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Acciones de alcaloides de Gelsemium en receptores inhibitorios y en la función sináptica.
(Universidad de Concepción, 2023) Marileo Córdova, Ana María; Yévenes Crisóstomo, Gonzalo
Los receptores ionotrópicos de GABA del tipo A (GABAARs) y de glicina (GlyRs) son fundamentales para la inhibición sináptica en el sistema nervioso central (SNC). En la sinapsis, los neurotransmisores GABA y glicina activan GlyRs y GABAARs postsinápticos, permitiendo el influjo de iones cloruro y la hiperpolarización del potencial de membrana, controlando así la excitabilidad neuronal. Alteraciones en la neurotransmisión GABAérgica o glicinérgica se han asociado con trastornos prevalentes del SNC tales como epilepsia, depresión, ansiedad, dolor crónico, entre otros. La relevancia de la función GABAérgica ha sido resaltada por la buena eficacia de varios fármacos de uso clínico que poseen como blanco principal a los GABAARs. Por el contrario, actualmente no hay fármacos que tengan como blanco especifico a los GlyRs. Con relación a la farmacología de estos receptores, es importante mencionar que se han identificado diversos moduladores de GlyRs y GABAARs a partir de plantas y hongos. En este contexto, los alcaloides de las plantas de Gelsemium han demostrado efectos beneficiosos en diversas patologías del SNC. Sin embargo, estos compuestos han mostrado una alta toxicidad intrínseca, con un perfil toxicológico que sugiere posibles efectos a nivel neuronal. Los blancos moleculares de estos alcaloides en el SNC aún no están definidos. No obstante, existen estudios que han sugerido la posible participación de GlyRs y GABAARs en sus acciones. Este trabajo de tesis logró definir y caracterizar la actividad de los cuatro principales alcaloides del Gelsemium (gelsemina, gelsevirina, koumina y humantenmina) en GABAARs y GlyRs, y en la función sináptica de neuronas corticales. Utilizando registros electrofisiológicos de GABAARs y GlyRs recombinantes, se demostró que gelsemina, koumina y gelsevirina inhibieron las corrientes glicinérgicas y GABAérgicas a concentraciones micromolares. El análisis de las concentraciones inhibitorias medias (IC50) y del porcentaje de máxima inhibición mostró que los GlyRs poseen una sensibilidad mayor a estos alcaloides que los GABAARs. Contrariamente, humantenmina no modificó significativamente la actividad de GABAARs y GlyRs. Utilizando receptores quiméricos y mutados en combinación con técnicas bioinformáticas, se logró determinar que dos mutaciones puntuales en el sitio ortostérico fueron suficientes para generar GlyRs insensibles a gelsemina, koumina y gelsevirina, lo que sugiere que las acciones de estos alcaloides dependen únicamente de su unión al sitio ortostérico. Por otra parte, en el contexto de la sinapsis, se logró establecer que gelsemina disminuyó la frecuencia de los eventos sinápticos GABAérgicos y glutamatérgicos en miniatura de neuronas corticales, sin modificar significativamente la amplitud. De modo interesante, se obtuvieron resultados similares utilizando el alcaloide humantenmina, demostrando que la inhibición directa de GlyRs o GABAARs no es necesaria para los efectos sinápticos. Finalmente, estudios de fluorometría de Ca2+ intracelular lograron demostrar que gelsemina disminuyó la frecuencia de las señales espontaneas de Ca2+, sugiriendo que gelsemina, y posiblemente otros alcaloides del Gelsemium, modulan la sinapsis a través de la interacción con blancos moleculares presinápticos. En conjunto, los resultados de esta tesis proporcionan información novedosa sobre las acciones funcionales y los sitios moleculares de los principales alcaloides del Gelsemium en GABAARs y GlyRs. El perfil de actividad de gelsemina, koumina y gelsevirina en estos canales iónicos sugiere que estas interacciones pudieran estar asociadas a su toxicidad. Por el contrario, los resultados encontrados para humantemina y gelsemina a nivel neuronal sugieren que su actividad biológica estaría relacionada con blancos moleculares presinápticos, diferentes a GABAARs y GlyRs. Estas acciones sinápticas proporcionan una hipótesis novedosa para explicar los diversos efectos beneficiosos de los alcaloides del Gelsemium. En resumen, los resultados de este trabajo contribuyen a dilucidar, al menos en parte, los mecanismos involucrados en las acciones beneficiosas y tóxicas de los alcaloides del Gelsemium a nivel del SNC de mamíferos.
Actividad anticancerígena y antioxidante in vitro de polisacáridos ácidos obtenidos desde hongos pertenecientes a la familia Hymenochaetaceae asociados a bosque nativo de Chile.
(Universidad de Concepción., 2022) Albornoz Muñoz, Verónica Agustina; Campos Araneda, Víctor Leandro; Becerra A., José
El cáncer es una de las principales causas de muerte a nivel mundial. Su padecimiento puede estar vinculado con factores hereditarios, o verse favorecido por malos hábitos como el consumo excesivo de alcohol, de tabaco, o la exposición prolongada a componentes químicos, entre otros factores. Estas condiciones aumentan la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), desencadenando stress oxidativo, el cual produce daños en el material genético que pueden inducir el desarrollo de cáncer. Los tratamientos convencionales aplicados para esta enfermedad, como la quimioterapia, presentan un alto costo monetario y un gran deterioro al estilo de vida de los pacientes; por lo que la búsqueda de nuevos tratamientos o compuestos, naturales o sintéticos, que puedan emplearse satisfactoriamente en el control del cáncer han despertado un gran interés en los científicos. Los polisacáridos de origen fúngico han demostrado presentar una amplia gama de actividades biológicas, tales como actividad antibacteriana, hipoglucémica, inmunomoduladora, antioxidante y anticancerígena. El nivel de actividad anticancerígena que presentan los polisacáridos fúngicos está relacionado con sus características físicoquímicas, incluyendo su composición monomérica y los grupos funcionales asociados a la cadena principal de glucanos. En este trabajo se evaluará la capacidad antioxidante y citotóxica contra líneas celulares tumorales, de los polisacáridos ácidos de cuatro cepas fúngicas, pertenecientes a la familia Hymenochaetaceae presente en bosques nativos del sur de Chile. Los polisacáridos ácidos serán obtenidos desde las cepas FQ1645 (Nothophellinus andinopatagonicus), FQ1626 y FQ1640 (Phylloporia boldo), y FQ1648 (posible Fomitiporia sp.), por medio de una precipitación selectiva con Cetavlon. Los polisacáridos obtenidos (NAAPs, PBAP26 y PBAP40, y APFQ48, respectivamente) fueron caracterizados por análisis infrarrojo con transformada de Fourier (FT-IR). La actividad anticancerígena in vitro fue determinada por análisis de citotoxicidad con MTT y citometría de flujo. Además, la capacidad antioxidante de los polisacáridos fue 15 evaluada usando los radicales libres sintéticos DPPH y ABTS. El análisis de FT IR permitió identificar la presencia de enlaces α y β-glicosídicos tanto en PBAP40 como en APFQ48; mientras que los picos correspondientes a grupos sulfatos fueron evidenciados en NAAPs y APFQ48. Los ensayos de citotoxicidad contra líneas celulares tumorales mostraron que tres de los polisacáridos estudiados (NAAPs, PBAP40 y APFQ48) presentan un mayor efecto contra la línea celular HL-60, con valores de IC50 de 767.16 µg mL-1 , 127.85 µg mL-1 y 800 µg mL-1 , respectivamente. Por su parte, el polisacárido PBAP26 presenta una mayor actividad citotóxica contra la línea celular tumoral HCT-116, con un valor de IC50 de 535.83 µg mL-1 . La evaluación del efecto citotóxico de los polisacáridos contra una línea celular no tumoral permitió evidenciar que todos los polisacáridos ácidos analizados presentan un efecto proliferante en la línea celular HGF-1, obteniéndose valores de supervivencia mayores al 100% con las mayores concentraciones de polisacáridos usadas. En cuanto al efecto de los polisacáridos sobre el ciclo celular de la línea celular HL-60, se pudo observar que todos los polisacáridos producen un aumento de eventos en la fase Sub G1, suponiendo un efecto de arresto de células en esta fase del ciclo celular. Los ensayos de actividad antioxidante evidenciaron que los polisacáridos ácidos de las cuatro cepas en estudio presentan una mayor capacidad reductora del radical DPPH en comparación con el radical ABTS; y que los polisacáridos PBAP40 y APFQ48 presentan la mayor actividad antioxidante con valores de 24.53% y 27.31% de actividad antioxidante, respectivamente. Los polisacáridos analizados presentan una significativa actividad anticancerígena in vitro contra las líneas celulares empleadas, HCT-116, MCF-7 y HL-60, especialmente contra esta última. La bioactividad presentada por NAAPs, PBAP26, PBAP40 y APFQ48 podría estar dada por la presencia de grupos funcionales como grupos sulfatos, así como la existencia de β-glucanos.
Adaptaciones moleculares del metabolismo de vitamina C en cáncer de próstata.
(Universidad de Concepción., 2012) Sotomayor Mansfield, Kirsty Jane; Rivas Rocco, Coralia
El siguiente estudio está enfocado en dilucidar los mecanismos de transporte,acumulación y reciclaje de vitamina C en cáncer de próstata, y establecer una relación entre las variaciones en éstos procesos y el progreso tumoral. Para ello, se utilizaron diversas líneas celulares que fueron obtenidos de próstata normal, y diferentes etapas de metástasis de cáncer de próstata. Adicionalmente, se complementó el estudio con análisis histológicos. Los resultados de los experimentos de transporte revelaron que las células de origen prostáticas transportan ambos estados redox de la vitamina C, con excepción de la línea LNCaP que solo transporta ácido deshidroascórbico. El análisis de las constantes cinéticas para el transporte de ácido ascórbico y ensayos de RT-PCR utilizando partidores específicos permitieron establecer que el transporte de ácido ascórbico en las líneas RWPE-1 y PC-3 es mediado por SVCT1 y SVCT2, en tanto que en las células DU-145 el transporte de ácido ascórbico es mediado principalmente por SVCT1. A excepción de la línea LNCaP, la capacidad para transportar ácido ascórbico es mayor en células tumorales y correlaciona con el grado del tumor primario de la cual se derivó cada línea. Adicionalmente, ensayos de inmunocitoquímica en las líneas celulares mostraron una localización principalmente intracelular para SVCT2. Este resultado fue confirmado por ensayos de inmunocitoquímica doble con el marcador COX IV donde se estableció una localización mitocondrial para SVCT2. El análisis de las constantes cinéticas para el transporte de ácido deshidroascórbico y desoxiglucosa, además de ensayos por RT-PCR, permitieron establecer que el transporte de ácido deshidroascórbico es mediado por mas de un transportador, entre las cuales se encuentra GLUT1. La capacidad para transportar ácido deshidroascórbico y desoxiglucosa es menor en células tumorales que en células RWPE-1. Los ensayos de acumulación revelaron que las células benignas y tumorales de próstata acumulan elevadas concentraciones intracelulares de vitamina C. La acumulación de ácido ascórbico es llevada a cabo en las líneas celulares mediante enzimas dependientes de glutatión y enzimas dependientes de NADPH, con excepción de las células LNCaP que acumulan de manera independiente de glutatión. Los ensayos de RT-PCR y de western blot sugieren que la acumulación de ácido ascórbico es mediado por un gran número de reductasas, no obstante el análisis de las constantes cinéticas sugieren la participación principalmente de Grx1 y TrxR1. Ensayos de acumulación y reciclaje en células HEK-293 sobreexpresadas con DHA reductasas dependientes de glutatión y dependientes de NADPH revelaron un efecto positivo de los niveles de reductasas sobre la velocidad de reducción intracelular de DHA, especialmente de TrxR1. Por otra parte, análisis inmunohistoquímicos en tumores de próstata permitieron establecer la expresión de SVCT1 y SVCT2, y observar una correlación entre la expresión de SVCT2 y el grado Gleason. Mas aún, ensayos de doble inmunocitoquímica con anticuerpos para COX IV y SVCT2 permitieron establecer la localización mitocondrial de SVCT2 en estos tejidos tumorales. Análisis inmunohistoquímicos realizados para determinar la presencia de GLUT1 revelaron una expresión moderada en tejidos benignos y una expresión de moderada a alta en un 10 % de las muestras, la mayoría de grados VIII Gleason 4 y 5. Finalmente el análisis de la expresión de TrxR1 reveló una baja expresión de TrxR1 en tejido benigno y una alta expresión en un 20% de los tejidos tumorales. Concluimos que las variaciones en el transporte, acumulación y reciclaje de la vitamina C asociados al progreso tumoral reflejan la adaptación de la célula tumoral para protegerse de los efectos del proceso fisiopatológico del cual forman parte y que se caracteriza por un alto nivel de estrés oxidativo.
Análisis de estructura-función del co-transportador de Na/ácido ascórbico SVCT2: mecanismo de transporte y aspectos regulatorios.
(Universidad de Concepción., 2004) Godoy Sánchez, Alejandro Samuel; Vera Cárcamo, Juan Carlos
Hasta el momento se han identificado dos sistemas que median el transporte de vitamina C en células de mamíferos. La forma oxidada de esta vitamina (ácido deshidroascórbico) ingresa a la célula por los transportadores facilitativos de hexosas (GLUTs), en tanto que la forma reducida (ácido ascórbico) lo hace a través de una familia de proteínas denominadas SVCTs, de los cuales se han descrito dos miembros hasta el momento, SVCT1 y SVCT2. Estos últimos transportadores se caracterizan por ser activados por sodio, electrogénicos y altamente selectivos para L-ascorbato. Estudios preliminares de caracterización funcional de SVCT1 y SVCT2, clonados y expresados en ovocitos de X. laevis, han producido resultados contradictorios respecto de los parámetros cinéticos asociados al transporte de ácido ascórbico. Por otro lado, no se han caracterizado las propiedades funcionales de los SVCTs expresados endógenamente y en forma aislada, debido a que la mayoría de las células parecen expresar ambas isoformas simultáneamente. En esta tesis, caracterizamos la expresión de SVCTs en un modelo de células de melanoma humano (SK-MEL), y desarrollamos un completo análisis cinético y de estructura-función del transportador de Na+/ácido ascórbico SVCT2 expresado en estas células. Los estudios de inmunodetección, RT-PCR y secuenciación permitieron confirmar la presencia de la isoforma SVCT2 en este modelo celular, y ausencia de expresión de SVCT1. Los estudios cinéticos demostraron la existencia de un sistema de transporte de ácido ascórbico que presentó una Km de 17±3 μM. La dependencia de la dosis para la activación por sodio demostró una relación sigmoidal entre la velocidad de XI captación de ascorbato y la concentración de sodio, con un coeficiente de Hill de 1,9 y un Na50 de 35 mM. Estos resultados fueron compatibles con una estequiometría de transporte Na+:ácido ascórbico de 2:1, estimada a partir de ensayos de transporte en paralelo de 22Na+ y [1-14C] ácido ascórbico. La Km de transporte para ácido ascórbico fue afectada por la concentración de sodio en el medio extracelular, observándose una disminución de más de 100 veces el valor de la Km cuando el sodio aumentó de 5 a 135 mM, sin afectar la Vmax de transporte. A la inversa, el ácido ascórbico modificó la cooperatividad para el sodio con un comportamiento de tipo bimodal, observándose un aumento progresivo en el grado de cooperatividad a concentraciones crecientes de ácido ascórbico entre 5 y 100 μM, y posteriormente, una pérdida abrupta de la cooperatividad a concentraciones de ácido ascórbico igual o superiores a 200 μM. Este efecto recíproco de ambos sustratos sugiere una secuencia de unión al transportador del tipo sodio:ácido ascórbico:sodio. La función de SVCT2 requiere la presencia de cationes bivalentes (Ca2+ y Mg2+) en el medio extracelular. El mecanismo de acción de estos cationes involucra la estabilización de una conformación activa del transportador, que muestra un aumento en la velocidad máxima de transporte, sin afectar la Km asociada al transporte de ácido ascórbico, ni el efecto del activador sodio (nH y Na50). Estos resultados permiten concluir que SVCT2 es un transportador de alta afinidad, es activado por sodio en forma cooperativa, requiere Ca2+ o Mg2+ para su función, transporta Na+ y ácido ascórbico con una estequiometría 2:1 (Na+:ácido ascórbico), y el ciclo de transporte se caracteriza por un orden de unión de los sustratos del tipo Na+:ácido ascórbico:Na+. Variaciones en el pH extracelular afectaron la función de SVCT2 tanto a pH ácido como a pH básico, observándose una caída en la velocidad de transporte y una pérdida de XII la cooperatividad para el sodio (nH), sin afectar la Km de transporte. Dietilpirocarbonato, un reactivo que a pH 6 muestra especificidad por residuos de histidina, afecta la funciónen la velocidad de transporte, sin afectar la Km de transporte, y sin que se observe un efecto protector del sustrato. Por otro lado, el análisis de la cinética de inhibición en función de la concentración de dietilpirocarbonato sugiere que al menos dos residuos de histidina pudieran estar participando en la pérdida de la cooperatividad por el sodio y la caída en la actividad del transportador como producto de la modificación. En conjunto con la información previa de la caracterización de las propiedades funcionales de SVCT2, los resultados de modificación química con dietilpirocarbonato sugieren que ambas funciones, cooperatividad y actividad, serían propiedades determinadas por motivos estructurales que son diferenciables desde el punto de vista de su accesibilidad a modificadores químicos. de SVCT2 en forma similar al efecto del pH, con pérdida de cooperatividad y una caída en la actividad del transportador como producto de la modificación. En conjunto con la información previa de la caracterización de las propiedades funcionales de SVCT2, los resultados de modificación química con dietilpirocarbonato sugieren que ambas funciones, cooperatividad y actividad, serían propiedades determinadas por motivos estructurales que son diferenciables desde el punto de vista de su accesibilidad a modificadores químicos.
Análisis de la dinámica transcripcional asociada al desarrollo y regeneración del hueso craneal de Xenopus tropicalis.
(Universidad de Concepción, 2024) Castillo Córdova, Héctor Benjamín; Marcellini Liotaud, Sylvain
Hasta la fecha, se desconoce si el programa de regulación génica involucrado en el desarrollo del hueso craneal de los anfibios se reactiva durante la regeneración ósea. Tras una lesión craneal, los renacuajos de Xenopus tropicalis reparan el daño formando un tejido mesenquimatoso no mineralizado a los 5 días post-lesión (5dpl), y posteriormente lo cubren con una capa delgada de hueso (15dpl). Para explorar la relación entre los mecanismos transcripcionales de la osificación craneal durante el desarrollo y la regeneración, realizamos experimentos duplicados de RNA-Seq y ATAC-Seq utilizando tres tipos de muestras: i) región regenerativa temprana (5dpl) y tardía (15dpl), ii) precursores osteogénicos no diferenciados (del mesénquima de larvas NF50) y osteoblastos diferenciados (de cráneos de larvas NF58), y iii) hígado, corazón y pulmón como controles no mineralizados. Determinamos que los osteoblastos en desarrollo poseen una lógica regulatoria bien conservada con los mamíferos, identificando 35 enhancers conservados que, en humano, contienen SNPs, asociados a fenotipos esqueléticos. Los análisis PCA del perfil transcriptómico y del paisaje de cromatina abierta revelan que la regeneración temprana es más similar a los osteoblastos que al mesénquima. Diseñamos un método novedoso para integrar datos de ATAC-seq y RNA-seq, definiendo siete clústeres que permitieron identificar genes sobreexpresados y sus regiones regulatorias específicas. Basados en ontología génica y enriquecimiento de TFBS, determinamos que la red transcripcional de la regeneración temprana está relacionada con la remodelación de la matriz (mmp13), el sistema inmune (spi1) y los precursores osteogénicos (sox2). Sin embargo, carece de los marcadores de patrón embrionario presentes en el mesénquima (nog). En los osteoblastos recién diferenciados de la regeneración tardía, dlx5 cumple un rol clave en la regulación, mientras que el programa genético de los osteoblastos maduros del desarrollo requiere del heterodímero Jun/Fos. En resumen, identificamos un conjunto de enhancers putativos y sus genes diana que se activan en pasos precisos durante el desarrollo y la regeneración del hueso craneal. Nuestros resultados sugieren que los osteoblastos se desdiferencian en un estado celular intermedio mediante la reactivación de genes de pluripotencia como sox2. Este estudio proporciona datos relevantes para entender los mecanismos moleculares que permiten al hueso de los anfibios formarse y regenerarse eficientemente tras un daño crítico.
Análisis de la estructura cuaternaria del transportador de ácido ascórbico SVCT2
(Universidad de Concepción., 2016) Gatica Miranda, Marcell Alejandra; Rivas Rocco, Coralia
La forma reducida de la vitamina C, el ácido ascórbico (AA), es transportado al interior de las células por la familia de cotransportadores de sodio-ascorbato SVCT, con 2 formas funcionalmente activas, SVCT1 y SVCT2. Se ha propuesto un modelo funcional para el ciclo de transporte de ambos SVCTs, en el cual el transportador presenta un sitio de unión para el sustrato AA, al menos dos sitios de unión para Na+ y un sitio de unión Ca2+ y Mg2+. Durante el ciclo de transporte ambos sitios de unión a sodio interactúan entre ellos y además interaccionan con el sitio de unión a AA, el cual a su vez afectaría recíprocamente la interacción entre ambos sitios de unión a sodio. De igual manera el sitio de unión a cationes divalentes interacciona con el sitio de unión a AA ya que se ha visto que en ausencia de cationes divalentes el transportador es inactivo. Aunque existen numerosos estudios acerca de los aspectos cinéticos y funcionales de SVCT2, no existe información estructural disponible para este transportador. Análisis de hidrofobicidad revelaron que los SVCTs son altamente hidrofóbicos y están compuestas por 12 hélices de transmembrana unidas entre sí por lazos ricos en aminoácidos hidrofílicos y con los extremos amino y carboxilo-terminal orientados hacia la cara citoplasmática de la célula. Sin embargo hasta la fecha, no se tienen antecedentes acerca de la estructura 3D de SVCT2 ni del estado de oligomerización de este transportador en la membrana celular. Por otro lado, existe evidencia que indica que la oligomerización es una característica esencial para la estructura y función de los transportadores de membrana. Cristalización de diferentes transportadores de membrana bacterianos junto a diversos estudios utilizando técnicas alternativas a la cristalización, como ensayos de entrecruzamiento, transferencia de energía de resonancia de Föster (FRET), coinmunoprecipitación, entre otras, han llevado a proponer que aproximadamente el 70% de los transportadores están formando oligómeros en la membrana plasmática, por ejemplo, transportadores que usan el gradiente electroquímico como energía para catalizar la translocación de su sustrato, existen como oligómeros de alto orden, dímeros (vSGLT y LeuTA), trímeros (AcrB, GltpH y BetP) o tetrámeros (GLUT1)), aunque evidencia de monómeros (Mhp1) también fue reportada. Recientes estudios de microscopía electrónica en hSVCT1 expresado en ovocito, reveló la presencia de dos poblaciones de partículas con distinta forma y estructura a baja resolución lo que sugiere la presencia de monómeros y dímeros del transportador. Por otro lado, ensayos de entrecruzamiento químico confirmaron la presencia de dímeros en membranas aisladas de estos ovocitos, aunque a concentraciones menores comparadas con el monómero de hSVCT1. La información estructural es importante para comprender el mecanismo de estos transportadores a nivel molecular. Por lo que el propósito de esta tesis fue determinar la estructura cuaternaria de hSVCT2. Ensayos de entrecruzamiento químico de hSVCT2 seguido de inmunomarcaje con anticuerpos específicos sugieren que hSVCT2 existe como dímero. Además, realizamos ensayos de transporte de AA para comprender la significancia funcional de la oligomerización de hSVCT2 y así poder determinar la unidad mínima funcional de este transportador de membrana. Dentro de estos ensayos realizamos estudios funcionales de co-expresión del transportador activo (nativo) y una mutante inactiva de hSVCT2 (H109Q), que revelaron que hSVCT2 nativo no restauró la capacidad de transporte de la mutante inactiva, ni esta última suprimió la capacidad de transporte del transportador nativo. Por otro lado, al coexpresar el transportador nativo junto a una mutante (C113S o C160S) que presenta características cinéticas alteradas (Km aparente de transporte, al menos 5 veces superior a la del transportador nativo), revelaron que a todas las razones moleculares ensayadas se detectó un único componente cinético que corresponde a la proteína que se expresa en mayor proporción. A partir de estos resultados, podemos proponer que hSVCT2 forma dímeros en membrana celular, que la unidad mínima de transporte dentro del dímero de hSVCT2 podría ser el monómero y que los monómeros dentro del dímero son capaces de interactuar entre ellos modulando sus propiedades cinéticas.
Análisis de la microbiota y parasitofauna de ejemplares de Dissostichus eleginoides smitt, 1898, capturados en la zona centro-sur de Chile.
(Universidad de Concepción., 2021) Fernández Fonseca, Italo Antonio; Campos Araneda, Víctor Leandro
La carne de pescado presenta propiedades nutricionales que son relevantes en el ámbito de la alimentación humana, que los convierten en alimentos fundamentales dentro de lo considerado como alimentación equilibrada y cardiosaludable. Por su geografía, Chile es uno de los principales países que basan parte de su economía en la industria pesquera industrial y artesanal. Sin embargo, al igual que el resto del mundo, el país se enfrenta a la sobreexplotación de sus recursos pesqueros, ya sea por su exceso de capturas, así como la carencia de información respecto del estatus sanitario de éstas. De hecho, a mediados de la década pasada se reconoce que las principales pesquerías que operan en Chile se encuentran sobre explotadas o agotadas. Es en este contexto que surge, como una pesquería relativamente emergente y valiosa, la explotación sobre el bacalao de profundidad Dissostichus eleginoides, pez de profundidad conocido internacionalmente como Patagonian Toothfish o Chilean Seabass. Esta especie, a pesar de encontrarse presente a lo largo de casi todo el dominio marítimo de Chile, es un recurso poco conocido desde el punto de vista biológico. Diversas investigaciones, efectuadas desde hace dos décadas, han dado cuenta de información respecto de la ecología, alimentación, reproducción, estructura poblacional, etc. de D. eleginoides. Sin embargo, existen escasos antecedentes respecto de la parasitología y, sobre todo, de la microbiología de esta especie. Desde el punto de vista parasitario, se han efectuado investigaciones principalmente en poblaciones de D. eleginoides localizadas en el Océano Atlántico y en algunas islas subantárticas. Solo dos trabajos se han realizado en ejemplares capturados en Chile, pero datan de, a lo menos, una década. En ellos puede apreciarse que la parasitofauna de esta especie es particularmente distinta de lo reportado en estudios similares en otras localizaciones. Por el contrario, desde el punto de vista microbiológico no existen antecedentes en esta especie, al menos en ejemplares salvajes. Solo se cuenta, a la fecha, con antecedentes provistos por una investigación efectuada en un ejemplar de D. eleginoides capturado en aguas australes de Chile, pero que fue mantenido en condiciones de cautiverio de seis meses. Investigaciones respecto de la parasitofauna y de la comunidad bacteriana de D. eleginoides son relevantes dado que para comprender su funcionamiento es necesaria su identificación y/o cuantificación, lo que a su vez permite inferir respecto de la diversidad poblacional de la muestra analizada, así como del estado de salud del hospedero en particular. Por lo mencionado anteriormente, el objetivo del presente trabajo fue caracterizar la comunidad bacteriana y parasitaria del tracto gastrointestinal de ejemplares de D. eleginoides, capturados en aguas de la zona centro sur de Chile. Los resultados obtenidos demuestran, en primer lugar, que la parasitofauna de D. eleginoides que habitan aguas de Chile parece ser singular, tributando a su rol de carnívoro de tope, pero correspondiendo a una población particular de la especie. Así mismo, dan cuenta del primer reporte del parasitismo por Rocinela aff. australis en D. eleginoides y del hallazgo de larvas de Pseudoterranova sp., cuya presencia solo había sido informada en ejemplares capturados en otras latitudes. Por el contrario, los resultados a nivel microbiológico no coinciden con lo previamente reportado debido a, probablemente, limitaciones metodológicas. Finalmente, tanto en los resultados del ámbito parasitario como microbiológico, las extensas migraciones y las condiciones batimétricas en las cuales habita D. eleginoides en la costa de Chile, parecieran seleccionar una comunidad bacteriana y parasitofauna particular, lo que sería característico y correspondiente con la población o stock pesquero de esta especie en aguas chilenas. Por lo tanto, y debido a la escasez de antecedentes con que se cuenta a la fecha, los resultados obtenidos en esta investigación son pioneros en la especie y pueden servir como línea de base para estudios posteriores.
Análisis del mecanismo de remodelamiento nucleosomal asociado con la expresión temporal de genes de histonas alfa durante la embriogénesis temprana del erizo de mar tetrapygus niger.
(Universidad de Concepción., 2001) Medina Díaz, Ricardo Felipe; Montecino Leonard, Martín Alejandro
La regulación transcripcional en eucariontes ocurre en el contexto de la cromatina y está fuertemente influenciada por las barreras impuestas por la estructura nucleosomal. Entonces, una pregunta fundamental en biología es saber ¿cómo el genoma eucariótico es manipulado en el ambiente cromatínico?. In vivo, existe una asociación directa entre la remodelación de la estructura de la cromatina y la expresión regulada de genes eucarióticos. En la presente Tesis Doctoral se estudiaron los cambios que sufre la estructura cromatínica y las interacciones de factores de transcripción como consecuencia de la expresión de los genes de histonas tempranas en erizo de mar. Este modelo presenta grandes ventajas ya que en él es posible el estudio de los mecanismos involucrados en la regulación temporal de la expresión génica durante el desarrollo embrionario. En este sistema, luego de la fecundación, se expresan secuencialmente a distintos tiempos del desarrollo embrionario los genes de las histonas CS, histonas tempranas e histonas tardías. Durante este trabajo se clonó y secuenció el gen de la histona temprana H3 del erizo de mar Tetrapygus niger y se determinó su patrón de expresión, el cual se inicia al estado de 16 células, alcanza un máximo al estado de 128 células y luego declina al estado de larva Pluteus. Se encontró además un sitio hipersensible a DNasa I localizado en la posición –90 de la región promotora de este gen, el cual sólo se detectó cuando se observaron los máximos niveles del mRNA de la histona temprana H3. Se identificó el elemento regulador TnH3CCAAT (nt –94/–77), que incluye al sitio hipersensible a DNasa I, como el responsable de unir un complejo proteico presente al estado de 128 células y cuyo componente de unión al DNA es el factor de transcripción homeodominio CDP/cut. Se estableció un protocolo de purificación de complejos remodeladores de cromatina que pudieran tener un rol en la activación transcripcional temporal. Además, se identificó un complejo de características bioquímicas similares que incluye a CDP/cut como componente de unión al DNA, en un estado del desarrollo embrionario en el cual no se observa expresión del gen de la histona temprana H3 de T. niger. En base a estos resultados se postula un modelo que pretende explicar este cambio en el patrón de expresión de este gen en términos de complejos proteicos que contienen a CDP/cut como componente de unión al DNA y de estructura cromatínica durante el desarrollo embrionario de erizo de mar. Se estudió también el posible rol del remodelamiento de la estructura de la cromatina espermática inmediatamente después de producida la fecundación. Este proceso requiere un remodelamiento de la estructura de la cromatina espermática y el reemplazo de las proteínas histónicas espermáticas por histonas CS de origen materno. En este período tan particular del desarrollo embrionario es necesaria una fuerte decondensación del pronúcleo masculino altamente compactado, con el fin de reestablecer la diploidía del genoma del embrión. En el presente trabajo también se describe por primera vez la presencia de una actividad remodeladora de cromatina dependiente de energía en citoplasma, pero no en núcleo, de óvulos sin fecundar. Esta actividad remodeladora de cromatina contendría como componente catalítico una subunidad relacionada a ISWI. No se detectaron proteínas relacionadas a SWI2/SNF2 tanto en citoplasma como en núcleo de óvulos sin fecundar. Estos resultados nos llevan a postular un modelo en el cual se incluye a esta actividad remodeladora de cromatina, conjuntamente con otras actividades enzimáticas y que explicarían el fenómeno de decondensación del pronúcleo masculino posfecundación.
Análisis del papel funcional y estructural de residuos de cisteína del transportador de ácido ascórbico SVCT2.
(Universidad de Concepción., 2014) Aylwin Ramírez, Carlos Francisco; Vera Cárcamo, Juan Carlos
SVCT2 es un transportador de ácido ascórbico de expresión ubicua importante para la mantención de niveles normales de ácido ascórbico en tejidos. Funcionalmente, SVCT2 posee una Km de transporte de ácido ascórbico cercana a 20 μM y un mecanismo de cotransporte de 2 iones sodio por molécula de ácido ascórbico. El ión sodio activa cooperativamente el transporte de ácido ascórbico a través de una disminución de la Km de transporte desde ≈2 mM en ausencia de ión sodio, hasta ≈20 μM en presencia de 135 mM ión sodio. El modelo 3D predicho de SVCT2 sugiere un plegamiento de 14 segmentos transmembrana (STM) agrupados en tres grupos. El dominio central está formado por los STM 1, 2, 3, 8, 9 y 10 y contiene los sitios de unión a ácido ascórbico y iones sodio. El dominio de compuerta está formado por los STM 6, 7, 13 y 14 y actúa como un filtro de selectividad. Los STM 4, 5, 11 y 12 actúan como STM de acoplamiento entre los dominios de compuerta y el canal central. SVCT2 posee 14 residuos de cisteína presentes en los tres grupos que definen la topología del transportador en la membrana celular. En esta tesis propusimos establecer la importancia estructural-funcional de los residuos de cisteína de SVCT2. El modelo de estudio correspondió a células HEK-293 SVCT2 fusionado a la proteína fluorescente verde (SVCT2-GFP). Analizamos el efecto de agente reductor DTT y del tratamiento con los alquilantes PCMB y NEM sobre el transporte de ácido ascórbico mediado por SVCT2. Luego, reemplazamos sistemáticamente cada residuo de cisteína por serina generando mutantes simples, dobles, triples y un transportador sin residuos de cisteína (SVCT2 cysless). Además, se prepararon 5 grupos de mutantes múltiples, reemplazando los residuos de cisteína presentes en el dominio central, dominio de compuerta, STM de acoplamiento, en lazos exofaciales y lazos endofaciales en SVCT2. Cada mutante fue examinado por su localización subcelular, propiedades funcionales y sensibilidad al tratamiento con PCMB y NEM. Los resultados obtenidos indican que el tratamiento con DTT no afecta el transporte de ácido ascórbico, sugiriendo que la actividad de SVCT2 no requiere de un estado oxidado a nivel de cadenas laterales de residuos de cisteínas. Por otro lado, el tratamiento con una concentración PCMB y NEM equivalente a cada IC50, produce una disminución de la Vmax de transporte sin alterar la Km para ácido ascórbico ni la activación cooperativa por el Na+, probablemente a través de la inactivación completa del transportador. Los resultados de mutagénesis sitio-dirigida de residuos de cisteína, revelaron que la sustitución individual de 9 de los 14 residuos de cisteína no afectan el nivel de expresión, localización subcelular ni sus propiedades de transporte de ácido ascórbico. SVCT2 posee 5 residuos de cisteína (113, 129, 160, 187 y 401) importantes para mantener la Km de transporte para ácido ascórbico, presentes en los STM y lazos conectores del dominio central del transportador, con residuos de cisteína en el STM1, STM8, lazo exofacial 1-2, lazo exofacial 3-4 y lazo endofacial 2-3. El reemplazo de residuos de cisteína de la mitad carboxilo-terminal está localizado en la membrana plasmática y posee una muy baja actividad de transporte. SVCT2 mutante de la mitad amino-terminal, presenta una localización intracelular. SVCT2 cys-less presenta bajos nivel de expresión y es se localiza a nivel de retículo endoplásmico. Basados en los resultados obtenidos en esta tesis, proponemos que los residuos de cisteína de SVCT2 participan en al menos dos aspectos de importancia funcional-estructural. Primero, el proceso de plegamiento y tráfico hacia la membrana plasmática es altamente dependiente de la presencia de residuos de cisteína de SVCT2. Segundo, los residuos de cisteínas de los STM del dominio central, son importantes en modular aspectos específicos de las propiedades funcionales de SVCT2, principalmente la Km para ácido ascórbico sin alterar la cooperatividad por el Na+.
Arquitectura regulatoria osteogénica del locus SCPP
(Universidad de Concepción., 2021) Romero Mora, Adrián; Marcellini Liotaud, Sylvain
La familia del locus SCPP (Secretory Calcium-binding PhosphoProtein) codifica para componentes esenciales de matriz del tejido esquelético mineralizado en vertebrados. En el anfibio Xenopus tropicalis, el locus abarca 150 Kb y contiene los genes Dmp1, Ibsp y Scppa2 que se expresan en hueso. Estos genes se originaron desde un ancestro común por duplicaciones en tándem. Durante el proceso evolutivo, cada uno de estos genes ha generado patrones de expresión divergentes. Dmp1 se expresa en osteocitos mientras que Ibsp y Scppa2 se expresan en osteoblastos y osteocitos. El objetivo de este trabajo fue entender cómo los miembros del locus SCPP son regulados y por lo tanto pueden desplegar patrones de expresión divergentes. Se propone que dicha regulación involucra la acción de múltiples MCRs que contactan y coregulan promotores de miembros coexpresados en etapas específicas del proceso de diferenciación del linaje osteogénico. El primer objetivo consistió en combinar hibridación in situ con tinción nuclear con DAPI usando pruebas exónicas (transcritos citoplasmáticos estables) e intrónicas (transcritos nucleares transcientes) y se demostró que Ibsp es un gen que se expresa activa y exclusivamente en osteoblastos y no en osteocitos. Los datos derivados de este trabajo revelaron un fuerte cambio regulatorio en la transición osteoblasto-osteocito. Ibsp es abruptamente apagado mientras Dmp1 es rápidamente activado. En todos los experimentos se incluyó también el gen Sparc debido a que comparte una historia evolutiva con el gen Sparcl1, del cual derivaron los SCPP por duplicaciones en tándem y su expresión en hueso es similar a la del gen Ibsp. Considerando que osteocitos directamente diferencian desde osteoblastos, la expresión osteocítica reportada previamente para Ibsp y Sparc se debe a la vida media larga de los RNA mensajeros y no a un proceso activo de transcripción. Usando el enriquecimiento de marcas de cromatina asociadas a enhancers activos, se caracterizó la actividad transcripcional en osteoblastos de los MCRs putativos activos y ligados al locus SCPP y los MCRs ligados a Sparc. Se identificaron 2 enhancers que activan el promotor de Ibsp, uno proximal (fuerte) y uno distal (débil). Sorpresivamente, el promotor de Scppa2 fue reprimido por dos MCRs, uno de ellos ligeramente activó el promotor de Ibsp. Ningún enhancer putativo activó el promotor de Dmp1, lo que era esperado dado que dicho promotor no es activo en osteoblastos. Respecto a Sparc, al menos 3 enhancers fueron activos, dos proximales (fuertes) y un distal (débil). Para evaluar si la arquitectura de la cromatina está involucrada en mantener unidos los miembros SCPP se utilizó el ensayo de Captura de Conformación de Cromosoma Circular (4C seq) en osteoblastos primarios. Se identificaron las interacciones entre los promotores basales de los genes SCPP con diferentes regiones del genoma. También se demostraron las diferentes interacciones asociadas al promotor Sparc. Se demostró que los genes SCPP ácidos expresados en hueso se encuentran en un microdominio de interacciones frecuentes. El enhancer proximal que activó Ibsp tuvo una alta frecuencia de interacción con su promotor blanco. Se demostró también que los promotores Ibsp y Dmp1 se contactan. Respecto a Sparc, los enhancers proximales de mayor actividad en estudios reporteros contactan a su promotor, el enhancer proximal además muestra cromatina abierta y es conservado en la evolución de vertebrados. Los resultados de este trabajo permitieron entender cómo los miembros del locus SCPP se han mantenido en clúster, y cómo han adquirido expresión diferencial en el linaje osteogénico contribuyendo así al entendimiento de los mecanismos transcripcionales desplegados durante la transición osteoblasto/osteocito.
Asociación de SALL2 y vía WNT/β-CATENINA en cáncer de colon.
(Universidad de Concepción, 2023) Quiroz Lagos, Aracelly Scarlet; Pincheira Barrera, Roxana Jacqueline
SALL2 es un factor de transcripción implicado en el desarrollo embrionario, y funcionalmente se relaciona con la regulación de la proliferación, migración y supervivencia celular. Análisis de datos masivos de cáncer versus tejidos normales indican que el ARNm de SALL2 se encuentra significativamente disminuido en el cáncer colorrectal (CCR), un tipo de cáncer caracterizado por la hiperactivación de la vía Wnt/β-catenina. De manera interesante, análisis previos de Inmunoprecipitación de cromatina-secuenciación (ChIPseq) del laboratorio sugirien que SALL2 regula genes asociados con la vía Wnt. Sin embargo, a la fecha no se ha caracterizado la expresión proteica de SALL2 en tejidos de colon normal o CCR. Por otra parte, se desconoce el rol de SALL2 en CCR y su relación con la vía Wnt. Para caracterizar la expresión de SALL2 en tejidos de colon, se construyó un tissue microarray usando 130 biopsias de archivo del Hospital Guillermo Gantt Benavente incluyendo colon normal, adenoma y CCR, y se evaluó la expresión y localización de SALL2 mediante inmunohistoquímica. Encontramos que SALL2 se expresa en el núcleo y el citoplasma del epitelio, y en el estroma del colon normal se expresa en fibroblastos. Sin embargo, su expresión está disminuida en el adenoma y ausente en el CCR, coincidiendo con los resultados bioinformáticos previos. En biopsias de CCR observamos una correlación negativa entre la expresión de SALL2 y la expresión de β-catenina nuclear en el frente migratorio, un marcador pronóstico. Esta correlacion se confirmó en células CCR con ganancia y pérdida de función de SALL2 a través de inmunofluorescncia y fraccionamiento subcelular. Además, evaluamos la dependencia de SALL2 en la expresión de blancos de la vía Wnt por Western blot y qRT-PCR, encontrando una correlación positiva entre SALL2 y AXIN2, un importante regulador negativo de la vía Wnt. El análisis del promotor de AXIN2 identificó varios sitios de unión putativos de SALL2. A nivel mecanístico demostramos que la inducción de SALL2 en modelos celulares doxiciclina inducible, aumenta la actividad del promotor de AXIN2. A través de ChIP-PCR demostramos que SALL2 se une a la porción proximal del promotor de AXIN2, lo que confirma una regulación transcripcional dependiente de SALL2. Finalmente, mostramos que el eje SALL2-AXIN2 es necesario para la respuesta de supervivencia a XAV939, un inhibidor de la vía Wnt. En conclusión, nuestro estudio confirma que SALL2 regula positivamente la transcripción de AXIN2. Se propone que la pérdida de la expresión de SALL2 durante la progresión del CCR contribuye a la disminución de los niveles de AXIN2, lo que contribuye a la hiperactivación de la vía Wnt.
Asociación del receptor de 1a,25 dihidroxivitamina D3 a dominios subnucleares: rol de la fosforilación y de interacción con proteínas correguladoras.
(Universidad de Concepción., 2007) Arriagada Inostroza, Gloria Loretto; Montecino Leonard, Martín Alejandro
Debido a que los receptores nucleares tienen un efecto rápido en la transcripción de genes, debe existir un mecanismo específico que asegure la localización oportuna y eficiente en los sitios en que se requiere de su función. Uno de los mecanismos propuestos involucra un cambio en la distribución subnuclear y la asociación a dominios subnucleares inducido por la unión del ligando. Este mecanismo ha sido propuesto para el receptor de glucocorticoides (GR), receptor de andrógenos (AR), receptor de mineralocorticoides (MR), receptor de estrógenos y receptor de 1α,25 dihidroxivitamina D3 (VDR). A pesar de ello, no se ha definido aún la naturaleza del dominio subnuclear al que se asociaría VDR, ni si esta proteína es capaz de asociarse a la matriz nuclear. Esta tesis se centró en investigar la asociación de VDR a matriz nuclear y como la fosforilación del receptor, así como su interacción con proteínas coactivadoras, están contribuyendo o modulando esta asociación. Mediante experimentos de colocalización con dominios previamente descritos demostramos que VDR se asocia a dominios subnucleares específicos, que son diferentes a los de los sitios de splicing, de los cuerpos PML y los cuerpos de Cajal. Realizando preparaciones bioquímicas e in situ de matriz nuclear en las que se detectó el receptor VDR endógeno o sobreexpresado en su versión silvestre o con mutaciones en el residuo de serina 51, demostramos que este receptor se asocia a matriz nuclear en presencia de ligando y que esta asociación sería modulada por al menos dos componentes; uno sería la unión del ligando y la interacción con proteínas coactivadoras asociadas a matriz nuclear y el segundo, sería la retención nuclear de VDR dada por la fosforilación del residuo de serina 51 por PKC. Además, nuestros resultados nos permitieron descartar que el factor de transcripción óseo específico Runx2, es el responsable de la retención de VDR en la matriz nuclear.
Aspectos estructurales y cinéticos de la interacción de la arginasa humana tipo II con sustratos, iones metálicos e inhibidores.
(Universidad de Concepción., 2004) López Palma, Vasthi
Los mamíferos contienen dos isoenzimas de arginasas: una citosólica, localizada fundamentalmente en hígado (arginasa tipo I), y otra mitocondrial, característica de tejidos extrahepáticos (arginasa tipo II). Hasta ahora, la mayor parte de los estudios se han concentrado en la arginasa tipo I, a pesar de un interés creciente por la participación de la isoenzima II en la regulación de los niveles de arginina disponibles, especialmente, para la síntesis de óxido nítrico. Como una manera de contribuir al conocimiento de la isoenzima II, este trabajo de tesis doctoral tuvo los siguientes objetivos generales: (a) analizar las propiedades cinéticas de la isoforma II; (b) demostrar que, al igual que la isoforma I, especies de la arginasa human II que contienen 1 Mn2+/subunidad, son catalíticamente activas, aunque pueden ser hiperactivadas por unión de un segundo Mn2+, (c) definir, mediante mutagénesis sitiodirigida, la participación de los residuos conservados en la familia de las arginasa (His-120, His-145, His-160, Asp-147, Asn-149) en la interacción de la enzima con el sustrato y los iones metálicos activadores y su eventual participación en la catálisis. En nuestra opinión, los resultados obtenidos en este trabajo contribuyen en forma significativa al conocimiento de la enzima arginasa y, especialmente, de la isoforma humana II, en tres aspectos fundamentales: (a) Hemos demostrado que las especies mononucleares son catalíticamente activas y, en base a sus propiedades cinéticas, estamos en condiciones de sugerir que ellas constituyen la forma fisiológicamente relevante de la enzima; (b) Hemos demostrado que, pesar de las similitudes en términos de secuencia y estructura terciaria y cuaternaria, existen diferencias significativas en los sitios activos de las isoformas de arginasa humana, las que se reflejan en sus interacciones con el metal activador, el sustrato e inhibidores; (c) Mediante mutagénesis sitio-dirigida, hemos sido capaces, de alterar la especificidad de una especie de arginasa, convirtiendo a la enzima II en proteína con actividad agmatinasa, lo que no tiene precedente en la literatura. La actividad catalítica de una preparación purificada de arginasa tipo II fue prácticamente duplicada por incubación con Mn2+ 2 mM durante 20 minutos a 60 oC (hipertactivación). La enzima presentó una cinética hiperbólica al pH óptimo de 9,5, tanto en su estado hiperactivado, como semi-activado. Por el contrario, a pH 7,5, la hiperactivación se acompañó de un cambio desde una cinética cooperativ a una hiperbólica. Los efectos cooperativos para el sustrato desaparecieron en presencia de bajas concentraciones de agmatina, un análogo estructural del sustrato e inhibidor competitivo de la enzima, lo que sugiere la presencia de un sitio alostérico en la enzima tipo II. Al igual que la cooperatividad para el sustrato, la funcionalidad de este sitio, expresada como una activación por agmatina a bajas concentraciones de arginina, no se manifiesta en la enzima hiperactivada, y tampoco en la enzima tipo I. En base a estudios cinéticos de inhibición en presencia del producto ornitina y los análogos de la ornitina (putrescina) y urea (ion Gdn+), proponemos un mecanismo cinético que comprende la unión de la arginina como el primer sustrato, la liberación secuencial ordenada de ornitina y urea, y la formación de un complejo abortivo enzima-ornitina. Considerando las propiedades de las mutantes H120N y H145N, sugerimos que la actividad de la arginasa tipo II, depende estrictamente de un Mn2+ unido firmemente a la proteína coordinado por la His-120, aunque esta actividad puede ser estimulada por otro Mn2+ que se une en forma más lábil, coordinado por la His 145. Este último ion manganeso sería necesario sólo para llevar a la arginasa de un estado activo a uno de mayor actividad. Los estudios de mutagénesis sitio-dirigida también sugieren una función esencial para la asparagina-147, probablemente estabilizando al agente nucleofílico, mediante un puente hidrógeno. Sugieren, además, que la histidina-160 es crítica, pero no esencial, para la actividad catalítica de la arginasa tipo II, probablemente permitiendo una adecuada orientación del sustrato, y participando como una lanzadera de protones desde el solvente al grupo -amino de la ornitina, previo a la disociación del producto. Un resultado particularmente interesante lo constituyó la actividad agmatinásica de la mutante N149D, que no presentó actividad arginasa, lo que podría explicarse por una repulsión entre la carga negativa introducida y el grupo -carboxilo del sustrato. Por el contrario, al carecer de este grupo, la agmatina podría unirse y ser hidrolizada por la enzima. Este y otros residuos vecinos serían los determinantes de las diferencias de especificidad entre la arginasa y la agmatinasa.
El Aumento de D-Glucosa Extracelular Modifica el Estado de Metilación Global del ADN y la Función de Adhesión de las Células Progenitoras de Endotelio Humano Tempranas.
(Universidad de Concepción, 2023) Fernández Garcés, Paulina Carola Tálitha ; Gutiérrez Gallegos, Soraya Elisa
Diabetes mellitus tipo 2 (DM2), constituye una enfermedad metabólica atribuida a factores genéticos y ambientales, que afecta las funciones angiogénicas de las Células Progenitoras Endoteliales Humanas (hEPC) las cuales no logran ser restauradas en respuesta a un buen control glicémico, manteniendo así, alterada su función en el tiempo. Por lo tanto, es probable que la exposición permanente a un ambiente con niveles de glucosa superiores a los valores plasmáticos normales (5mM o 90mg/dl), produzca alteraciones a nivel epigenético que puedan explicar la mantención de las alteraciones angiogénicas en las EPC. En la presente investigación, hEPC fueron cultivadas durante 4 días (hEPC4d) en 5mM (90mg/dl) de D-Glucosa, concentración equivalente a valores plasmáticos normales, 10mM (180mg/dl) para simular una concentración de DGlucosa considerada como "clínicamente aceptable" en pacientes diabéticos, y 20mM (360mg/dl) de D-glucosa para simular un ambiente hiperglicémico en pacientes diabéticos. Posteriormente, se evaluó la capacidad de adhesión de las células a una matriz de fibronectina. Para evaluar si las concentraciones de Dglucosa tenían impacto en los niveles de metilación global del ADN de hEPC-4d, se midieron los niveles de 5-metilcitosina (5mC), 5 hidroximetilcitosina (5hmC) y los niveles de expresión de los genes TET1 y TET2. Los resultados obtenidos indican que la suplementación del medio de cultivo con 20mM de D-Glucosa resulta en una disminución de la adhesión celular y adicionalmente, al cultivar las células hEPC-4d en 10mM y 20mM se puede observar una hipometilación global del ADN, y un aumento de 5hmC. Estos cambios en el patrón de metilación no fueron acompañados por cambios en los niveles de ARNm de los genes TET1 y TET2. Por lo tanto, se concluye que 20mM de D-glucosa genera una hipometilación del genoma en las hEPC-4d y una disminución de su capacidad de adhesión, fenómeno independiente de los niveles de expresión de los genes TET1 y TET2. Aunque la concentración de D-Glucosa considerada como glicemia "clínicamente aceptable" en un paciente diabético (10mM o 180mg/dl), no produce cambios significativos en la adhesión de hEPC-4d, sí se observa una hipometilación global del genoma, que podría ser la responsable de la alteración de las funciones angiogénicas de estas células en pacientes que, desde el punto de vista clínico, tienen un buen control en los niveles plasmáticos de glucosa.
El aumento de la actividad transamidante de TG2 potencia la vía amiloidogénica en modelos de la enfermedad de Alzheimer.
(Universidad de Concepción, 2023) Panes Fernández, Jessica Daniela; Fuentealba Arcos, Jorge
La Enfermedad de Alzheimer (EA) es la principal forma de demencia que afecta a los adultos mayores. Se caracteriza por una muerte neuronal progresiva en zonas de hipocampo, corteza y amígdala. Se postula que uno de los principales agentes tóxicos responsables de la neurodegeneración es la agregación tóxica del oligómeros del péptido β-amiloide (AβOs), ya que inducirían los principales eventos celulares con los que cursa esta patología, tales como dishomeostasis del Ca+2, disfunción mitocondrial, y la falla sináptica. TG2 es una enzima ubicua cuya función principal es la formación de enlaces isopeptídicos entre proteínas o péptidos, cuyo sitio catalítico se activa frente a concentraciones micromolares de Ca2+. Se ha descrito un aumento de la transcripción de TG2 en diferentes modelos transgénicos de la EA, así como en corteza de pacientes con EA. En esta tesis doctoral se evaluaron cambios en los niveles de TG2 en distintos modelos de la EA, y el efecto de la función transamidante de la enzima TG2 en la agregación del péptido Aβ, y sus principales efectos tóxicos en la función mitocondrial y neuronal. Observamos que los niveles de TG2 en el hipocampo de ratones J20 de 10 meses estaban aumentados (246 ± 17%), y que la actividad transamidante estaba potenciada (159 ± 20%), en comparación con animales WT de la misma edad. Observamos un aumento significativo de la expresión de TG2 en lisado total de hipocampo (286 ± 5 %,), y en fracción mitocondrial (313 ± 4 %) de ratones APP/PS1, en comparación con los ratones WT de la misma edad. Además, neuronas del hipocampo tratadas de forma crónica con oligómeros de Aβ (AβOs, 0.5 μM) mostraron un aumento de la inmunoreactividad de TG2 (146 ± 17%) en comparación con células no tratadas. Conjuntamente, evaluamos la capacidad de TG2 para promover los procesos de agregación del péptido Aβ, comparándola con la formación “autocatalítica” previamente estandarizada por nuestro grupo de investigación. La conversión amiloide inducida por TG2, mostró seguir una cinética hiperbólica exponencial, y fue capaz de inducir agregados con un tamaño medio de 7-13 unidades (∼28, 40, 52 kDa) que presentaban una alta citotoxicidad (85 ± 3 %). En tanto que, la formación autocatalítica mostró seguir una cinética sigmoidal, formando agregados más pequeños de tamaño de medio de 7 unidades (∼28 kDa) que presentaban una menor citotoxicidad (69 ± 3 %). El tratamiento agudo con AβTG2 indujo una rápida sobrecarga de Ca2+ citosólico (300 ± 22%) y Ca2+ mitocondrial (335 ± 43%). Utilizando la técnica de PLA, observamos que la formación del complejo IP3R/VDAC1 aumentó en las neuronas expuestas a AβTG2 bajo tratamientos crónicos (220 ± 12%). Mediante registros de patch clamp, observamos un aumento en la actividad neuronal (30 min, 257 ± 14%), que disminuyó bajo tratamientos crónicos (AβTG2 24h: 30 ± 5%). Nuestros análisis in silico mostraron que el dominio catalítico de TG2 puede interactuar con el péptido Aβ en la región N-terminal (ΔG: -10.9, Kd: 9.754e-006, Energía del complejo: -1504). De forma complementaria, quisimos evaluar la expresión de TG2 frente a la inhibición parcial del complejo mitocondrial I (MCI) con el fármaco CP2 (25 mg/kg/day) en ratones APP/PS1 sintomáticos de 24 meses, tratados durante 15 meses. Observamos que CP2 fue capaz de revertir la sobrexpresión de TG2 en animales APP/PS1 en comparación a los animales no tratados. Finalmente, quisimos correlacionar estos cambios con marcadores de función mitocondrial utilizando los mismos modelos animales. Demostramos que CP2 restaura la morfología mitocondrial, y la comunicación retículo-mitocondria, utilizando reconstrucciones tridimensionales de volúmenes obtenidas por microscopía electrónica en serie. En conjunto, nuestros resultados indican que cambios en la formación de agregados de Aβ en modelos de la EA estaría asociada a un incremento de la actividad transamidante de TG2, por lo que puede ser un potencial blanco para el desarrollo de estrategias farmacológicas en el tratamiento de la EA, y respaldan adicionalmente el desarrollo de inhibidores de TG2 como una estrategia para prevenir la agregación amiloide observada en la EA. Se requerirá avanzar en estudios adicionales, que profundicen en los mecanismos que regulan la transcripción de TG2, y los elementos involucrados en la aceleración de la vía amiloidogénica durante la progresión de la EA.
Aumento en la expresión de P2X2 inducido por el péptido aβ, su impacto en la endocitosis de APP y en la distribución de Fe65 en la enfermedad de alzheimer.
(Universidad de Concepción., 2021) Godoy Rivera, Pamela Andrea; Fuentealba Arcos, Jorge
La Enfermedad de Alzheimer (EA) es el principal tipo de demencia que afecta a la población adulta mayor y se postula que el principal agente tóxico en la patología de esta enfermedad neurodegeneratitva es el péptido β-amiloide (Aβ). Específicamente, serían los oligómeros solubles del péptido (Aβo) los que provocan los principales efectos neurotóxicos como son la falla sináptica y disfunción mitocondrial. Además, se ha propuesto que estos oligómeros son capaces de formar un poro no selectivo en la membrana plasmática, lo que genera entre otras cosas, la dishomeostasis del Ca2+ intracelular. En nuestro grupo se pudo establecer que este poro también permite la salida de ATP al medio extracelular, potenciando el rol de esta molécula como neurotransmisor, y por ese motivo, en este trabajo quisimos estudiar el impacto que ese incremento tendría en la señalización purinérgica. Es conocido que los receptores purinérgicos cumplen diferentes roles en la comunicación celular en el sistema nervioso central, y en particular, los receptores ionotrópicos P2XR, han sido descritos en roles tan relevantes como la neuroinflamacion (P2X7R), en esta misma familia se encuentra el P2X2R, asociado a una función principalmente neuronal, y cuyas dos isoformas principales son P2X2a y P2X2b. La primera contiene la secuencia completa de la proteína, mientras que la segunda no tiene 69 aminoácidos del extremo C-terminal; cabe señalar que por este motivo solo P2X2a interacciona con Fe65, proteína adaptadora que transloca al núcleo donde activa la transcripción del coactivador 1 α del receptor activado por proliferadores de peroxisoma (PGC-1α), regulador maestro de la biogénesis mitocondrial, entre otros. En paralelo, Fe65 puede interaccionar adicionalmente, con la proteína precursora amiloide (APP), y se postula que regula el tráfico y procesamiento proteolítico de esta. APP puede ser proteolizada por la vía amiloidogénica (que da origen al péptido Aβ) y no amiloidogénica. Ambos procesamientos ocurren en distintos compartimentos celulares; la vía amiloidogénica ocurre principalmente en compartimentos con pH más ácido, como endosomas, mientras que la no amiloidogénica ocurre principalmente en la membrana plasmática. Por este motivo, el tráfico y endocitosis de APP son eventos celulares relevantes para la producción del péptido Aβ, que podrían condicionar la toxicidad amiloide y la fisiopatología de la EA. Este trabajo se basa en la evidencia previa del laboratorio, donde se ha demostrado la sobreexpresión de P2X2R tras la exposición a Aβo, y se enfocó en estudiar posibles consecuencias celulares y moleculares, asociadas a este aumento de la expresión de P2X2R. De los resultados obtenidos, confirmamos que P2X2R aumenta en modelos celulares tratados con Aβo y en el cerebro de pacientes con la EA. Específicamente, nuestros estudios en modelos celulares, nos sugieren que la isoforma P2X2a se expresa principalmente. Además, observamos que tanto la exposición a Aβo como la sobreexpresión de P2X2a, generan una disminución de la razón núcleo-citosol (N-C) de Fe65 y en los niveles totales de PGC-1α. Finalmente, en neuronas hipocampales expuestas a Aβo observamos un aumento en la co-localización de APP con Rab5, un marcador de endosomas tempranos, que sugiere un aumento en la endocitosis de esta proteína. Mientras que en células PC12 observamos un aumento en los niveles de Aβ luego de la sobreexpresión de P2X2R. En resumen, nuestros resultados nos permiten plantear la participación del P2X2R, y de la neurotransmisión purinérgica, como elementos relevantes en los mecanismos fisiopatológicos desencadenados por Aβo en la EA, que involucran cambios en reguladores de la función mitocondrial, y del proceso endocitico de APP, con lo cual el P2X2R, se presenta como una nueva e interesante diana farmacológica para el desarrollo de nuevas estrategias experimentales, que reduzcan la toxicidad del péptido amiloide, o frenen el ciclo de toxicidad mediado por la mayor producción de Aβ. Se requerirá avanzar en estudios adicionales, que profundicen en los mecanismos que activan la sobreexpresión de los receptores purinérgicos, y los elementos involucrados en la activación de la vía amiloidogenica.
Bases estructurales, celulares y moleculares para explicar una vía de entrada rápida de glucosa al cerebro.
(Universidad de Concepción., 2012) Martínez Acuña, Fernando Antonio; Nualart Santander, Francisco
La eminencia media se localiza en el piso del tercer ventrículo y en ella se encuentra el plexo primario del sistema portal hipotálamo-hipofisiario, que permite la transferencia de hormonas a la sangre. Este plexo primario está formado por vasos sanguíneos fenestrados, que no poseen barrera hematoencefálica, lo que le otorga una alta permeabilidad. No obstante, la difusión de metabolitos como glucosa está limitada por la existencia de una barrera denominada eminencia media- líquido cefalorraquídeo, formada por tanicitos β2. Sin embargo, la glucosa podría ser incorporada al líquido cefalorraquídeo si existiera un mecanismo de transporte específico en estas células gliales, que permita concentrar eficientemente la glucosa en el tercer ventrículo basal, mecanismo que hemos denominado “fast track”. Este transporte de glucosa sería muy importante para estimular las células gliales involucradas en el mecanismo sensor de glucosa hipotalámico (tanicitos 1). Aplicando metodologías de biología celular y molecular, hemos demostrado que en la eminencia media ocurren cambios agudos de la citoarquitectura de las células gliales o tanicitos β2, en respuesta a aumentos en la concentración de glucosa. En hiperglucemia los tanicitos β2 modifican sus procesos celulares y generan un fenómeno de “lagunización” a nivel de la eminencia media. En una segunda etapa analizamos el efecto producido por la inhibición de glucoquinasa, una enzima clave para los sistemas sensores de glucosa, en la conducta alimenticia. Demostramos que al inhibir glucoquinasa utilizando adenovirus que expresan un shRNA específico, se induce un retardo en la génesis del mecanismo de saciedad. En una tercera etapa, establecimos la localización de los transportadores de glucosa de baja afinidad GLUT2 y GLUT6 en los tanicitos β2 de la eminencia media. Además, demostramos que el aumento de la glucorraquia (glucosa en el líquido cefalorraquídeo) en el receso infundibular inducida por hiperglucemia periférica, presenta una dinámica de incremento mayor que la observada en otras regiones ventriculares, sugiriendo que existe una transferencia local de glucosa a través de la barrera eminencia media-líquido cefalorraquídeo. Finalmente, analizamos de qué manera la inhibición in vivo de los transportadores GLUT2 y/o GLUT6 (AdshGLUT2; AdshGLUT6), afecta la dinámica del transporte transcelular de glucosa y evaluamos una posible vía de transporte paracelular utilizando trazadores de barreras cerebrales (azul de toluidina y azul de Evans) y microscopía ultraestructural. Todos estos resultados sugieren la existencia de un mecanismo eficiente de transporte de glucosa desde la eminencia media al líquido cefalorraquídeo del tercer ventrículo, que en hiperglucemia impactaría una región glucosensora ejerciendo efectos rápidos en el comportamiento alimenticio.
Buscando las bases moleculares y funcionales para explicar la entrada de vitamina C al cerebro a través de los plexos coroideos.
(Universidad de Concepción., 2009) Ulloa Jofré, Viviana Angélica; Nualart Santander, Francisco
Los plexos coroideos forman la barrera sangre-LCR y las células epiteliales de los plexos sintetizan el LCR y regulan la entrada y la salida de numerosos compuestos en el SNC. La acumulación de ascorbato en el cerebro ocurre a través del cotransportador de sodio-ascorbato SVCT2, tal como quedó demostrado en los ratones knock-out para este transportador. Estos ratones presentan niveles de vitamina C prácticamente indetectables en el cerebro y mueren pocos minutos después de nacer. La expresión de SVCT2 en los plexos coroideos y estudios funcionales realizados in vivo e in vitro, sugieren que la captación de ascorbato desde el plasma es mediada por SVCT2 en la membrana basolateral de las células epiteliales de los plexos coroideos, para ser posteriormente liberado al LCR. Además, se ha demostrado que la forma oxidada de la vitamina C o ácido deshidroascórbico, corresponde a un escaso porcentaje de vitamina C circulante, y puede ser captado a través de algunas isoformas de transportadores facilitativos de hexosas, GLUTs. En esta tesis analizamos la expresión y localización de SVCT2 en los plexos coroideos normales y en distintas condiciones in vivo e in vitro y evaluamos la función de SVCT2 y GLUT1 en la incorporación de ambas formas de la vitamina C en células de plexos coroideos en cultivo. Definimos la expresión y localización de SVCT2 realizando ensayos de RT-PCR, Western blot e inmunocitoquímica en explantes de plexos coroideos de ratón, además de analizar la localización en cobayos normales y en cobayos deficientes en vitamina C. Los análisis funcionales de la incorporación de ascorbato y ácido deshidroascórbico se realizaron en células humanas de papiloma de plexos coroideos. Nuestros resultados demuestran la polarización basolateral de SVCT2 en las células epiteliales de los plexos coroideos de ratón, incluso en el desarrollo postnatal temprano. Utilizando una inyección intracerebroventricular de lentivirus,logramos sobreexpresar hSVCT2-EYFP en células epiteliales de los plexos,confirmando in vivo y en un contexto de células normales (no transformadas) la polarización basolateral de SVCT2. En las células de papiloma de plexos coroideos definimos los parámetros cinéticos para la captación de ascorbato y ácido deshidroascórbico. La incorporación de la forma oxidada de la vitamina C,se incrementa fuertemente al realizar el cocultivo de células de plexos con neutrófilos estimulados con PMA, generadores de oxidantes. Nuestros datos muestran que vitamina C puede ser incorporada en los plexos coroideos utilizando transportadores SVCT2 o GLUT1, polarizados basolateralmente.
Cambios en la expresión y función del receptor de glicina en el Núcleo Accumbens durante el envejecimiento.
(Universidad de Concepción., 2023) Konar Nié, Macarena Sofía; Aguayo Hernández, Luis
The nucleus accumbens (nAc) is a key brain structure in the reward system. The nAc receives and integrates afferent signaling fr om several brain regions. Inhibitory control is mediated by gamma aminobutyric acid receptors (GABA A ) and glycine receptors (GlyR). Reports from our laboratory demonstrated the presence of glycinergic synaptic currents, coming from a brain region not yet identified. This project aimed to determine the changes in glycinergic transmission in the nAc during aging. Two specific objectives were set: SO1: Characterize the temporary and sub cellular expression of GlyRs in the nAc of adult and aged mice, and SO2: Characterize the presence and functionality of the glycinergic input(s) that reach the nAc of adult a nd aged mice. Using Western blot, animals aged 12 and 18 months were found to show a significant reduction in the β subunit of GlyR, which allows the receptor to anchor to the synapse, and a decrease in α2 and α3 subunit mRNA using quantitative PCR. The ex pression of a Cre recombinase dependent retrograde virus in the nAc of GlyT2
Cambios en las propiedades del receptor de glicina durante el desarrollo de neuronas espinales en cultivo. Efectos celulares de la activación.
(Universidad de Concepción., 2002) Tapia Amaro, Juan Carlos; Tapia Amaro, Juan Carlos
Evidencia experimental sugiere que el neurotransmisor inhibitorio glicina puede regular el crecimiento neurítico de neuronas embrionarias. Para evaluar esta hipótesis se propuso: 1) determinar cómo la activación del receptor de glicina en neuronas inmaduras afecta el crecimiento neurítico y el Ca+2 intracelular; 2) estudiar el patrón de expresión temporal de las subunidades del Rglicina en las neuronas y 3) estudiar la permeabilidad relativa del receptor de glicina a diferentes aniones durante el desarrollo in vitro de estas neuronas. A través de técnicas inmunocitoquímicas, electrofisiológicas y fluorimétricas encontramos que: las neuronas de 5 DIV expresaron fundamentalmente Rglicina y R-GABAA pero no receptores del tipo NMDA y no-NMDA. La activación de Rglicina y R-GABAA fue responsable de la actividad sináptica y de los incrementos de Ca+2i presentes en estas neuronas. Interesantemente, la neurotransmisión glicinérgica reguló la excitabilidad de la GABAérgica a través de un mecanismo de corto circuito neuronal (disminución de la Rm). La incubación crónica con glicina (100 μM, 48 hr) promovió el crecimiento neurítico de las neuronas, el que fue resistente a estricnina. Registros electrofisiológicos mostraron que la desactivación ó la inhibición del Rglicina son responsables del efecto trófico. Coaplicación de TTX, nimodipino y bicuculina inhibieron este efecto mientras que APV y CNQX no tuvieron efecto. Por lo tanto, postulamos que la actividad sináptica GABAérgica, regulada por la glicinérgica, es responsable del crecimiento neurítico en neuronas espinales de 5 DIV. Por otro lado, por medio de RT-PCR en neuronas espinales en cultivo encontramos que las subunidades del Rglicina presentaron un patrón de expresión temporal. La subunidad 2 fue expresada principalmente en neuronas de 5-7 DIV y no en neuronas >10 DIV. La mayor expresión de la subunidad 1 fue encontrada en neuronas de >10 DIV. La subunidad  presentó un patrón similar al de la subunidad 1, mayor en neuronas de 10-14 y 18-21 DIV que en las de 5-7 DIV. En resumen, postulamos que el Rglicina en neuronas de 5-7 DIV está formado por subunidades  mientras que en neuronas 10-14 por las subunidades . Mostramos también en esta tesis que: 1) el Eglicina varió de acuerdo a la actividad del Cl- extracelular en todas las etapas del desarrollo in vitro; 2) la permeabilidad de Rglicina a HCO3- relativa a Cl- fue de 0.10 en todas las etapas del desarrollo 3) y el rango de permeabilidades relativas SCN->NO3->I->Br->Cl->propionato->acetato->HCO3- no fue afectado por el desarrollo in vitro; 4) furosemida, inhibidor de KCC2, aumentó el Eglicina (~+20 mV) en neuronas 14 DIV y 5) el recambio del HEPES por HCO3- no afectó el Eglicina en neuronas inmaduras. De acuerdo con los resultados, postulamos que KCC2, y no cambios en la permeabilidad a HCO3-, sería responsable de la depolarización inducida por Rglicina en neuronas espinales embrionarias. En conclusión, postulamos que la neurotransmisión glicinérgica, la primera en ser expresada en neuronas espinales en cultivo, regula la excitabilidad y el crecimiento neurítico en neuronas de 5 DIV.

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