Análisis del papel funcional y estructural de residuos de cisteína del transportador de ácido ascórbico SVCT2.
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Date
2014
Authors
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Publisher
Universidad de Concepción.
Abstract
SVCT2 es un transportador de ácido ascórbico de expresión ubicua importante para la mantención de niveles normales de ácido ascórbico en tejidos. Funcionalmente, SVCT2
posee una Km de transporte de ácido ascórbico cercana a 20 μM y un mecanismo de cotransporte de 2 iones sodio por molécula de ácido ascórbico. El ión sodio activa cooperativamente el transporte de ácido ascórbico a través de una disminución de la Km de
transporte desde ≈2 mM en ausencia de ión sodio, hasta ≈20 μM en presencia de 135 mM
ión sodio. El modelo 3D predicho de SVCT2 sugiere un plegamiento de 14 segmentos
transmembrana (STM) agrupados en tres grupos. El dominio central está formado por los
STM 1, 2, 3, 8, 9 y 10 y contiene los sitios de unión a ácido ascórbico y iones sodio. El
dominio de compuerta está formado por los STM 6, 7, 13 y 14 y actúa como un filtro de
selectividad. Los STM 4, 5, 11 y 12 actúan como STM de acoplamiento entre los dominios
de compuerta y el canal central. SVCT2 posee 14 residuos de cisteína presentes en los tres grupos que definen la
topología del transportador en la membrana celular. En esta tesis propusimos establecer la
importancia estructural-funcional de los residuos de cisteína de SVCT2. El modelo de
estudio correspondió a células HEK-293 SVCT2 fusionado a la proteína fluorescente verde
(SVCT2-GFP). Analizamos el efecto de agente reductor DTT y del tratamiento con los
alquilantes PCMB y NEM sobre el transporte de ácido ascórbico mediado por SVCT2.
Luego, reemplazamos sistemáticamente cada residuo de cisteína por serina generando
mutantes simples, dobles, triples y un transportador sin residuos de cisteína (SVCT2 cysless).
Además, se prepararon 5 grupos de mutantes múltiples, reemplazando los residuos de
cisteína presentes en el dominio central, dominio de compuerta, STM de acoplamiento, en
lazos exofaciales y lazos endofaciales en SVCT2. Cada mutante fue examinado por su localización subcelular, propiedades funcionales y sensibilidad al tratamiento con PCMB y NEM. Los resultados obtenidos indican que el tratamiento con DTT no afecta el transporte de ácido ascórbico, sugiriendo que la actividad de SVCT2 no requiere de un estado oxidado a nivel de cadenas laterales de residuos de cisteínas. Por otro lado, el tratamiento con una concentración PCMB y NEM equivalente a cada IC50, produce una disminución de la Vmax de transporte sin alterar la Km para ácido ascórbico ni la activación cooperativa por el Na+, probablemente a través de la inactivación completa del transportador.
Los resultados de mutagénesis sitio-dirigida de residuos de cisteína, revelaron que la
sustitución individual de 9 de los 14 residuos de cisteína no afectan el nivel de expresión,
localización subcelular ni sus propiedades de transporte de ácido ascórbico. SVCT2 posee 5
residuos de cisteína (113, 129, 160, 187 y 401) importantes para mantener la Km de
transporte para ácido ascórbico, presentes en los STM y lazos conectores del dominio central
del transportador, con residuos de cisteína en el STM1, STM8, lazo exofacial 1-2, lazo
exofacial 3-4 y lazo endofacial 2-3. El reemplazo de residuos de cisteína de la mitad carboxilo-terminal está localizado en la membrana plasmática y posee una muy baja actividad de transporte. SVCT2 mutante de la mitad amino-terminal, presenta una localización intracelular. SVCT2 cys-less presenta bajos nivel de expresión y es se localiza a nivel de retículo endoplásmico. Basados en los resultados obtenidos en esta tesis, proponemos que los residuos de cisteína de SVCT2 participan en al menos dos aspectos de importancia funcional-estructural. Primero, el proceso de plegamiento y tráfico hacia la membrana plasmática es altamente dependiente de la presencia de residuos de cisteína de SVCT2. Segundo, los residuos de cisteínas de los STM del dominio central, son importantes en modular aspectos específicos de las propiedades funcionales de SVCT2, principalmente la Km para ácido ascórbico sin alterar la cooperatividad por el Na+.
Description
Tesis para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas, Mención Biología Celular y Molecular.
Keywords
Vitamina C - Propiedades Biológicas, Vitamina C - Oxidación, Vitamina C - Pruebas, Transporte Biológico - Investigaciones, Biología Molecular, Micronutrientes - Análisis.