Ana Mercedes
Aunque la presencia de mastocitos en zonas peritumorales es una observación bastante antigua, el papel que desempeñan estas células durante la progresión de tumores aún no ha sido totalmente esclarecido. En el último tiempo se ha reportado que algunos mediadores producidos por mastocitos son capaces de promover la angiogénesis. Sin embargo, no existe información acerca del efecto que podrían ejercer estas células sobre otros eventos involucrados en la progresión tumoral, como la migración e invasión de células malignas. Los procesos de migración e invasión celular requieren de la expresión y funcionamiento de diversos componentes de sistemas proteolíticos. Numerosas evidencias indican que moléculas tales como el activador del plasminógeno tipo uroquinasa (uPA), su receptor de superficie celular (uPAR), el inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1 (PAI-1) y las metaloproteasas 2 (MMP-2) y 9 (MMP-9), se encuentran íntimamente asociadas con la adhesión, migración e invasión de células neoplásicas. Asimismo, se ha demostrado que la presencia de estos componentes en diversos cánceres humanos frecuentemente se relaciona con un mal pronóstico para el paciente. Considerando la alta incidencia de carcinomas invasores del cuello uterino en nuestro país, el objetivo de la presente investigación consistió en estudiar una posible relación entre los mastocitos presentes en tejidos cérvico-uterinos y el desarrollo de estas neoplasias. Los resultados obtenidos indican que los mastocitos son constituyentes normales del tejido cérvico-uterino, pero su número aumenta significativamente en lesiones clasificadas como carcinomas in situ (CIS) y carcinoma invasores. Los mastocitos presentes en tejidos normales y neoplasias intraepiteliales grados 1 y 2 (CIN 1 y 2) presentan aproximadamente la misma proporción de MCTC (mastocitos que contienen las proteasas triptasa y quimasa) y de MCT (mastocitos que sólo expresan triptasa). Sin embargo, en carcinomas invasores se produce un marcado predominio del fenotipo MCT por sobre el MCTC. Además, en carcinomas invasores, un considerable número de mastocitos del fenotipo MCT rodean e infiltran los tumores. En estos casos, los MCT que infiltran el tumor frecuentemente evidencian signos de degranulación y se encuentran asociados con la formación de los vasos sanguíneos que irrigan el tumor. La expresión de uPA y PAI-1 detectada en el estroma y el epitelio de CIS y carcinomas invasores es significativamente mayor a la observada en tejidos normales y CIN grados 1 y 2. En cambio, una elevada expresión de uPAR sólo se detecta en las células epiteliales transformadas de los carcinomas invasores. De esta manera, la expresión de uPA y PAI-1 en lesiones preinvasivas del cuello uterino podría ser considerada como un marcador con valor diagnóstico para identificar pacientes que presentan un riesgo aumentado de desarrollar una neoplasia cervical invasiva. La citoquina proinflamatoria TNF-, producida por mastocitos, regula la expresión uPAR, PAI-1 y MMP-9 en la línea celular de carcinoma invasor de cuello uterino humano SW756, lo que puede inducir un aumento en el potencial migratorio e invasivo de estas células. Los medios condicionados por mastocitos purificados desde cuello uterino humano producen un efecto similar al producido por TNF- en las células SW756. Puesto que los mastocitos secretan cantidades significativas de esta citoquina, los efectos observados pueder ser atribuidos, al menos en parte, a TNF-. Los resultados obtenidos en tejidos de cuello uterino humano y con las células SW756, sugieren que los mastocitos, a través de mediadores tales como la proteasa triptasa y TNF-, podrían favorecer la progresión del tumor al promover la neovasculación del tumor y la migración y la invasión de las células tumorales.
Cambios en las propiedades del receptor de glicina durante el desarrollo de neuronas espinales en cultivo. Efectos celulares de la activación.
(Universidad de Concepción., 2002) Tapia Amaro, Juan Carlos; Tapia Amaro, Juan Carlos
Evidencia experimental sugiere que el neurotransmisor inhibitorio glicina puede regular el crecimiento neurítico de neuronas embrionarias. Para evaluar esta hipótesis se propuso: 1) determinar cómo la activación del receptor de glicina en neuronas inmaduras afecta el crecimiento neurítico y el Ca+2 intracelular; 2) estudiar el patrón de expresión temporal de las subunidades del Rglicina en las neuronas y 3) estudiar la permeabilidad relativa del receptor de glicina a diferentes aniones durante el desarrollo in vitro de estas neuronas. A través de técnicas inmunocitoquímicas, electrofisiológicas y fluorimétricas encontramos que: las neuronas de 5 DIV expresaron fundamentalmente Rglicina y R-GABAA pero no receptores del tipo NMDA y no-NMDA. La activación de Rglicina y R-GABAA fue responsable de la actividad sináptica y de los incrementos de Ca+2i presentes en estas neuronas. Interesantemente, la neurotransmisión glicinérgica reguló la excitabilidad de la GABAérgica a través de un mecanismo de corto circuito neuronal (disminución de la Rm). La incubación crónica con glicina (100 μM, 48 hr) promovió el crecimiento neurítico de las neuronas, el que fue resistente a estricnina. Registros electrofisiológicos mostraron que la desactivación ó la inhibición del Rglicina son responsables del efecto trófico. Coaplicación de TTX, nimodipino y bicuculina inhibieron este efecto mientras que APV y CNQX no tuvieron efecto. Por lo tanto, postulamos que la actividad sináptica GABAérgica, regulada por la glicinérgica, es responsable del crecimiento neurítico en neuronas espinales de 5 DIV. Por otro lado, por medio de RT-PCR en neuronas espinales en cultivo encontramos que las subunidades del Rglicina presentaron un patrón de expresión temporal. La subunidad 2 fue expresada principalmente en neuronas de 5-7 DIV y no en neuronas >10 DIV. La mayor expresión de la subunidad 1 fue encontrada en neuronas de >10 DIV. La subunidad  presentó un patrón similar al de la subunidad 1, mayor en neuronas de 10-14 y 18-21 DIV que en las de 5-7 DIV. En resumen, postulamos que el Rglicina en neuronas de 5-7 DIV está formado por subunidades  mientras que en neuronas 10-14 por las subunidades . Mostramos también en esta tesis que: 1) el Eglicina varió de acuerdo a la actividad del Cl- extracelular en todas las etapas del desarrollo in vitro; 2) la permeabilidad de Rglicina a HCO3- relativa a Cl- fue de 0.10 en todas las etapas del desarrollo 3) y el rango de permeabilidades relativas SCN->NO3->I->Br->Cl->propionato->acetato->HCO3- no fue afectado por el desarrollo in vitro; 4) furosemida, inhibidor de KCC2, aumentó el Eglicina (~+20 mV) en neuronas 14 DIV y 5) el recambio del HEPES por HCO3- no afectó el Eglicina en neuronas inmaduras. De acuerdo con los resultados, postulamos que KCC2, y no cambios en la permeabilidad a HCO3-, sería responsable de la depolarización inducida por Rglicina en neuronas espinales embrionarias. En conclusión, postulamos que la neurotransmisión glicinérgica, la primera en ser expresada en neuronas espinales en cultivo, regula la excitabilidad y el crecimiento neurítico en neuronas de 5 DIV.
Inmovilización de archaeas metanogénicas sobre soportes inertes para favorecer la metanogénesis en ambientes sulfidogénicos.
(Universidad de Concepción., 2002) Vidal Alvarez, Roberto Mauricio; Urrutia Briones, Homero
En los procesos de digestión anaerobia dos comunidades, Archaeas y Bacterias, determinan el último paso en la digestión de nutrientes utilizables, las archaeas productoras de metano (APM) y las bacterias reductoras de sulfato (BRS). El grupo bacteriano más eficiente en la utilización de los sustratos presentes tendrá mayor influencia en el producto final del proceso anaeróbico de mineralización sea éste metano o sulfuros (HS-, S= ó H2S) (Visser et al., 1993a). El tratamiento de efluentes de la industria pesquera presenta dos grandes limitantes para el proceso metanogénico. La primera, está asociada a la elevada concentración de sulfato (1,2-2,1 g/l) de estos efluentes (Aspé et al., 1994), derivando el metabolismo celular hacia la formación de un ambiente sulfidogénico en el cual la actividad de archaeas metanogénicas se ve fuertemente disminuida (Visser et al., 1993b). La segunda es la competencia entre APM y BRS por hidrógeno y acetato, las últimas, con mayor afinidad metabólica por ambos sustratos (Lovley et al., 1982; Isa et al., 1986b; Lovley & Klug, 1983a; Harada et al., 1994). En este sentido, la utilización de soportes en reactores anaerobios de biomasa retenida, además de ser una modificación tecnológica destinada a reducir los tiempos de residencia hidráulicos y a proporcionar superficies para la inmovilización celular, evitando la pérdida de biomasa activa, privilegia indirectamente la mayor capacidad adherente descrita para archaeas metanogénicas. Esto, en estos nuevos biodigestores, se traduce en un lavado constante y selectivo de bacterias reductoras de sulfato (Isa et al.,1986a,b). Por lo anterior, resulta interesante caracterizar cinéticamente la formación de biopelículas por archaeas metanogénicas y bacterias reductoras de sulfato que utilizan sustratos comunes (hidrógeno y acetato), y determinar si la competencia entre APM y BRS en estos reactores es o no gobernada principalmente por las propiedades de adherencia y la cinética de crecimiento celular en biopelículas. Por otro lado, una ventaja natural que proporcionan los vertidos pesqueros para la metanogénesis, es su concentración de aminas metiladas. Se ha observado que estos compuestos pueden constituir sustratos exclusivos para archaeas metanogénicas que habitan sedimentos marinos y cuya conversión a metano no es afectada por la presencia o ausencia de iones sulfato (Oremland et al., 1982 a,b; Winfrey & Ward, 1983). De esta forma, el proceso metanogénico podría tener lugar en sedimentos marinos a partir del catabolismo de sustratos distintos a hidrógeno y acetato (Sowers & Ferry, 1983; Barret & Kwan, 1985; King, 1988). Por lo tanto, es importante analizar, dentro de la comunidad metanogénica, la capacidad adherente de grupos metilaminotróficos, que por la presencia de aminas metiladas en el efluente pesquero podría sustentar en gran medida la metanogénesis. Por último, existe la posibilidad de bioaumentar el inóculo de partida, es decir, suplementar externamente con archaeas metanógenas enriquecidas selectivamente, con el objeto de intensificar la actividad biológica residente, e incrementar así la tasa de metanogénesis con alteración mínima de las comunidades microbianas existentes, reduciendo el periodo de puesta en marcha de reactores de biomasa retenida. Con el desarrollo de esta investigación se pretende dar respuesta a las siguientes interrogantes: A. ¿ Favorece la incorporación de soportes, en reactores anaerobios que depuran efluentes pesqueros, la inmovilización de archaeas metanogénicas por sobre bacterias reductoras de sulfato? B. ¿ Existen soportes que favorecen la mayor retención celular? C. ¿ Afectan las variaciones de pH, salinidad y DQO del sustrato, la cinética de adherencia de grupos tróficos metanogénicos y reductores de sulfato inmovilizados sobre los soportes? D. ¿ Se puede reducir el tiempo requerido en la puesta en marcha de un reactor anaerobio de biomasa retenida al bioaumentar lodos anaerobios con comunidades bacterianas, incluídos metanógenos adherentes y resistentes a fluctuaciones fisico-químicas del vertido pesquero?.
The importance of glycine receptor clustering in the functional maturation of spinal synapses.
(Universidad de Concepción., 2002) Zundert, Brigitte van; Aguayo Hernández, Luis Gerardo
Considerando abundantes estudios bioquímicos e inmunocitoquímicos se ha generado un modelo que describe la estructura de la sinápsis glicinérgica en neuronas espinales. Así, se postula que el citoesqueleto, a través la proteína periférica geferina, ancla el receptor de glicina (R-Gli) a sitios específicos de la membrana post-sináptica. Al mismo tiempo que el R-Gli forma estas agrupaciones, la transmisión sináptica inhibitoria espontánea (mIPSC) aumenta. Además, varias de las propiedades fisiológicas de la corriente activada por glicina (Iglicina) son modificadas, incluyendo su sensibilidad a glicina y su regulación por proteína G. A través de la técnica ´whole-cell patch-clamp´ y mediante análisis de microscopía confocal, hemos estudiado sí el agrupamiento de los R-Gli en la membrana postsináptica por geferina y el citoesqueleto regula los cambios fisiológicos del receptor durante el desarrollo de la médula espinal. Uno de los principales resultados de este tesis es que los microtúbulos regulan la función y estructura de las agrupaciones sinápticas del R-Gli en una forma dependiente del estado del desarrollo. Así, se encontró que la aplicación aguda de colchicina disminuía significativamente la amplitud de mIPSC glicinérgicas (30%) en neuronas inmaduras (5-7 DIV), mientras que no tenía efectos sobre neuronas maduras (15-17 DIV). Análisis cinéticos y el bloqueo de mIPSC glicinérgicas con picrotoxina, reveló la presencia de la forma 2 neonatal (eventos lentos) y 1 adulta (eventos rápidos) del R-Gli. La depolimerización de microtúbulos afectó preferencialmente a receptores 2 sinápticos. Luego de la maduración sináptica se encontró que principalmente la forma adulta del R-Gli permanecía en la membrana postsináptica y que el tratamiento con colchicina no fue efectivo en este estado. En forma similar a lo observado para microtúbulos, encontramos que citocalasina-D producía alteraciones en las propiedades fisiológicas de la transmisión glicinérgica, que dependía del grado de maduración de las neuronas espinales, modificando los R-Gli postsinápticos sólo en células inmaduras. La aplicación intracélular de citocalasina-D y latrunculina-A en neuronas inmaduras, aumentó significativamente (190%) la frecuencia de las mIPSC glicinérgicas, sin variar la amplitud de los eventos. Aunque ambas drogas son membrana permeable, la aplicación extracélular de citocalasina-D y latrunculina-A resultó en una importante reducción de la transmisión sináptica total y glicinérgica. Estos resultados indican que los filamentos pre y postsinápticos están involucrados en el mantenimiento de la transmisión glicinérgica en neuronas espinales inmaduras Con el objetivo de bloquear la formación de agrupaciones de R-Gli sin alterar el citoesqueleto, cultivos de neuronas espinales fueron tratados con un oligonucleótido antisentido para geferina. Este tratamiento resultó en la pérdida de las agrupaciones de R-Gli sinápticas lo cual se correlacionó con una reducción casi completa en la transmisión glicinérgica. Sin embargo, el tratamiento tanto con el oligonucleótido antisentido, como con las drogas depolimerizantes del citoesqueleto (utilizados en forma aguda y crónica), fueron incapaces de alterar el ´´rundown´´ de las corrientes evocadas por glicina o la sensibilidad de la Iglicina a glicina, estricnina o picrotoxina. Al cuantificar el conjunto de los resultados obtenidos, nos permite estimar que gran parte (~65%) de la Iglicina se debe a la activación de los receptores extrasinápticos y por lo tanto concluimos que la farmacología y la estabilidad funcional de los R-Gli extrasinápticos no dependen de una interacción con geferina y el citoesqueleto. Finalmente, analizamos si existía un ´´cross-talk´´ entre el R-Gli y proteínas G en la membrana postsináptica. Fue así como encontramos que en células tratados con el oligonucleótido antisentido para geferina, la aplicación de GTP--S a través de la pipeta de patch no fue capaz de potenciar a Iglicina. Por otro lado, estudios de transmisión glicinérgica revelaron que GTP--S producía un aumento de dos veces en la constante de decaimiento de los eventos rápidos (1), pero no de los eventos lentos (2). En conjunto, estos resultados sugieren que existiría un cross-talk entre un receptor asociados a proteínas G (GPCR) y el R-Gli 1 postsináptico, interacción que se ve favorecida durante desarrollo. En conclusión, los resultados presentados en esta tesis indican que dependiendo del estado de maduración de las neuronas y de la expresión de las diferentes subunidades de R-Gli, la organización de los microtúbulos y microfilamentos regula la transmisión glicinérgica en neuronas de médula espinal. Además, nuestros estudios nos permiten postular que la interacción del R-Gli con geferina y el citoesqueleto no sólo facilita el anclaje de los receptores frente a los terminales presinápticos, sino que también posibilita la formación de microdominios con otras moléculas involucradas en la transducción de señales, incluyendo receptores metabotrópicos.
Distribución espacial de las variantes de histonas CS y su relación con los primeros ciclos replicativos de erizo de mar tetrapygus niger.
(Universidad de Concepción., 2002) Oliver Pavez, María Isabel; Imschenetzky, María
Post-fecundación el núcleo masculino sufre una descondensación de su cromatina. Esta reestructuración involucra un recambio de las proteínas histónicas que la conforman, produciéndose una pérdida de las histonas espermatozoide específicas (SpH) y su reemplazo por variantes de histonas CS de origen materno. En un estado intermedio de la remodelación del pronúcleo masculino de erizo de mar Tetrapygus niger se reportó la presencia de partículas nucleoproteicas híbridas, conformadas por sets incompletos de proteínas SpH y de variantes CS de origen materno. Sin embargo, no se conocía exactamente cómo se produce este recambio ni la composición de los nucleosomas de la cromatina espermática parcialmente remodelada. En consecuencia, el primer objetivo de esta Tesis Doctoral fue definir la naturaleza bioquímica de las nucleopartículas de composición mixta y poder postular un modelo de cómo ocurriría este recambio de proteínas histónicas. Con este propósito, nucleopartículas derivadas de la digestión de núcleos de cigotos en un estado intermedio de la remodelación, con nucleasa micrococal, fueron fraccionadas en un gradiente contínuo de sacarosa. Los nucleosomas de origen paterno fueron separados por inmunoadsorción con Sefarosa 4B unida a anticuerpos policlonales anti SpH y las proteínas contenidas en ellos analizadas por Western blot. Los resultados obtenidos demuestran que en un estado intermedio de la remodelación del pronúcleo masculino, los nucleosomas paternos están conformados por las SpH2A, SpH2B y dos fracciones mayoritarias de variantes CS, interactuando con un fragmento de ADN de aproximadamente 100 pb. Estos resultados permiten postular que la pérdida del tetrámero SpH H3-H4 ocurre simultáneamente con la adquisición de las variantes CS maternas, que vienen en su reemplazo para conformar el core nucleosomal de composición mixta. Además, se determinó que en este estado intermedio de la remodelación de la cromatina espermática, las variantes CS que conforman los nucleosomas híbridos se encuentran poliADPribosiladas y postulamos que la SpH2B se encontraría en su forma fosforilada. Una vez concluída la remodelación del pronúcleo masculino ocurre la fusión de ambos pronúcleos, fenómeno denominado amfimixis. Las SpH han desaparecido y la cromatina está conformada sólo por las variantes CS, en lo que a proteínas básicas se refiere. Esta estructuración persiste durante las tres primeras etapas de segmentación del embrión. Luego dos grupos de genes para histonas son secuencialmente expresados durante el desarrollo embrionario: las variantes de histonas tempranas hasta la eclosión de las larvas y, posteriormente, las variantes de histonas tardías. Las variantes CS persisten en la cromatina hasta estados tardíos del desarrollo, sin embargo, se desconoce su distribución espacial y temporal. Consecuentemente, el segundo objetivo planteado en esta Tesis Doctoral fue determinar la localización de las variantes CS en los distintos territorios embrionarios del erizo de mar y determinar si esta distribución se relaciona con el ADN con el cual fueron expresadas en los primeros ciclos replicativos. Con el fin de definir el destino de las variantes CS, se realizó la inmunodetección en larvas plutei observándose que estas variantes se localizan en territorios específicos de la larva. Paralelamente se marcó el ADN replicado in vivo durante la segunda fase S,concordante con la expresión de las variantes CS, con bromodeoxiuridina (BrdU). Este ADN fue posteriormente inmunolocalizado en territorios específicos de la larva plutei. Al confrontar esta localización con la obtenida para las variantes CS por doble marcaje y por microscopía confocal se constató que ambas señales colocalizan, es decir, que la segregación de las variantes CS a territorios definidos de la larva pluteus se realiza asociada al ADN replicado en su presencia. Consecuentemente, se postula que la segregación de las variantes CS a territorios específicos del embrión constituye una señal temprana de diferenciación. Por otra parte, estas variantes CS se encuentran poliADPribosiladas y se ha descrito que esta modificación post-traduccional es ciclo celular dependiente y su inhibición se correlaciona con el alargamiento de las fases de replicación del ADN. Por ello se planteó como tercer objetivo de esta Tesis Doctoral estudiar el efecto directo de la inhibición de la poliADPribosilación sobre la replicación durante los primeros ciclos replicativos. Los resultados demuestran que el efecto de la inhibición de la poliADPribosilación post-fecundación es un enlentecimiento real de las fases replicativas y no el bloqueo de la replicación. Adicionalmente, se estudió el efecto de esta inhibición en otra especie de erizo de mar Sphaerichinus granularis. Los resultados obtenidos indican que el efecto de la inhibición de la poliADPribosilación es un efecto directo sobre el proceso de replicación y que desacoplaría este proceso de los eventos de citoquinesis, sin alterar la distribución de tubulina.
Transportador de serotonina en el mastocito: estudio y caracterización de la inhibición de la captación de serotonina por oxitocina.
(Universidad de Concepción., 2002) Vega Artigues, Edgardo Gabriel; Vega Artigues, Edgardo Gabriel
La serotonina (5HT) es uno de los neurotransmisores más interesantes de estudiar, debido a su participación en diversos procesos fisiológicos y fisiopatológicos. Actualmente, existe un gran interés por comprender los fenómenos que regulan su biodisponibilidad en tejidos periféricos y en el sistema nervioso central. En este contexto, los distintos grupos de investigadores que han estudiado el transportador de serotonina (SERT) en distintos modelos celulares, han aportado valiosa información para comprender y evaluar la participación de esta proteína en la regulación de los efectos de la 5HT. Estudios previos realizados en nuestro laboratorio, demostraron que los mastocitos uterinos de ratón captan 5HT y que dicha actividad es inhibida por el neuropéptido oxitocina (OT). Estos resultados nos sirvieron de base para desarrollar la presente tesis, en la cual se caracterizó el efecto de OT sobre el SERT, usando al mastocito como modelo celular. A continuación, se hará una revisión bibliográfica de los aspectos más relevantes analizados en esta tesis.
SpH cistein-proteasa de cigoto de erizo de mar: caracterización molecular y selectividad proteolítica.
(Universidad de Concepción., 2002) Morín Muñoz, Violeta; Imschenetzky, María
En erizo de mar Tetrapygus niger se ha postulado que una cisteinproteasa cataliza la degradación del set completo de histonas espermatozoide –específicas (SpH) post-fecundación (SpH-proteasa). Esta enzima degrada en forma selectiva las histonas espermatozoide-específicas (SpH), dejando intactas las variantes de histonas presentes en óvulos (variantes CS). Esta proteasa se encuentra en forma inactiva en óvulos sin fecundar y es activada post-fecundación. Exhibe una actividad máxima a pH 8.0, lo que se correlaciona muy bien con el pH intracelular post-fecundación en este sistema. Su inhibición in vivo impide la degradación de SpH que ocurre normalmente asociada a la remodelación del pronúcleo masculino. En base a este conjunto de antecedentes se ha postulado que esta proteasa es responsable de la degradación de SpH, que ocurre durante la remodelación de cromatina espermática post-fecundación. La presente Tesis fue dividida en tres partes. En la primera parte, se describe la purificación a homogeneidad de SpH-proteasa desde cigoto cinco minutos post-fecundación. La enzima purificada fue secuenciada,obteniéndose la secuencia parcial de 15 residuos de aminoácidos a partir de su extremo N-terminal. A partir de la secuencia N-terminal obtenida fue sintetizado un péptido acoplado a hemocianina, que fue utilizado para generar un anticuerpo policlonal contra la SpH-proteasa. Este anticuerpo demostró ser específico para SpH-proteasa e inhibir su actividad catalítica, permitió además detectar esta enzima por inmunolocalización. Los experimentos de inmunolocalización demostraron que la SpH-proteasa presentaba una ubicación nuclear en óvulo sin fecundar y en cigoto. Durante la mitosis se localizaba en los centrómeros, retomando la ubicación intranuclear durante la fase S del segundo ciclo celular embrionario. En una segunda etapa de la presente Tesis se investigó el mecanismo que confería la selectividad de acción catálitica a esta SpH–proteasa, que degradaba in vitro a las SpH, dejando las variantes CS intactas. Para ello, se tomó como base, los resultados previos obtenidos en nuestro laboratorio, que demostraban que las variantes de histonas CS se encontraban extensamente poli(ADPribosiladas) in vitro, mientras que las histonas SpH no lo estaban. Para determinar si los polímeros de ADP-ribosa unidos a las variantes CS las protegían de la degradación, éstos fueron hidrolizados desde las variantes CS por tratamiento con fosfodiesterasa unida covalentemente a Sepharosa 4B. Luego, las variantes CS libres del polímero, fueron utilizadas como sustrato de la SpH-proteasa, observándose que éstas fueron degradadas. Se demostró adicionalmente que la SpH-proteasa no fue inhibida por polímeros de ADPribosa aislados. Consecuentemente, solo las variantes CS unidas covalentemente a polímeros de ADP-ribosa fueron protegidas de la acción degradativa de la proteasa. Paralelamente a estos resultados, se investigó si la presencia de fosforilaciones en las histonas espermatozoide-específicas (SpH),constituye un mecanismo de protección contra la acción degradativa de la SpH-proteasa. Para ello SpH1 y SpH2B fueron fosforiladas in vitro con caseina quinasa II. Los resultados indican que solo las formas fosforiladas de SpH1 y SpH2B permanecen intactas después de su incubación en presencia de SpH-proteasa. Consecuentemente se concluyó que la fosforilación protegía a las histonas SpH de proteólisis. Este resultado es consistente con la existencia de nucleosomas híbridos en etapas intermedias de remodelación de cromatina espermática, formados por variantes de histonas CS e histonas SpH2A y SpH2B que se encuentran fosforiladas. En la tercera parte de esta Tesis se describen los experimentos realizados con el fin de clonar el gen que codifica para esta SpH-proteasa. La estrategia para este objetivo fue diseñada sobre la base de la secuencia parcial de 15 residuos de aminoácidos de la SpH-proteasa en su extremo N terminal. Se construyeron oligonucleótidos degenerados que permitieron generar una sonda de 150 p.b., obtenida a partir de ADN genómico de erizo de mar Tetrapygus niger y otra sonda de 400 p.b., obtenida a partir de ADN proveniente de una genoteca de ADNc de óvulo no fecundado del erizo de mar Sphaerechinus granularis. El análisis en la base de datos indicó que ambas sondas presentaban homología con cistein-proteasa de otros orígenes. Paralelamente fue construida una genoteca de ADNc a partir de los ARN mensajeros de óvulo sin fecundar y cigotos en estado de blástula y pluteus de erizo de mar Tetrapygus niger. Del análisis primario y secundario de la genoteca de ADNc, utilizando las sondas de 150 p.b. y 400 p.b, se obtuvieron clones positivos. Actualmente, está en curso la etapa final de esta parte de la tesis.
Caracterización molecular y cinética de la agmatinasa de escherichia coli: mutagénesis sitio dirigida y modelaje molecular.
(Universidad de Concepción., 2003) Salas Grández, Mónica Roxana; Carvajal Baeza, Nelson
La agmatinasa (EC 3.5.3.11) cataliza la hidrólisis de la agmatina en putrescina y urea. La agmatina resulta de la hidrólisis de la arginina, catalizada por la arginina descarboxilasa, y es un precursor de la síntesis de poliaminas en bacterias y vegetales y, de acuerdo a recientes estudios, podría desempeñar un rol como neurotransmisor en el cerebro de la rata. Considerando las homologías entre las reacciones catalizadas por la agmatinasa y la arginasa, las relaciones estructurales entre sus sustratos, y la existencia de residuos conservados en sus secuencias aminoacídicas, se considera que estas enzimas pertenecen a una misma familia de proteínas (familia de las arginasas). Se piensa que los miembros de esta familia habrían divergido a partir de un origen evolutivo común, para alcanzar cada una de ellas su particular especificidad de sustrato. Hasta el momento, se dispone de una gran cantidad de información en relación con la arginasa de distintos organismos y tejidos. Más aún, se ha logrado resolver, mediante difracción de rayos x, la estructura de las arginasas de hígado de rata y de Bacillus caldovelox. En contraste, la información referente a la agmatinasa es mucho más reducida, y sólo en los ultimos años se ha logrado demostrar el requerimiento de iones metálicos y se ha iniciado la identificación de residuos de su sitio activo. Para un mejor conocimiento de los aspectos funcionales y estructurales de la agmatinasa, en este trabajo se realizaron estudios de modificación química y mutagénesis sitio dirigida y se desarrolló un modelo estructural basado en la homología de la agmatinasa de E. coli con la arginasa. Los resultados obtenidos sugieren la existencia de un centro bimetálico de Mn+2 en la agmatinasa de Escherichia coli; en este centro binuclear, uno de los Mn+2 sería esencial para la catálisis, mientras que el segundo cumpliría una función moduladora. Por otro lado, los estudios de modificación química y mutagénesis sitio dirigida, apoyan la participación de la His163 y del Asp153 en la función catalítica de la enzima. En los estudios de modelaje molecular por homología de secuencia, se tomó como estructura de referencia a la arginasa de B. Caldovelox. La estructura modelada fue muy similar a la de la estructura de referencia, con respecto al número y disposición de elementos estructurales (-hélices y hojas-). En general, las diferencias entre las arginasas de B. caldovelox y de hígado de rata, son prácticamente las mismas que existen con la agmatinasa y corresponden a las regiones de “loops” superficiales. La única excepción son dos “loops” localizados a la entrada del sitio activo y determinados por un esqueleto carbonado y algunas cadenas laterales bastante conservadas en las arginasas de B. caldovelox y de hígado de rata. Se centró la atención en una región que presenta las mayores diferencias con la arginasa y que comprende un “loop” que incluye los residuos C159, Y155 y F161. Dado que en la correspondiente región en la arginasa se localizarían los residuos que participarían en la unión de arginina y el proceso catalítico propiamente tal, nuestra atención se enfocó en esta región, como un intento inicial para entender las diferencias en especificidad entre estas enzimas. El análisis del modelo sugirió la posibilidad de que inserciones introducidas en la mutante triple, incorporando los aminoácidos que formen la correspondiente región en arginasa pudieran originar especies enzimáticas capaces de utilizar la arginina como sustrato. Aún cuando ninguno de los cambios introducidos en esta zona dieron los resultados esperados, este es un aspecto en el cual debiera de insistirse incluyendo la probabilidad de introducir especies quiméricas entre arginasa y agmatinasa.
Rol de factores inductores de transcripción basal en la reorganización nucleosomal de la región promotora proximal en el gen de osteocalcina.
(Universidad de Concepción., 2003) Gutiérrez Contreras, José Leonardo; Montecino Leonard, Martín Alejandro
El ADN dentro del núcleo eucariótico se encuentra a la forma de un complejo nucleoproteico denominado cromatina, siendo los nucleosomas la unidad fundamental de esta estructura. La cromatina funciona como moduladora del acceso al ADN de gran variedad de proteínas y complejos proteicos involucrados en distintos eventos nucleares, como lo es la transcripción. Eventos como éste requieren que la región promotora de un determinado gen adopte una organización nucleosomal definida, de tal forma que permita el acceso de distintos factores reguladores y de la maquinaria trascripcional basal. En los últimos años se ha descrito una gran variedad de complejos multiproteicos capaces de modificar la estructura cromatínica. Estos complejos han sido denominados como remodeladores o modificadores de cromatina. Gran variedad de estudios han determinado la participación de estos complejos en la remodelación nucleosomal de las regiones promotoras de distintos genes, posibilitando así su activación transcripcional. Los complejos remodeladores de cromatina se unen al ADN y nucleosomas de una manera secuencia-inespecífica. A este respecto, se ha observado que diversos factores de transcripción pueden interaccionar con los complejos remodeladores, lo que habre una vía para el reclutamiento de éstos hacia las regiones promotoras de genes. El gen de osteocalcina (OC) de rata codifica una proteína de 10 KDa, específica de tejido óseo. Se ha descrito que la expresión basal y tejido específica de este gen está regulada por elementos moduladores ubicados en su región promotora proximal, entre los que se encuentra una secuencia de unión para el factor de transcripción Runx/Cbfa. Diversos estudios han puesto de relieve el papel central que Runx/Cbfa juega en la expresión del gen de OC. La activación transcripcional de este gen concuerda con la aparición de un sitio hipersensible a DNasa I en su región promotora proximal (-170 a -70), lo que estaría reflejando un cambio en la organización nucleosomal asociado a su activación. Este hecho da lugar a la posibilidad de que complejos remodeladores de cromatina estén participando en la remodelación nucleosomal del promotor de este gen, durante su proceso de activación transcripcional. Tal evento de remodelación podría ser promovido además por factores inductores de la transcripción basal del gen de OC, como lo es Runx/Cbfa. Estos dos últimos aspectos no han sido evaluados con anterioridad al desarrollo de esta tesis. Obedeciendo a estos planteamientos, en esta tesis se propuso como objetivo general investigar el papel que poseen factores inductores de la transcripción basal de OC sobre la reorganización nucleosomal que sufre la región promotora proximal de este gen en su proceso de activación transcripcional. Conjuntamente con el desarrollo de este objetivo, se propuso establecer la presencia de complejos remodeladores ATP-dependientes en células óseas y analizar aspectos relacionados con la movilización de los nucleosomas sobre la cadena de ADN, en el contexto de la región promotora proximal del gen de OC. La reconstitución in vitro de distintos segmentos de ADN (correspondientes a la región promotora del gen de OC) como mononucleosomas, fue utilizada como metodología principal en este trabajo de tesis. El trabajo desarrollado en esta tesis permitió definir las características de la interacción de Runx/Cbfa con su secuencia de unión específica en el contexto nucleosomal. Además estableció la presencia de una región posicionadora de nucleosomas entre las regiones distal y proximal del promotor del gen de OC, la cual se encuentra efectivamente in vivo ocupada por un nucleosoma en el promotor activo. Este trabajo también estableció la presencia en células óseas de complejos con actividad remodeladora de nucleosomas ATP-dependiente. Los estudios de remodelación nucleosomal, en conjunto con el análisis de los patrones de reconstitución nucleosomal de distintos segmentos del promotor del gen de OC, permitieron definir la presencia de una región excluyente de nucleosomas, ubicada en la región promotora proximal de este gen. Se determinó que esta región excluyente influye en la posición traslacional adoptada por los nucleosomas en los segmentos del promotor que incluyen esta región, tras su reconstitución in vitro, y que también influye en sus patrones de remodelación nucleosomal. De gran importancia es que este último aspecto puso de relieve que la secuencia de ADN puede estar influyendo sobre la actividad remodeladora de nucleosomas. Los resultados obtenidos en esta tesis, en su conjunto, han permitido plantear un mecanismo que describe la secuencia de eventos que pueden estar formando parte de la reorganización nucleosomal acontecida en la región promotora proximal del gen de OC, durante su proceso de activación transcripcional.
Aspectos estructurales y cinéticos de la interacción de la arginasa humana tipo II con sustratos, iones metálicos e inhibidores.
(Universidad de Concepción., 2004) López Palma, Vasthi
Los mamíferos contienen dos isoenzimas de arginasas: una citosólica, localizada fundamentalmente en hígado (arginasa tipo I), y otra mitocondrial, característica de tejidos extrahepáticos (arginasa tipo II). Hasta ahora, la mayor parte de los estudios se han concentrado en la arginasa tipo I, a pesar de un interés creciente por la participación de la isoenzima II en la regulación de los niveles de arginina disponibles, especialmente, para la síntesis de óxido nítrico. Como una manera de contribuir al conocimiento de la isoenzima II, este trabajo de tesis doctoral tuvo los siguientes objetivos generales: (a) analizar las propiedades cinéticas de la isoforma II; (b) demostrar que, al igual que la isoforma I, especies de la arginasa human II que contienen 1 Mn2+/subunidad, son catalíticamente activas, aunque pueden ser hiperactivadas por unión de un segundo Mn2+, (c) definir, mediante mutagénesis sitiodirigida, la participación de los residuos conservados en la familia de las arginasa (His-120, His-145, His-160, Asp-147, Asn-149) en la interacción de la enzima con el sustrato y los iones metálicos activadores y su eventual participación en la catálisis. En nuestra opinión, los resultados obtenidos en este trabajo contribuyen en forma significativa al conocimiento de la enzima arginasa y, especialmente, de la isoforma humana II, en tres aspectos fundamentales: (a) Hemos demostrado que las especies mononucleares son catalíticamente activas y, en base a sus propiedades cinéticas, estamos en condiciones de sugerir que ellas constituyen la forma fisiológicamente relevante de la enzima; (b) Hemos demostrado que, pesar de las similitudes en términos de secuencia y estructura terciaria y cuaternaria, existen diferencias significativas en los sitios activos de las isoformas de arginasa humana, las que se reflejan en sus interacciones con el metal activador, el sustrato e inhibidores; (c) Mediante mutagénesis sitio-dirigida, hemos sido capaces, de alterar la especificidad de una especie de arginasa, convirtiendo a la enzima II en proteína con actividad agmatinasa, lo que no tiene precedente en la literatura. La actividad catalítica de una preparación purificada de arginasa tipo II fue prácticamente duplicada por incubación con Mn2+ 2 mM durante 20 minutos a 60 oC (hipertactivación). La enzima presentó una cinética hiperbólica al pH óptimo de 9,5, tanto en su estado hiperactivado, como semi-activado. Por el contrario, a pH 7,5, la hiperactivación se acompañó de un cambio desde una cinética cooperativ a una hiperbólica. Los efectos cooperativos para el sustrato desaparecieron en presencia de bajas concentraciones de agmatina, un análogo estructural del sustrato e inhibidor competitivo de la enzima, lo que sugiere la presencia de un sitio alostérico en la enzima tipo II. Al igual que la cooperatividad para el sustrato, la funcionalidad de este sitio, expresada como una activación por agmatina a bajas concentraciones de arginina, no se manifiesta en la enzima hiperactivada, y tampoco en la enzima tipo I. En base a estudios cinéticos de inhibición en presencia del producto ornitina y los análogos de la ornitina (putrescina) y urea (ion Gdn+), proponemos un mecanismo cinético que comprende la unión de la arginina como el primer sustrato, la liberación secuencial ordenada de ornitina y urea, y la formación de un complejo abortivo enzima-ornitina. Considerando las propiedades de las mutantes H120N y H145N, sugerimos que la actividad de la arginasa tipo II, depende estrictamente de un Mn2+ unido firmemente a la proteína coordinado por la His-120, aunque esta actividad puede ser estimulada por otro Mn2+ que se une en forma más lábil, coordinado por la His 145. Este último ion manganeso sería necesario sólo para llevar a la arginasa de un estado activo a uno de mayor actividad. Los estudios de mutagénesis sitio-dirigida también sugieren una función esencial para la asparagina-147, probablemente estabilizando al agente nucleofílico, mediante un puente hidrógeno. Sugieren, además, que la histidina-160 es crítica, pero no esencial, para la actividad catalítica de la arginasa tipo II, probablemente permitiendo una adecuada orientación del sustrato, y participando como una lanzadera de protones desde el solvente al grupo -amino de la ornitina, previo a la disociación del producto. Un resultado particularmente interesante lo constituyó la actividad agmatinásica de la mutante N149D, que no presentó actividad arginasa, lo que podría explicarse por una repulsión entre la carga negativa introducida y el grupo -carboxilo del sustrato. Por el contrario, al carecer de este grupo, la agmatina podría unirse y ser hidrolizada por la enzima. Este y otros residuos vecinos serían los determinantes de las diferencias de especificidad entre la arginasa y la agmatinasa.
Regulación transcripcional del transportador equilibrativo de nucleosidos en T1 por alta D-Glucosa en endotelio fetal humano.
(Universidad de Concepción., 2004) Aguayo Tapia, Claudio
Las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs) expuestas a altas concentraciones de D-glucosa (25 mM) muestran una inhibición del transporte de adenosina asociado con una disminución en el número de transportadores presentes en la membrana plasmática. Resultados similares fueron observados tanto en membrana plasmática como en vesículas de membranas aisladas de células endoteliales cultivadas en presencia de altas concentraciones de D-glucosa. Utilizando un anticuerpo para hENT1 fue posible determinar que las HUVECs expresan la proteína hENT1. Además fue posible establecer que células endoteliales expuestas a alta D-glucosa presentan una disminución en los niveles de la proteína hENT1 en la membrana celular. Por otro lado, este estudio ha establecido que los niveles de mRNA para hENT1 fueron significativamente menores en células endoteliales cultivadas en presencia de D-glucosa (25 mM) y de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA). Los efectos de D-glucosa y PMA fueron bloqueados por calfostina C y RO-320432 (inhibidores de PKC). De igual manera, hemos determinado que HUVECs expuestas a PMA y D-glucosa muestran una disminución en la vida media para el mRNA de hENT1. Nuestros resultados sugieren que el efecto de D-glucosa y PMA sobre la expresión de hENT1 estaría asociado con una disminución en la vida media del mRNA para hENT1, posiblemente a través de la activación de PKC. En esta tesis se presentan los primeros análisis del promotor de hENT1. Nuestros resultados muestran la funcionalidad del promotor y además indican que Dglucosa, PMA y óxido nítrico modulan la actividad del promotor de hENT1 en células humanas, induciendo un aumento en la actividad del promotor hENT1 en la línea celular ECV-304. En resumen, en esta tesis se presentan las primeras evidencias que muestran la expresión de la proteína hENT1 en células endoteliales humanas y su regulación por D-glucosa. De igual forma se muestran los primeros resultados experimentos que demostrarían la regulación post-transcripcional y transcripcional del promotor de hENT1 por D-glucosa, proteínas kinasa C y óxido nítrico en células endoteliales humanas.
Participación de complejos remodeladores de cromatina SWI/SNF en la activación transcripcional del gen de osteocalcina: mecanismo de reclutamiento de estos complejos a la región promotora.
(Universidad de Concepción., 2004) Villagra Macaya, Alejandro Verlaine
Osteocalcina (OC) es una proteína óseo-específica que se expresa en etapas tardías de diferenciación, durante la mineralización de la matriz extracelular. La expresión de este gen es considerada como uno de los principales marcadores de diferenciación osteoblástica y su regulación transcripcional involucra múltiples pasos, como la presencia de reguladores transcripcionales específicos y una reorganización de la arquitectura cromatínica en su región promotora. En células que no expresan el gen OC, la región promotora se encuentra inaccesible a la maquinaria transcripcional, formando parte de una estructura cromatínica altamente compactada. Por otro lado, en células que expresan activamente el gen OC, la región promotora es más accesible, lo cual se refleja por la presencia de dos regiones hipersensibles a la digestión con DNasa I (DHS). Estos DHS abarcan todos los elementos regulatorios claves que controlan la actividad transcripcional basal tejido-específica y la estimulada por vitamina D3. La región entre estos dos sitios hipersensibles a la digestión con DNasa I se encuentra organizada como un nucleosoma altamente posicionado, el cual soporta una estructura tridimensional donde los factores regulatorios de la transcripción se unen tanto a la región promotora proximal como distal, creando interacciones entre ambas regiones. Los mecanismos involucrados en la generación de esta estructura remodelada no han sido definidos, por lo que su estudio resulta de gran importancia para la comprender en forma global el mecanismo que gobierna la regulación transcripcional de este gen. Entre los complejos celulares que poseen actividad remodeladora de cromatina se encuentran los complejos remodeladores de cromatina dependientes de ATP. En mamíferos se han encontrado diferentes complejos con esta actividad, uno de ellos corresponde a los complejos SWI/SNF. Estos complejos multiproteicos contienen una subunidad catalítica que posee actividad ATPásica, la cual puede ser BRG-1 o BRM. Mutaciones en el dominio ATPásico de BRG-1 o BRM elimina su capacidad de unir ATP, resultando en la formación de complejos SWI/SNF inactivos. Para comprender los mecanismos involucrados en el remodelamiento cromatínico asociado a la actividad transcripcional del gen OC, hemos transfectado en forma estable células osteoblásticas con construcciones codificantes para versiones mutadas de BRG-1 y BRM marcadas con un epítope FLAG y bajo el control de un promotor inducible. Encontramos que la sobre-expresión de estas proteínas mutantes en su actividad ATPásica resultan en la formación de complejos SWI/SNF inactivos que se unen al promotor OC. Esta interacción se correlaciona con una significativa inhibición de la transcripción de OC endógena, tanto a nivel basal como de estimulación por vitamina D3, además de una disminución en la hipersensibilidad a nucleasas de su región promotora. La inhibición transcripcional de OC fue hallada en osteoblastos diferenciados, como lo es la línea celular ROS 17/2.8. Mas aún, encontramos la misma acción de BRG1 y BRM mutantes en células C2C12 comprometidas al fenotipo osteoblástico. Tomando nuestros resultados en conjunto, se puede concluir que complejos SWI/SNF tienen una importante función en la remodelación y concomitante activación transcripcional del gen OC en osteoblastos.
Metabolismo de vitamina C en células endoteliales humanas en cultivo: mecanismos de adquisición, relación con el glutation celular y papel protector frente a estres oxidativo agudo.
(Universidad de Concepción., 2004) Montecinos Acuña, Viviana Paz
El endotelio humano representa un órgano que está constantemente expuesto a oxidantes, tanto intracelulares como exógenos, y bajo condiciones normales está protegido por la acción concertada de una serie de moléculas antioxidantes, entre las cuales destacan antioxidantes solubles como el ácido ascórbico y el glutatión. Todas las células humanas tienen la capacidad de sintetizar el glutatión, pero no la vitamina C, la que debe ser adquirida desde la dieta y absorvida a nivel del epitelio intestinal. Hasta el momento se han descrito dos sistemas que median el transporte de vitamina C en células de mamiferos. La forma oxidada de esta vitamina (ácido deshidroascórbico) ingresa a la célula por los transportadors facilitativos de hexosas (GLUTs), a favor del gradiente de sustrato, en tanto que la forma reducida (ácido ascórbico), es transportado por cotransportadores de sodio-ascorbato (SVCTs), a favor del gradiente electroquímico del sodio. La vitamina C se encuentra en el interior de las células solamente como ácido ascórbico, y el glutatión juega un importante papel tanto en la acumulación como en el reciclaje y la mantención de niveles constantes de vitamina C reducida intracelular. Estudios in vivo indican que existiría una relación funcional entre estas dos moléculas antioxidantes en la protección contra el estrés oxidativo, ya que el daño oxidativo producido por una deficiencia de glutatión es prevenido por la administración de vitamina C, mientras que los efectos deletéreos de la deficiencia de vitamina C son retardados por la administración de ésteres de glutatión. Utilizando como modelo de estudio cultivos primarios de células endoteliales humanas obtenidas de vena umbilical (HUVEC) y de amígdalas humanas (HTEC), y la línea celular endotelial inmortalizada ECV-304, identificamos y caracterizamos funcionalmente los transportadores de vitamina C reducida y oxidada expresados en estas células. Determinamos además la participación del glutatión en el transporte y acumulación de la vitamina C y el papel de ambos antioxidantes en la capacidad de las células endoteliales para sobrevivir a estrés oxidativo agudo inducido por tratamiento con peróxido de hidrógeno. Nuestros resultados, de experimentos de PCR, inmunolocalización y transporte, muestran que las células endoteliales presentan un único sistema de transporte para el ácido ascórbico, con las propiedades esperadas para la isoforma SVCT2. En forma similar el transporte de ácido deshidroascórbico en la línea celular ECV-304 es mediado por un único sistema de transporte, que corresponde al transportador de glucosa GLUT1. Por otro lado, las células HTEC y HUVEC transportan el ácido deshidroascórbico por medio de dos transportadores expresados simultáneamente en cada célula, los que transportan el sustrato con diferentes afinidades. El componente de mayor afinidad correspondería a GLUT1, mientras que las propiedades del componente de menor afinidad permiten identificarlo tentativamente como GLUT6. Aunque los tres tipos celulares estudiados mostraron un contenido de glutatión similar (2 a 4 mM), células carentes de glutatión por de tratamiento con L-butionil (SR) sulfoximina y dietilmaleato mostraron una dependencia diferencial del contenido de glutatión para sobrevivir y proliferar. Del mismo modo, la ausencia de glutatión intracelular afectó la acumulación de vitamina C en las células ECV-304 y en las HUVEC pero no en las células HTEC. El tratamiento agudo de las células endoteliales con peróxido de hidrógeno causó una masiva caída del contenido de glutatión intracelular que estuvo relacionada con la sobrevivencia de las células. La carencia de glutatión intracelular aumentó la sensibilidad de las células endoteliales al peróxido de hidrógeno,efecto que fue revertido en forma dosis dependiente del contenido intracelular de glutatión. Del mismo modo, la suplementación con vitamina C intracelular aumentó la resistencia de las células endoteliales en una forma en forma dosis dependiente del contenido de vitamina C. Estos experimentos también mostraron que la vitamina C y el glutatión son claramente diferenciablesrespecto de su capacidad para proteger a las células del estrés oxidativo inducido por peróxido de hidrógeno. Así, bajas concentraciones de vitamina C, en el rango de 0,2-0,3 mM, protegieron eficientemente las células endoteliales del estrés oxidativo, mientras que se necesitaron concentraciones de glutatión cercanas a 2 mM para observar un efecto protector semejante. Ademas de lo anterior, la presencia simultánea de vitamina C y glutatión torna a las células muy resistentes al estrés oxidativo producido por exposición directa a peróxido de hidrógeno y a oxidantes generados por células neutrofilicas activadas. Concluimos que la vitamina C y el glutatión actuan en forma complementaria en la defensa celular contra el estrés oxidativo.

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