Desarrollo y caracterización de un candidato vacunal recombinante contra tuberculosis bovina

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dc.contributor.advisorSánchez Ramos, Olivertoes
dc.contributor.authorZúñiga Sánchez, Roxana Valeskaes
dc.date.accessioned2025-06-18T16:18:53Z
dc.date.available2025-06-18T16:18:53Z
dc.date.issued2023
dc.descriptionTesis presentada para optar al grado de Doctora en Ciencias Veterinariases
dc.description.abstractLa tuberculosis bovina (bTB) es una enfermedad causada por Mycobacterium bovis que afecta al ganado generando enormes pérdidas en la industria pecuaria en Chile y el mundo. La inmunización de los animales contra la enfermedad no está permitida debido a que vacunas vivas atenuadas han demostrado una baja protección e interfieren con el diagnóstico de la tuberculina. Debido a esto, el control de bTB se basa fundamentalmente en diagnosticar a los animales con la prueba de tuberculina y la posterior eliminación de los individuos contagiados. No obstante, estas medidas han demostrado ser insuficientes en controlar y erradicar la enfermedad por lo que se requiere de una vacuna efectiva que proteja al ganado y que no interfiera con el diagnóstico. En este trabajo se propuso desarrollar y caracterizar una vacuna de subunidades recombinante contra M. bovis, con capacidad de inducir una respuesta inmune protectora en bovinos, y que no interfiera con la prueba de tuberculina. Para esto se diseñaron las moléculas quiméricas qTbA-16MRA y qTbA-85ESAT conformada cada una por dos antígenos de la bacteria AcR-Rv2660c y Ag85b-ESAT6, respectivamente, y se produjeron por vía recombinante de forma insoluble en E.coli. Con las quimeras insolubles se prepararon tres formulaciones vacunales para inmunizar caprinos y bovinos. Dos de las formulaciones incluyeron un adyuvante molecular para potenciar la respuesta inducida por los antígenos (DIVA, DIVA IFNα y DIVATNFα). Además, en terneros se incluyó un grupo experimental al que se le administró la vacuna BCG. A partir de los ensayos de inmunización se caracterizó la respuesta inmune humoral y celular inducida por la vacunación de ambas especies animales, y se evaluó la interferencia de las distintas formulaciones con la prueba de tuberculina. Luego, los terneros se retaron por vía intranodal con una cepa atenuada de M. Bovis BCG Danish 1331 y se evaluó la capacidad protectora de las formulaciones vacunales. Los resultados obtenidos demostraron que todas las formulaciones DIVA indujeron respuesta de anticuerpos tanto en caprinos como en bovinos, sin embargo, la DIVA IFNα indujo los mayores títulos de anticuerpos en terneros. Tanto en cabras como en terneros se observó que la quimera que indujo los mayores títulos de anticuerpos fue qTbA-16MRA. En los terneros esta respuesta fue significativamente superior. Por otra parte, se obtuvo que la estimulación conjunta de las células con los antígenos quiméricos indujo una respuesta de linfocitos T de memoria CD4+CD44+ y CD8+CD44+. Al contrastar la respuesta inducida en los diferentes grupos contra el placebo, se evidenció que los terneros inmunizados con BCG y DIVA IFNα exhibieron porcentajes de CD4+CD44+ estadísticamente mayores. Todos los grupos inmunizados obtuvieron concentraciones significativas de IFNγ, donde los animales que recibieron la vacuna BCG y DIVA IFNα fueron quienes alcanzaron los valores más altos. Se encontraron diferencias estadísticas entre BCG y el resto de los grupos inmunizados, siendo muy superior la producción de TNFα en los animales vacunados con BCG (p < 0.001). Por otro lado, los grupos BCG y DIVA IFNα fueron los únicos que mostraron concentraciones de IL-17A significativas. También, se detectaron diferencias estadísticas entre los terneros vacunados con BCG y DIVA IFNα (p < 0.05). Los resultados de interferencia mostraron que en los grupos DIVA y DIVA IFNα todos los animales fueron negativos al diagnóstico y que del grupo DIVA TNFα uno de los cinco terneros fue reaccionante al bPPD de la tuberculina. Los resultados de protección mostraron que el número de copias del gen MPB70 obtenido tanto en el grupo de terneros vacunados con BCG como los que fueron inmunizados con DIVA IFNα mostraron diferencias estadísticamente significativas (p< 0.001)en comparación con el grupo placebo.es
dc.description.abstractBovine tuberculosis (bTB) is a disease caused by Mycobacterium bovis that affects cattle, generating enormous losses in the livestock industry in Chile and the world. Immunization of animals against the disease is not allowed because live attenuated vaccines have shown low protection and interfere with tuberculin diagnosis. Because of this, bTB control relies primarily on diagnosing animals with the tuberculin test and subsequent culling of infected individuals. However, these measures have proven to be insufficient to control and eradicate the disease, so an effective vaccine that protects cattle and does not interfere with diagnosis is required. In this work we proposed to develop and characterize a recombinant subunit vaccine against M. bovis, with the capacity to induce a protective immune response in cattle, and that does not interfere with the tuberculin test. For this purpose, the chimeric molecules qTbA-16MRA and qTbA-85ESAT, each one conformed by two antigens of the bacterium AcR-Rv2660c and Ag85b-ESAT6, respectively, were designed and produced by the recombinant route in an insoluble form in E.coli. Three vaccine formulations were prepared with the insoluble chimeras to immunize goats and cattle. Two of the formulations included a molecular adjuvant to enhance the antigen-induced response (DIVA, DIVA IFNα and DIVA TNFα). In addition, an experimental group was included in calves that were administered BCG vaccine. From the immunization assays, the humoral and cellular immune response induced by vaccination of both animal species was characterized, and the interference of the different formulations with the tuberculin test was evaluated. Then, calves were challenged intranodally with an attenuated strain of M. Bovis BCG Danish 1331 and the protective capacity of the vaccine formulations was evaluated. The results obtained showed that all DIVA formulations induced antibody response in both goats and cattle, however, DIVA IFNα induced the highest antibody titers in calves. In both goats and calves, it was observed that the chimera that induced the highest antibody titers was qTbA-16MRA. In calves this response was significantly higher. On the other hand, it was obtained that the joint stimulation of the cells with the chimeric antigens induced a response of CD4+CD44+ and CD8+CD44+ memory T lymphocytes. When contrasting the response induced in the different groups against placebo, it was evident that calves immunized with BCG and DIVA IFNα exhibited statistically higher CD4+CD44+ percentages. All immunized groups obtained significant IFNγ concentrations, where animals receiving BCG and DIVA IFNα vaccine achieved the highest values. Statistical differences were found between BCG and the rest of the immunized groups, with TNFα production being much higher in animals vaccinated with BCG (p < 0.001). On the other hand, the BCG and DIVA IFNα groups were the only ones that showed significant IL-17A concentrations. Also, statistical differences were detected between calves vaccinated with BCG and DIVA IFNα (p < 0.05). Interference results showed that in the DIVA and DIVA IFNα groups all animals were negative at diagnosis and that of the DIVA TNFα group one of the five calves was reactive to tuberculin bPPD. The protection results showed that the MPB70 gene copy number obtained in both the BCG vaccinated calf group and those immunized with DIVA IFNα showed statistically significant differences (p< 0.001)compared to the placebo group. From this work it was concluded that immunization of animals with the chimeric qTbA-16MRA and qTbA-85ESAT antigens generates high IgG antibody titers, mainly induced by the qTbA-16MRA chimera. Vaccination with the antigens induces a memory cell response mediated by CD4+CD44+ T lymphocytes and a Th1 cell response. On the other hand, the incorporation of IFNα in the vaccine formulation based on qTbA-16MRA and qTbA-85ESAT antigens potentiates the cellular response produced by these antigens because it induces a Th17 response. In addition, preliminarily, it was shown that vaccination with the chimeric antigens would not induce a cross-response against the tuberculin test. Finally, the chimeric antigens alone do not induce protection against a challenge with the attenuated M. bovis BCG Danish 133 strain, however, the incorporation of IFNα in the formulation with the chimeras confers protection in calves.en
dc.description.campusChillánes
dc.description.departamentoDepartamento de Farmacologíaes
dc.description.facultadFacultad de Ciencias Veterinariases
dc.description.sponsorshipBecas de Doctorado Nacional, Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo ANID
dc.identifier.urihttps://repositorio.udec.cl/handle/11594/12735
dc.language.isoeses
dc.publisherUniversidad de Concepciónes
dc.rightsCC BY-NC-ND 4.0 DEED Attribution-NonCommercial-NoDerivs 4.0 Internationalen
dc.rights.urihttps://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
dc.subjectTuberculosis bovina - Chilees
dc.subjectEnfermedades de los animaleses
dc.subjectZoonosises
dc.titleDesarrollo y caracterización de un candidato vacunal recombinante contra tuberculosis bovinaes
dc.typeThesisen

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