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Distribución de garrapatas duras (acari: ixodoidea) y detección molecular de bacterias del género Borrelia, Ehrlichia y Rickettsia provenientes de diferentes ecorregiones de Chile
(Universidad de Concepción, 2023) Troncoso Toro, Ignacio Eduardo
Las enfermedades transmitidas por vectores (CVBD), y especialmente por garrapatas, han aumentado a un ritmo desconocido en los últimos años, generando repercusión en la salud pública y animal. En vista de la escasa información epidemiológica sobre la presencia de microorganismos en garrapatas duras en Chile, el objetivo general de esta propuesta fue evaluar la presencia de bacterias Ehrlichia, Borrelia y Rickettsia asociadas a garrapatas duras (Acari: Ixodoidea) provenientes de diferentes ecorregiones de Chile, para responder a la hipótesis que la presencia de bacterias de los géneros Ehrlichia, Borrelia y/o Rickettsia se asocia a zonas con mayor riqueza de garrapatas, esperando encontrar una mayor presencia de estas bacterias en las ecorregiones con climas templados y fríos en Chile. Para esto, se recolectaron 624 garrapatas provenientes de siete ecorregiones de Chile, las cuales se identificaron taxonómica y molecularmente usando un fragmento parcial (≈460-pb) del gen ARNr 16S mitocondrial. Luego, en cada garrapata, se buscó mediante técnicas moleculares la presencia de bacterias del género Borrelia (Spirochaetaceae), Rickettsia (Rickettsiaceae) y Ehrlichia Anaplasmataceae), empleando la reacción en cadena de la polimerasa convencional (PCR) con los genes flaB, gltA y ARNr 16S como screening, respectivamente, para luego amplificar los genes ospC, p66 e IGS para Borrelia, dsb y gltA para Ehrlichia, y ompA, ompB y htrA para Rickettsia. Del total de garrapatas, en 108 (18,68%) se obtuvo ADN de alguna de estas bacterias, siendo la presencia para los géneros Ehrlichia del 0,85%, Rickettsia del 17,5% y para Borrelia del 0,34%. Para Borrelia se efectuó confirmación de su identidad en dos garrapatas positivas (Ixodes abrocomae) utilizando los genes p66, IGS y ospC, los cuales, según BLAST, fueron 93% (611/657 pb), 84% (486/577 pb) y 78,4% (259/329 pb) idénticas a la secuencia de la genoespecie Borrelia chilensis VA1. En el caso de Rickettsia, del total de 103 muestras positivas al gen gltA empleado como screening, solo 10 muestras fueron secuenciadas (9,7%) obtenidas de Amblyomma tigrinum (80%) y de Rhipicephalus sanguineus (20%). Los haplotipos recuperados de A. tigrinum y R. sanguineus formaron un clado con secuencias de Candidatus Rickettsia andaenae obtenidas de Ixodes boliviensis (Perú), Amblyomma parvum (Brasil) y Amblyomma triste (Chile). En el caso de los genes htrA, ompA y ompB, según BLAST, fueron 100% idénticas a secuencias de Ca. R. andaenae obtenida de A. parvum en Brasil (KY402193; MK522488.1; KF030933.1). Para Ehrlichia, 12 ejemplares de tres especies de garrapatas (Ixodes uriae, Ixodes auritulus e Ixodes taglei) fueron positivas al gen ARNr 16S empleado como screening, de estas, 2 (16,6%) obtenidas desde I. uriae (1 ninfa, 1 hembra) fueron secuenciadas, donde la secuencia obtenida de la ninfa fue 100% (306 pb/306 pb) idéntica a Ehrlichia spp. aislada en estudios previos de I. uriae en Chile (MK049840.1). Mientras que, la otra secuencia fue 99% (331 pb/335 pb) idéntica a Candidatus Midichloria mitochondrii obtenida de Ixodes ricinus en Francia (KU559921.1). Para el gen dsb la secuencia fue 94% (209 pb/307 pb) idéntica a una secuencia de Ehrlichia spp. obtenida de bazo de pingüino magallánico (Spheniscus magellanicus) de la Isla Magdalena (MK049838.1), y para el gen gltA fue del 86% (526 pb/611 pb) idénticas a una secuencia de Ehrlichia muris obtenida de bazo de un roedor silvestre de Japón (CP006917). Respecto a la ocurrencia de ADN de bacterias a través de las ecorregiones analizadas, la mayor ocurrencia para bacterias se registró en Puna (85,7%), seguida de Coquimbo (33,5%), Maule (24%), Bosque Valdiviano (23%), Atacama (16,2%), Patagonia central (1,54%) y Santiago (0%), además se evidenció asociación entre la presencia de Rickettsia y Ehrlichia con las ecorregiones. En relación con las variables bioclimáticas, las variables seleccionadas mediante el análisis de componentes principales (PCA) fueron: la temperatura promedio anual (Bio 1), temperatura máxima del periodo más caliente (Bio 5), temperatura mínima del periodo más frio (Bio 6), precipitación anual, rango medio diurno (Bio 2), Precipitación anual (mm) (Bio 12) y Precipitación en el trimestre más caluroso (mm) (Bio 18). Mientras que, al análisis de regresión logística binaria para género de bacteria y de garrapata recolectada, solo se evidenció significancia estadística para el género Ixodes, para las variables Bio1, Bio2, Bio6 y Bio15 (Estacionalidad de la precipitación (Coeficiente de variación). Finalmente, al evaluar la correlación entre la riqueza de garrapatas y el gradiente latitudinal, se obtuvo una correlación baja y no significativa entre estas variables. En el presente estudio, se logró detectar ADN de bacterias del género Borrelia, Ehrlichia y Rickettsia en garrapatas Ixodidae, existiendo asociación estadística entre la mayor ocurrencia de bacterias en las ecorregiones de la zona norte que en la sur.
Modulación de la comunicación Embrio-Materna en Bovinos, mediante mecanismos alternativos y complementarios a Interferon Tau
(Universidad de Concepción, 2023) Aguilera González, Constanza Javiera; Rodríguez Álvarez, Lleretny
La comunicación embrio-materna se establece desde los primeros estadios del desarrollo embrionario y es esencial para la implantación. En bovinos, la molécula clave para el reconocimiento de la gestación es interferón tau (IFNT), la cual es secretada por el conceptus al día 16 de la gestación. Sin embargo, se ha determinado que el embrión en estadio de blastocisto es capaz de producir IFNT. Por otra parte, el embrión es capaz de secretar vesículas extracelulares (EVs) las cuales, se ha descubierto recientemente, juegan un papel importante en la comunicación que establece el embrión con el endometrio. Esto debido a que las EVs son nano partículas que poseen como cargo moléculas con actividad biológica. Recientemente, se ha determinado que el embrión en estadios tempranos de desarrollo, es capaz de inducir una respuesta diferente en las células endometriales epiteliales (bEECs) a través de sus EVs según el tipo de producción embrionaria (in vivo, in vitro). Asimismo, se demostró que las EVs maternas, también presentan diferencias en su cargo al ser obtenidas mediante cultivo de celular (producción in vitro) en comparación a su obtención bajo condiciones in vivo. El objetivo de este trabajo fue determinar, si las condiciones de producción in vitro Modifican la comunicación embrio-materna establecida a través de las EVs. Para ello se buscó primero determinar, si las EVs secretadas por embriones bovinos producidos in vivo e in vitro durante el periodo pre-implantatorio inducen modificaciones transcriptomicas, activando la señalización de IFNT en las bEECs. Para ello, se evaluó si durante el desarrollo embrionario temprano (blastulación, días 5-7 de desarrollo), las EVs de los embriones producidos in vitro (EVs-IVP) e in vivo (EVs-IVV), inducían una respuesta diferente a nivel transcriptómico en las bEECs. Junto con ello, se buscó determinar el efecto de las EVs provenientes de embriones en estadio más avanzado de desarrollo (día 7-9) producidos tanto in vitro como in vivo, en la expresión genes vinculados a función endometrial y señalización de IFNT en las bEECs. Parte del objetivo de este trabajo fue también determinar el efecto del sistema de producción in vitro en las EVs provenientes de células endometriales. Para ello, se evaluó el efecto de EVs provenientes de fluido uterino (EV-UF) y de cultivo celular (EVC) en el desarrollo pre-implantatorio (Día 5-9 de desarrollo) de embriones bovinos producidos in vitro. Para obtener las EVs embrionarias del periodo de blastulación (5-7 de desarrollo), mórulas bovinas producidas in vitro e in vivo fueron cultivadas individualmente por 48 horas para posteriormente aislar desde el medio de cultivo las EVs embrionarias. Una vez obtenidas, las EVs fueron teñidas con PKH67 y añadidas al medio de cultivo de bEECs para evaluar su internalización. Posteriormente se evaluó el perfil transcriptomico de las bEECs mediante secuenciación del ARN mensajero. Tanto las EVs-IVV como las EVs-IVP indujeron la expresión de genes clásicos y no clásicos inducidos por interferón (ISGs) y otras vías de señalización vinculadas a función endometrial en bEECs. Un número mayor de genes diferencialmente expresados fueron inducidos por EVs-IVP (3552) en comparación a las EVs-IVV (1838). En el análisis de ontología de genes, se demostró que las EVs-IVP/IVV inducen una regulación a la alza de la vía de señalización extracelular de exosomas, respuesta de las células ante estímulos y procesos de modificación de proteínas. Respecto al efecto en las bEECs de las EVs-IVP/IVV provenientes de embriones de día 7-9 de desarrollo, blastocistos expandidos fueron cultivados individualmente por 48 horas para el aislamiento de sus EVs. Posteriormente se evaluó la internalización de las EVs embrionarias por parte de las bEECs para luego determinar la expresión génica mediante RT-qPCR. Se determinó que los genes no clásicos inducidos por IFNT lograron ser activados en las bEECs únicamente por las EVs-IVP. Por último, en relación al efecto de las EVs provenientes de EVC y EV-UF en el desarrollo embrionario, las EVC lograron inducir una activación de genes viculados a pluripotecia, mientras que las EV- UF indujeron una mayor expresión de IFNT por parte de los embriones bovinos además de un incremento sostenido durante el desarrollo del diámetro y tendencia a mayor cantidad de blastocistos expandidos y protruidos.
Evaluación del orujo de uva país como modulador de la fermentación ruminal en dietas para rumiantes.
(Universidad de Concepción, 2023) Suescun Ospina, Sandra Tatiana; Ávila Stagno, Jorge
La producción animal es esencial para satisfacer las demandas de proteína de alta calidad de una población creciente. Sin embargo, las emisiones de metano (CH4) y el óxido nitroso (N2O) generadas en varias etapas del proceso productivo, reducen la eficiencia energética y son perjudiciales para el medio ambiente. Los subproductos agroindustriales como el orujo de uva son una fuente alternativa de fibra, proteínas y lípidos de alta digestibilidad con potencial para la alimentación animal, además de ser fuente de compuestos bioactivos, como polifenoles y grasas, que pueden ejercer efectos positivos en el rendimiento productivo, la composición nutricional de los productos finales, la excreción de nitrógeno y las emisiones de CH4. Se realizaron seis estudios con el objetivo de evaluar los efectos de uso del OU País y de un extracto polifenólico estandarizado de orujo de uva (OU) País, en dietas para rumiantes utilizando los sistemas de fermentación in vitro discontinuo (batch) y semicontinuo (Rusitec). El primer estudio evaluó los efectos de las condiciones de secado (liofilización y secado en horno a 40ºC durante 72 h y 60ºC durante 48 h) sobre el contenido de compuestos bioactivos, la capacidad antioxidante y la composición química del OU País. Posteriormente se utilizó un sistema de fermentación in vitro (batch) para evaluar los parámetros de fermentación ruminal y el potencial de mitigación de CH4 del OU País bajo distintas condiciones de secado. El secado en horno a 60ºC durante 48 h de OU País retuvo el mayor contenido de proantocianidinas (68.9 mg de catequina equivalente/g de materia seca [MS]), y menores contenidos de cenizas, extracto etéreo y carbohidratos no fibrosos. Las muestras secadas en estas condiciones generaron una menor producción y rendimiento de CH4, indicando que estas condiciones de secado permiten conservar el valor nutricional del OU País (contenidos de compuestos fenólicos, grasa y fibra), prolongar su vida útil y, su uso como ingrediente en la alimentación de rumiantes. En el segundo estudio se determinaron las condiciones óptimas de extracción asistida por microondas (EAM) para obtener un extracto polifenólico estandarizado de OU País. Estableciendo el rendimiento de extracción, contenidos de polifenoles totales (CPT), contenidos de proantocianidinas (PA) y capacidad antioxidante, para deteerminar la eficiencia del proceso de extracción. En comparación con la extracción sólido-líquido convencional, la EAM incrementó en 59% los CPT, en 60% los PA y en 182% la capacidad antioxidante de los extractos obtenidos. Los principales compuestos fenólicos primarios del extracto de OU País, identificados por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), fueron ácido gálico, ácido cafeico, ácido cumárico, quercetina, naringina, kaempferol, catequina y epicatequina. El perfil lípidico del OU País esta constituido por 17.4% de ácidos grasos saturados y 82.3% de ácidos grasos insaturados, de los cuales el ácido graso linoleico el más abundante (60.4% del total). En el tercer estudio se evaluaron los efectos de la inclusión de OU País a diferentes concentraciones (0, 10%, 20% MS) en dietas para rumiantes altas (AF) y bajas en forraje (BF) sobre la producción de CH4 y los parámetros de fermentación ruminal en un cultivo in vitro tipo batch. La inclusión de OU al 10% y 20% MS redujo las concentraciones de nitrógeno amoniacal en 48% y 58% respectivamente sin diferencias entre el tipo de dieta. Se registró una reducción el porcentaje de CH4 en gas, las concentraciones de CH4 por materia seca (MS) desaparecida del 14%, por la inclusión de OU al 20% MS, aunque este nivel de inclusión generó una reducción en las concentraciones de ácidos grasos volátiles (AGV) en los dos tipos de dieta. Estos resultados indican que la sustitución parcial de las fuentes fibrosas por OU País seco, hasta un 20% MS en dietas altas y bajas en forraje tiene el potencial de reducir la producción de nitrógeno amoniacal y la producción y el rendimiento de CH4, sin embargo, es esperable una reducción de la desparición in vitro de la MS (DIVMS) cuando sustituye fuentes forrajeras de mayor calidad. El cuarto estudio evaluó los efectos de la inclusión de OU País al 20% MS en dietas para rumiantes altas (AF) y bajas (BF) en forraje, sobre los parámetros de fermentación ruminal, desaparición de nutrientes, producción de CH4 y las poblaciones de metanógenos, hongos y principales bacterias fibrolíticas en un sistema de fermentación Rusitec. En este ensayo se usó OU País para sustituir parcialmente el heno mixto en la dieta AF, y totalmente el ensilaje de maíz en la dieta BF. Los resultados de este estudio indican que la inclusión de OU País 20% MS puede reducir la degradación de la proteína, la producción de nitrógeno amoniacal y las emisiones de CH4, en dietas altas en forraje sin comprometer la digestión de nutrientes, pero su inclusión en dietas bajas en forraje puede reducir la DIVMS y la desaparición de fibra, por efectos sobre las poblaciones fibrolíticas presentes en el cultivo. Este estudio permitió determinar que la inclusión de OU País reduce las poblaciones de metanógenos presentes en las fracciones sólidas y líquidas de cultivo y modifica las poblaciones de microorganismos fibroliticos sin afectar su funcionalidad. El quinto estudio evaluó los efectos de dosis crecientes (0, 0.7, 1.4 y 2.1% MS) de un extracto polifenólico estandarizado de orujo de uva País (EOU) sobre los parámetros de fermentación ruminal, desaparición de nutrientes, producción de CH4 y las poblaciones de metanógenos, hongos y principales bacterias fibrolíticas de una dieta alta en forraje (AF) en un sistema de fermentación semicontinuo Rusitec. La inclusión del EOU a la dieta no afectó la DIVMS, la producción de gas, la producción total de AGV, o la producción de ácido acético, pero incrementó la desaparición in vitro de la fibra detergente neutro (FDN), y redujo la desaparición in vitro de la proteína cruda (PC), la producción diaria de nitrógeno amoniacal (N-NH3) y la proporción molar de los ácidos grasos de cadena ramificada (AGCR; iso-valerato + iso-butirato). La inclusión de EOU hasta 2.1% MS en una dieta AF redujo la producción y el rendimiento de CH4 hasta un 30%, redujo las poblaciones de metanógenos totales y las poblaciones de Fibrobacter succinogenes, una de las principales bacterias celulolíticas del rumen, sin embargo, las poblaciones de Ruminococcus albus, Ruminococcus flavefaciens y de hongos se incrementaron por efecto del EOU. El sexto estudio evaluó los efectos de un extracto polifenólico de OU País solo (2.1% MS) o en combinación con aceite de OU en dosis crecientes (2.5% y 5% MS) en una dieta AF sobre los parámetros de fermentación, la producción de CH4 y las poblaciones microbianas, en condiciones in vitro en un sistema de fermentación tipo batch. La inclusión de aceite de OU redujo la DIVMS, pero no las concentraciones de AGV totales, e incrementó en 18% la proporción molar de propionato. Una reducción en la concentración de N-NH3 en 29% y las concentraciones molares de AGCR en 18% por efecto del extracto de OU, pero no hubo efectos por el aceite de OU. La producción de CH4 fue reducida en 31% y el rendimiento de CH4 en 34% por efecto de la interacción ente el extracto de OU y el aceite de OU cuando se evaluó la dosis máxima de aceite de OU (5% MS). Las poblaciones de metanógenos fueron reducidas por la interacción entre el extracto de OU y el aceite de OU. Las poblaciones de Butyribvibrio fibrisolvens se incrementaron por efecto de la interacción entre el extracto de OU y del aceite de OU. De acuerdo con estos resultados es posible concluir que el extracto polifenólico de OU País posee un mayor potencial antimetanogénico que el aceite de OU o su combinación, además no afecta la fermentación ruminal, y posee un gran potencial para reducir la proteolisis ruminal. Los resultados indican que el secado en horno a 60°C durante 48 horas permite conservar el valor nutricional del OU País (compuestos fenólicos, grasa y fibra), prolongar su vida útil y su uso como ingrediente en dietas para rumiantes. El OU País puede ser incluido en dietas de rumiantes en sustitución parcial de fuentes forrajeras de calidad media, sin afectar la fermentación ruminal, y con efectos positivos como la reducción en la producción de N-NH3 y la producción de CH4 por MS incubada y desaparecida. Su inclusión modifica la estructura de las poblaciones microbianas del rumen, sin perjudicar la diversidad microbiana, la DIVMS, o la producción de gas. Estos resultados indican que los efectos del OU País y su extracto polifenólico sobre la producción y rendimiento de CH4 son resultado de un efecto directo de los polifenoles y los taninos condensados (TC), así como del aceite de OU País sobre los microorganismos involucrados en la metanogénesis.
Efectos de la respuesta inflamatoria aguda inducida por el lipopolisacárido de Escherichia coli O128:B12 sobre la disposición plasmática y distribución tisular de florfenicol y florfenicol amina en conejos y ovinos
(Universidad de Concepción, 2023) Cazanga Reyes, Victoria Matilde; Pérez Fernández, Rubén
Las infecciones bacterianas constituyen una de las principales causas de pérdidas económicas en los sistemas ganaderos, por lo que el uso de antibacterianos representa una de las alternativas más frecuentemente utilizadas para el tratamiento y control de estas enfermedades. Florfenicol (FFC) es un antibacteriano de uso veterinario que se utiliza principalmente en el control de infecciones respiratorias tanto en rumiantes como monogástricos y es posible de ser utilizado en conejos. La farmacocinética de FFC ha sido ampliamente estudiada principalmente en animales sanos, sin embargo, se desconoce el efecto de la respuesta inflamatoria aguda (RIA) inducida por sepsis sobre la disposición plasmática y distribución tisular de este antimicrobiano. Asimismo, se desconoce el efecto de la RIA sobre las concentraciones de su principal metabolito, florfenicol amina (FFC-a). Considerando que comúnmente este antibiótico será aplicado a animales que cursan con alguna patología infecciosa o estado inflamatorio, es de importancia conocer cómo influye esta condición sobre su comportamiento farmacocinético. Antecedentes experimentales han demostrado que la RIA inducida por agentes infecciosos puede alterar la farmacocinética y modificar la eficacia de los fármacos o potenciar su toxicidad en los animales. Estas alteraciones son causadas por la liberación de citoquinas proinflamatorias que además de generar un estado febril, producen modificaciones en los procesos de absorción, distribución y eliminación de los fármacos. La administración de lipopolisacárido (LPS) de Escherichia coli (E. coli) ha sido un modelo ampliamente utilizado para inducir en forma experimental una RIA, con el propósito de estudiar los cambios causados por la infección sobre la farmacocinética de antimicrobianos y otros fármacos, ya que permite replicar en los animales la respuesta inflamatoria a la infección. Se realizó el presente estudio con el objetivo de determinar el efecto de la RIA inducida por LPS de E. coli sobre la disposición plasmática y distribución tisular de FFC y FFC-a en dos modelos animales de inflamación aguda sistémica: conejos y ovinos, como representativos de especie monogástrica y rumiante, respectivamente. Además, se estudió si existen diferencias de especie en la disposición plasmática y distribución tisular de FFC y FFC-a posterior a la administración de FFC en animales sanos. También, se evaluó, si existen diferencias de especie sobre los cambios en la disposición plasmática de FFC y FFC-a inducidos por la RIA en respuesta a la administración de LPS. Se utilizaron conejos de raza Neozelandés y ovinos de raza Suffolk Down que fueron distribuidos en grupos de cinco animales cada uno y asignados a grupo control y grupo tratado con LPS de E. coli. Se administraron tres dosis de 1 μg/kg LPS a las 0, 8 y 23 h 15 minutos (Grupo LPS) o solución salina (SS) en igual volumen y frecuencia de administración (Grupo control). Se extrajeron muestras sanguíneas para análisis de hemograma, perfil bioquímico y los marcadores de inflamación interleuquina 6 (IL-6) y proteína C reactiva (PCR). En los animales tratados con LPS se observaron incrementos significativos en las concentraciones de IL-6 y PCR, cambios en el hemograma y perfil bioquímico sanguíneo, modificaciones que estuvieron asociadas a un proceso febril. Estos cambios demuestran la eficacia del modelo de administración de LPS para induciruna RIA en los animales del estudio. Otros grupos de conejos y ovinos fueron tratados con 3 dosis de LPS o solución salina (control) previo a la administración de 20 mg/kg de FFC y se realizaron muestreos sanguíneos seriados para análisis farmacocinético. Se observaron cambios significativos en la farmacocinética de FFC y FFC-a respecto de los valores observados en animales control, los cuales estuvieron asociados a disminuciones significativas del clearance de FFC, acompañados de aumentos en la vida media de eliminación (t1/2el), área bajo la curva (AUC) y tiempo medio de residencia (TMR). Además, se observaron disminuciones significativas en las concentraciones de FFC-a asociadas a disminuciones en los promedios de AUC y en la proporción de metabolito/fármaco activo (MR%). Con el objetivo de estudiar y comparar la distribución tisular de FFC y FFC-a, en otros grupos de animales tratados con SS o LPS se administró FFC en dosis de 20 mg/kg vía intramuscular. En los animales del grupo control las mayores concentraciones tisulares de FFC se observaron en riñones, seguidos en orden decreciente por músculo, bazo, pulmón, hígado y cerebro. Las mayores concentraciones de FFC-a se observaron en riñón e hígado. En el grupo de conejos tratados con LPS se observaron incrementos significativos de las concentraciones de FFC en músculo, mientras que las concentraciones de FFC-a en hígado, músculo y bazo fueron significativamente mayores a las de los conejos control. En los ovinos tratados con LPS las concentraciones plasmáticas de FFC fueron mayores que las observadas en el grupo control, las que estuvieron asociadas a disminuciones significativas del clearance y a incrementos significativo del AUC del antibiótico. También se observaron aumentos significativos en los promedios de Cmáx. Tmáx y AUC del metabolito FFC-a. Las concentraciones tisulares de FFC en riñón, bazo y cerebro fueron significativamente mayores que las observadas en los ovinos del grupo control. En los animales tratados con LPS del presente estudio, la disminución del MR% de FFC- a se explica por alteraciones en la funcionalidad hepática que caracterizan a la RIA. En la comparación de los parámetros farmacocinéticos entre animales sanos (grupos control) de ambas especies, se observó que los conejos presentaron promedios de clearance de FFC significativamente mayores respecto de los ovinos, cambios que se asociaron a incrementos en los promedios de AUC y MR% de FFC-a, los que pueden atribuirse a diferencias de especie en el metabolismo, y en la excreción renal de FFC. La RIA inducida por la administración de LPS de E. coli produjo cambios sobre la disposición plasmática y tisular de FFC y su metabolito FFC-a, en las dos especies en estudio, caracterizados principalmente por un incremento de las concentraciones plasmáticas de FFC, alteraciones en los procesos de eliminación del antibiótico e incremento de las concentraciones tisulares de FFC y FFC-a en los animales tratados con LPS. Los resultados del presente estudio son relevantes ya que entregan antecedentes acerca del comportamiento farmacocinético de FFC en presencia de una respuesta inflamatoria aguda, la cual indujo cambios significativos en la disposición plasmática y distribución tisular del antimicrobiano y su metabolito FFC-a. Por lo tanto, cabría esperar que variaciones similares en la farmacocinética de este antibiótico puedan observarse al ser administrado a animales en condiciones de infección. Los resultados obtenidos también entregan antecedentes que son de utilidad para el cálculo de dosificaciones de FFC y aplicación terapéutica de este antibiótico en conejos y ovinos. Considerando las relaciones observadas entre las concentraciones del antibiótico y los valores de concentraciones mínimas inhibitorias (MIC) para los principales patógenos que afectan al sistema respiratorio, y el nivel de incremento de concentraciones plasmáticas y tisulares de FFC observados en los animales tratados con LPS, estos pueden ser beneficiosos al evaluar la eficacia terapéutica del antibiótico. También es relevante tener en consideración las diferencias de especie observadas en el presente estudio sobre la farmacocinética de FFC, al diseñar regímenes de dosificación de este antibiótico en ovinos y conejos, ya que en conejos se pueden presentar concentraciones del antibiótico menos persistentes debido a su mayor metabolismo y nivel de excreción, frente a lo cual pueden ser necesarias modificaciones en la frecuencia de dosificación entre ambas especies.
Las vesículas extracelulares secretadas por embriones bovinos durante la etapa de blastulación y eclosión reflejan su competencia de desarrollo in vitro.
(Universidad de Concepción, 2023) Gutiérrez Reinoso, Miguel Ángel; Rodríguez Álvarez, Lleretny
Este trabajo se basó en el hecho de que los embriones producidos In vitro son menos competentes que los embriones generados In vivo. El objetivo de nuestra investigación fue determinar las características poblacionales y el perfil de miRNAs de EVs secretadas por embriones bovinos producidos In vitro e In vivo durante la etapa de blastulación y eclosión, y su relación con la calidad embrionaria. Para abordar este objetivo se planteó una pregunta biológica: ¿Las características (morfológicas y contenido de miARN) de las EVs son diferentes cuando los embriones morfológicamente competentes son producidos In vitro - In vivo o en estadios pre-implantatorios (blastulación vs eclosión)?. Para resolver esta pregunta se propusieron dos experimentos que se enfocaron en la caracterización poblacional de EVs y contenido de miARN contenidos en EVs secretadas por embriones In vitro e In vivo durante la blastulación (Exp 1) y la eclosión (Exp 2) por embriones calificados como competentes respecto a los criterios de competencia (Grados 1,2 IETS, para el día 7 y el diámetro o eclosión, para el día 11). Se produjeron mediante PIV e IVV embriones bovinos pre-implantatorios, y se distribuyeron en dos grupos de blastulación y eclosión (PIV5-7, IVV5-7; PIV7-9, IVV7-9). Se seleccionaron morfológicamente según los criterios de la IETS, (2010) las mórulas (Exp1: día 5) y blastocistos (Exp 2: día 7) colectados in vivo al dia 5 y dia 7 respectivamente; los embriones in vitro de dia 5 y 7 del cultivo grupal fueron cultivadas individualmente en medio SOFaa depletado hasta el dia 7 y 9 respectivamente. En general los embriones IVV e PIV se cultivaron hasta el día 11 en medio extendido desde sus estadios de 5-7 días y 7-9 días. El 88,3 % y el 43,05% de los embriones PIV e IVV alcanzaron el estadio de blastocisto a día 7. El desarrollo a día 11 fue significativamente mayor en los embriones producidos IVV (d7-9) (P˂0.05) respecto a los PIV. Los embriones IVV en general tuvieron una mayor tasa de eclosión, siendo >50 % respecto a los PIV. La cinética del desarrollo embrionario presento diferencias significativas entre los grupos de embriones asociadas tanto por el origen (In vitro-In vivo) como por la ventana de estudio (blastulación-eclosión). Al día 11 los embriones de la ventana 7-9 IVV fueron los de mayor diámetro (PIV 5-7: 381,93 ±97,48; IVV 5-7: 345,68 ± 107,26; PIV 7-9: 471,72 ± 77,24; y IVV 7-9: 508,69 ± 90,56 μm). Luego de este análisis se seleccionaron 133 medios de cultivos colectados de embriones calificados como competentes y se caracterizaron las poblaciones de Vesículas Extracelulares (EVs), definidas acorde a los tres criterios básicos recomendados por la Sociedad Internacional de Vesículas extracelulares (ISEV) para definir EVs: 1) presencia de marcadores de superficie específicos (Citometría), 2) morfología (Microscopia Electrónica de Transmisión-TEM), y 3) tamaño y concentración (Nano Tracking Analysis, NTA). Las EVs de medios de cultivo de embriones y del control positivo (EVs de suero fetal bovino) fueron positivas para los cuatro marcadores proteicos específicos de superficie de EVs analizados (CD9, CD63, CD81 y CD40). Mediante TEM se identificaron estructuras con morfología clásica de EVs, con un diámetro entre 100 y 500 nm, con forma redondeada o de copa y presencia de una bicapa; además no se observaron diferencias morfológicas entre las EVs de los embriones de los diferentes grupos experimentales. Se caracterizó la población de EVs de acuerdo con su tamaño (pequeñas (<120 nm y grandes (>120 nm) y concentración. (NTA): al tamaño y concentración de EVs. Las variables de morfología del blastocisto y características morfológicas de las EVs fueron sometidas a análisis de componentes principales (ACP) para discriminar los grupos de embriones. El análisis estadístico se realizó con el programa SAS versión del sistema ocho para Windows y programa IBM SPSS Statistics versión 19. Se detectaron poblaciones de EVs en el rango de 25-620 nm, pero con mayor concentración en el rango de pequeñas vesículas (menor de 200 nm). Se observaron dos poblaciones de EVs: vesículas grandes (>120 nm) y vesículas pequeñas (≤120 nm). Para el análisis del contenido de microARNs las muestras se obtuvieron aleatoriamente de cada réplica experimental que contenía EVs de 10 embriones: 6 réplicas del grupo PIV5-7, 3 réplicas IVV5-7, 3 réplicas PIV7-9 y 3 réplicas IVV7-9. Se realizó la extracción y análisis de calidad del ARN total por réplica. El RIN (“RNA Integrity Number”) fue mayor a 7, considerado aceptable para el análisis de secuenciación. El programa Fastp detectó lecturas de 75 ± 1 pares de bases (Paired End) y con un inserto de 149 pares de bases las cuales fueron mapeadas contra el genoma disponible en Mirbase versión 21. Se realizó un análisis de componentes principales (ACP) para determinar la variabilidad de los conteos entre las réplicas de cada grupo experimental: Se observó mayor separación inter-grupal entre los grupos IVV e PIV (blastulación) y menor separación inter-grupal entre los grupos IVV e PIV (eclosión). Se identificaron 122 miARNs con un CPM (conteos por millón) sobre 5; y se detectaron 74 miARNs comunes que están presentes en todos grupos experimentales. El análisis de expresión diferencial de miRNAs en las EVs en función del origen embrionario muestra 32 y 65 miARNs mayormente representados en las EVs secretadas durante la blastulación de embriones IVV e PIV respectivamente y 5 miARNs diferencialmente representados en las EVs de embriones IVV. Respecto al contenido de miARNs en las EVs, hubo una disminución en el contenido de miARNs mayormente representados a medida que avanza el desarrollo embrionario, tanto para los in vitro como In vivo. En el estadio de eclosión se identificó un miARN exclusivo de las EVs de los embriones IVV y 18 exclusivos en las EVs de los embriones PIV, mientras que 2 miARNs están igualmente representados en las EVs de los embriones de ambos orígenes. Finalmente se realizó un análisis de ontología para caracterizar la función molecular. Los miARNs sobrexpresados de las EVs secretadas durante la eclosión por embriones PIV afectan un mayor número de funciones biológicas que los sobreexpresados en EVs de embriones IVV, incluyendo 9 funciones exclusivamente afectadas. En conclusión, en este trabajo se demostró que el origen embrionario (In vivo vs In vitro) y su etapa de desarrollo (blastulación y eclosión) tienen un efecto sobre las características poblacionales (tamaño promedio, concentración y contenido de miARNs) de vesículas extracelulares secretadas por embriones bovinos. Por tanto, una mayor secreción de EVS y un mayor número de microARNs diferencialmente expresados podrían estar relacionados con la competencia embrionaria.
Efectos del estado inflamatorio inducido por lipopolisacárido de escherichia coli o128:b12 sobre la disposición plasmática y la distribución tisular de ivermectina en ovinos.
(Universidad de Concepción., 2022) Riquelme Acuña, José Belarmino; Pérez Fernández, Rubén
Antecedentes actuales demuestran que la farmacocinética de antimicrobianos puede ser modificada en animales que estén cursando con un proceso inflamatorio derivado de la acción de agentes patógeno causantes de una infección. Esto se debe a alteraciones en la expresión de proteínas con función enzimática y/o transportadora, lo cual puede modificar el perfil farmacocinético, la distribución tisular pudiendo alterar la eficacia y seguridad del antimicrobiano. La respuesta orgánica a la infección se caracteriza por una reacción sistémica conocida como respuesta de fase aguda (RFA), la que comprende un conjunto de reacciones metabólicas y fisiológicas que forman parte del sistema de defensa temprana y/o sistema inmune innato del huésped y que puede ser activado por diferentes estímulos entre los que destaca el lipopolisacárido (LPS) de Escherichia coli. Para conocer el efecto de la administración de LPS sobre variables fisiológicas, hematológicas y bioquímicas, dos grupos de ovinos se distribuyeron en un grupo experimental (n = 5) tratado con 3 dosis intravenosas de 1 μg/kg de LPS y grupo control (n = 5) tratado con solución salina (SS) a igual volumen y frecuencia que el grupo experimental. Se monitoreó; Temperatura corporal (T°C), frecuencia cardíaca (FC) y frecuencia respiratoria (FR). Se tomaron muestras de sangre para hemograma y determinar actividad enzimática para aspartato amino transferasa (AST) y gamma glutamil transferasa (GGT) entre 1 y 24 h post-LPS. Las ovejas tratadas con LPS presentaron valores medios de T°C (41,2 ± 0,4°C), FC (132 ± 12,3 latidos/min) y FR (107,2 ± 25 ciclos/min) superiores a los observados en ovinos controles (39,8 ± 0,2°C, 88,8 ± 8,7 latidos/min y 53,6 ± 17,1 ciclos/min respectivamente). Entre las 4 y 8 horas posterior a la inyección de LPS, el recuento de leucocitos se asoció a linfopenia, seguida de leucocitosis a las 24 horas. Estos resultados permiten caracterizar la respuesta de fase aguda inducida por LPS en ovinos, por lo que representan un modelo útil para estudiar la farmacocinética de ivermectina en respuesta a una infección. La ivermectina (IVM) es un antiparasitario ampliamente usado en medicina veterinaria y que se aplica a un gran número de animales entre los cuales es posible encontrar aquellos que estén cursando un cuadro inflamatorio asociado a un proceso infeccioso. El objetivo del estudio fue evaluar el efecto del estado inflamatorio inducido por lipopolisacárido de Escherichia coli sobre la disposición plasmática de ivermectina cuando se administra por vía endovenosa, subcutánea e intraruminal en ovinos. Para ello se realizaron tres experimentos, en cada uno de los cuales se distribuyeron dos grupos experimentales de ovejas Suffolk Down: Grupo 1 (LPS, n =5): tratado con tres dosis de LPS de 1 μg/kg a −24, −16 y −0,75 h previo a la administración de IVM; grupo 2 (Control, n =5): tratados con SS. A los 45 minutos posteriores a la tercera dosis de LPS o SS se administraron 0,2 mg de IVM/kg vía intravenosa (IV), subcutánea (SC) o intraruminal (IR) para cada uno de los experimentos. En otro grupo de 12 ovinos, los que siguieron el mismo régimen de tratamiento experimental con LPS o SS se administró IVM por vía SC y a los 2 días post-administración de IVM los animales fueron sometidos a eutanasia para la recolección de tejidos y evaluar la distribución tisular del fármaco. Las concentraciones de plasmáticas y tisulares de IVM se determinaron mediante cromatografía líquida de alta resolución. Los parámetros farmacocinéticos fueron calculados mediante un modelo no compartimental. En cuanto a la IVM administrada por vía IV en ovejas control, los valores de los parámetros farmacocinéticos fueron los siguientes: vida media de eliminación (2,85 días), tiempo medio de residencia (TMR) (2,27 días), área bajo la curva de concentración plasmática a través del tiempo (ABC) (117,4 ng día/mL), volumen de distribución (875,6 mL/kg) y aclaramiento (187,1 L/día). Para IVM SC, los valores de los parámetros farmacocinéticos fueron los siguientes para ovejas sanas: vida media de eliminación (10,2 días), TMR (12,38 días), ABC (211,34 ng-día/mL). Finalmente, para IVM IR se encontraron los siguientes valores de los parámetros farmacocinéticos en ovejas sanas: vida media de eliminación (2,38 días), TMR (2,87 días), ABC (45,96 ng-día/mL). Para los parámetros farmacocinéticos estudiados no se observaron diferencias estadísticamente significativas al comparar con los resultados obtenidos en el grupo de ovinos tratados con LPS respecto a los observados en el grupo control. En cuanto a las concentraciones plasmáticas de IVM, no se observaron diferencias estadísticamente significativas para la vía IV cuando se compararon ovinos control con ovinos tratados con LPS. En cambio, para la vía SC, se observaron diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos de ovinos a las 24 horas de administrada la IVM, siendo menores en el grupo tratado con LPS. La administración IR de IVM en ovinos tratados con LPS produjo disminución significativa de las concentraciones plasmáticas de IVM con respecto al grupo control 12 horas post administración del fármaco. Tanto para la vía SC como para la vía IR, las diferencias fueron observadas en la fase de absorción del fármaco. Con respecto a la distribución tisular de IVM posterior a la administración por vía SC, las mayores concentraciones en ovejas sanas se observaron en la bilis (165,8 ng/mL), hígado (56,7 ng/g) y riñón (22,8 ng/g), no observándose diferencias con los ovinos tratados con LPS. Se concluye que la RFA inducida por la administración intravenosa de LPS de E. coli en ovinos adultos, no produjo cambios en los parámetros farmacocinéticos de IVM cuando esta se administra por vía IV, SC e IR, ni en la distribución tisular de IVM cuando se administra por vía SC, por lo que su administración en dosis terapéuticas es segura en ovinos que cursen un cuadro inflamatorio derivado de un proceso infeccioso.
Trematodos Schistosomatidae en Anseriformes y moluscos dulceacuícolas del centro y sur de Chile: Agentes de la dermatitis cercarial humana.
(Universidad de Concepción., 2022) Oyarzún Ruiz, Pablo Enrique; Moreno Salas, Lucila del Carmen
Los esquistosomas son trematodos sanguíneos de la familia Schistosomatidae, compuesto por 13 géneros parasitando aves dulceacuícolas y marinas como sus hospederos definitivos, y caracoles acuáticos como hospederos intermediarios. Son responsables de un cuadro zoonótico conocido como dermatitis cercarial (DC), el cual ocurre por la penetración de furcocercarias liberadas por los caracoles hospederos. El género Trichobilharzia es considerado el mayor responsable de los brotes de DC en seres humanos en el mundo. Estos trematodos han sido ampliamente estudiados en el hemisferio Norte, donde se han determinado áreas de endemia de la parasitosis, y recientemente se ha planteado como una enfermedad re-emergente, o incluso emergente en áreas de poca atención. Esto último es el escenario existente en el Neotrópico, donde las principales investigaciones sólo provienen de Argentina y Brasil, no obstante, la sistemática de estos parásitos sigue siendo, en general, pobremente abarcada. Si bien en Chile existe un brote de dermatitis cercarial reportado, y otros dos registros de esquistosomas en aves silvestres, la identificación específica de dichos esquistosomas en cada caso es desconocido a la fecha. En la presente tesis doctoral se plantearon dos hipótesis: (1) "Si la mayoría de los registros de esquistosomas aviares en Sudamérica provienen de la familia Chilinidae, entonces los hospederos intermediarios de estos trematodos en los sitios a muestrear en las zonas centro y sur de Chile corresponden a representantes de dicha familia" y (2) “Teniendo en consideración la especificidad de los esquistosomas aviares entre diferentes especies de anátidos, las comunidades de esquistosomas de patos y cisnes de cuello negro son distintas”. Para poner a prueba ambas hipótesis, se colectaron un total de 2284 caracoles dulceacuícolas de cinco familias provenientes de las regiones del Ñuble, Biobío y Los Ríos. Estos fueron estimulados para liberación cercarial y diseccionados para determinar la presencia de esporoquistes. Además, con el fin de determinar la presencia de esquistosomas viscerales como nasales, se realizó la necropsia parasitaria de 95 anátidos de cinco especies distintas procedentes de las regiones antes mencionadas. Los parásitos colectados fueron caracterizados morfológica y molecularmente considerando los genes 28S y COI. Del total de caracoles analizados, 35 caracoles de la especie Chilina dombeyana (Chilinidae) (Prevalencia= 1,53%) provenientes de la Laguna Chica de San Pedro (región del Biobío) resultaron parasitados con tres linajes distintos de esquistosomas aviares (Linajes I, II y III), dos de los cuales (I y II) fueron caracterizados molecularmente. Esta prevalencia coincide con lo reportado previamente en otras áreas geográficas. Desde el punto de vista filogenético, el Linaje I fue conespecífico con un taxón descrito desde Cygnus melancoryphus en Argentina, Nasusbilharzia melancorhypha. Mientras que el Linaje II no formó parte de ningún clado de género conocido y, por lo tanto, con el potencial de corresponder a un taxón nuevo. En el caso de las aves, 58 (Prevalencia= 61,05%) de ellas albergaron esquistosomas, con cada especie resultando parasitada con al menos un taxón de esquistosoma aviar visceral y/o nasal. En el caso de los viscerales se describieron cinco taxones para el género Trichobilharzia y cuatro para Dendritobilharzia. Mientras que en los nasales se describió un taxón del género Trichobilharzia y otro de Nasusbilharzia. Todos los taxones descritos, con excepción de los relacionados a Dendritobilharzia, obtuvieron soportes robustos en los análisis filogenéticos de ambos genes. Además, se expandió la distribución geográfica conocida de Trichobilharzia querquedulae y N. melancorhypha a Chile. Así mismo, se entrega evidencia sobre la especificidad de ciertos esquistosomas descritos hacia sus hospederos definitivos: Trichobilharzia sp. 4-Mareca sibilatrix, T. querquedulae-Spatula cyanoptera y N. melancorhypha-C. melancoryphus, lo cual fue soportado filogenéticamente. Adicionalmente, se plantea la necesidad de análisis filogenéticos adicionales para los taxones de Dendritobilharzia, género que ha resultado históricamente conflictivo desde el punto de vista morfológico, contando desafortunadamente con escasas secuencias de ADN para su comparación. En relación con los ciclos biológicos, se lograron dilucidar dos ciclos biológicos, indicando al menos un hospedero definitivo y uno intermediario para cada uno; el de N. melancorhypha, aislado desde C. melancoryphus y C. dombeyana, y el de un taxón aún pendiente por describir aislado desde los mismos dos hospederos. Es importante mencionar que en esta tesis doctoral se logró la caracterización de nueve taxones con el potencial de corresponder a nuevas especies para la familia Schistosomatidae, los cuales fueron colectados desde las cinco especies de anátidos muestreados. Este notable registro plantea la necesidad de continuar la investigación de los esquistosomas aviares, cuya diversidad está evidentemente subestimada. Acorde a los resultados obtenidos, ambas hipótesis fueron aceptadas. Además, este estudio corresponde a la primera caracterización morfológica como molecular de los esquistosomas aviares presentes en Chile, entregándose evidencia adicional a este grupo escasamente estudiado en el continente Sudamericano, además de aportar a la discusión sobre la especificidad de estos parásitos hacia sus hospederos aviares.
Estudios de campo de mycoplasma hyopneumoniae, circovirus porcino tipo 2 y actinobacillus pleuropneumoniae, en planteles de producción intensiva de cerdos en Chile.
(Universidad de Concepción., 2012) Neira Ramírez, Víctor Manuel; Ruiz Garrido, Álvaro Rafael
En Chile, los cuadros asociados a Mycoplasma hyopneumoniae (M hyo), Circovirus porcino tipo 2 (PCV2) y Actinobacillus pleuropneumoniae (App), pueden ser considerados como los de mayor relevancia tanto a nivel respiratorio (M hyo, App), como sistémicos (PCV2), siendo ambos muy importantes desde el punto de vista económico y sanitario en Chile y el mundo. En el país es escaso el conocimiento científico de estos tres patógenos y, en general, existen muy pocas publicaciones que describan el estatus sanitario y existiendo principalmente solo reportes informales. Así el presente trabajo tuvo por objetivo contribuir al conocimiento de estos patógenos en Chile, con especial énfasis en conocer el estatus de sus infecciones y determinar la diversidad genética de estos. Lo anteriormente mencionado se llevó a cabo realizando cinco estudios. Dos de ellos se enfocaron en M hyo, los que tuvieron como objetivo determinar la prevalencia y dinámica de seroconversión de M hyo, utilizando ELISA, y determinar la diversidad y variabilidad genética del patógeno, secuenciando el gen de la proteína P146, en planteles de producción intensiva de mono y multisitio. Mediante otros dos estudios se estudió el cuadro de desmedro multisistémico post-destete (PMWS, por sus siglas en inglés) y PCV2 en Chile, analizando y describiendo lesiones según el sistema productivo. El conjunto de datos obtenidos permitió generar un modelo de regresión logística que ayuda a predecir el diagnóstico del cuadro y conocer la variabilidad genética de PCV2 obtenida de los cerdos positivos para PMWS, mediante secuenciación viral y PCRs selectivos. Finalmente, en el caso de App se estudió la variabilidad y distribución de serotipos en el país, evaluando aislados obtenidos desde mono y multisitios, utilizando una técnica rápida de PCR.
Distribución, prevalencia y filogeografía de Haemoproteus y Plasmodium en aves del orden Passeriformes en el cono sur de Sudamérica.
(Universidad de Concepción., 2019) Doussang Ortiz, Daniela Ivonne; González Acuña, Daniel A.
Los hemosporidios aviares son protozoos de distribución mundial, transmitidos por vectores (dípteros). Plasmodium y Haemoproteus son los más comunes en aves y son causantes de malaria y pseudomalaria respectivamente. Su distribución, prevalencia y diversidad pueden estar influenciadas por factores bióticos y abióticos, tales como; altitud, latitud, relación parásito-hospedador y barreras biogeográficas como la Cordillera de los Andes. Este estudio tiene como objetivos (1) determinar distribución, prevalencia y diversidad de Plasmodium y Haemoproteus en aves silvestres del orden Passeriformes principalmente de Chile y Argentina, y compararlos con los ya descritos en Sudamérica; (2) Analizar factores bióticos y abióticos que puedan estar influenciando la prevalencia, distribución y diversidad de los haplotipos de Plasmodium y Haemproteus; (3) evaluar el efecto del aislamiento producido por la cordillera de los Andes en la distribución y diversidad de los haplotipos de hemoparásitos de aves; (4) y asignar las especies morfológicas analizadas con sus haplotipos. Para desarrollar estos objetivos, se extrajo sangre de aves desde distintas localidades de Chile, para la detección de Haemoproteus y Plasmodium a través de técnicas de diagnóstico tradicionales (microscopía óptica) y PCR utilizando el gen de citocromo b mitocondrial. Además fueron adicionadas al análisis muestras obtenidas de tejidos (sangre, músculo, hígado o corazón) de chincol (Zonotrichia capensis) provenientes de “Museo de Luisiana”, Estados Unidos y otras muestras de colección de tejidos (sangre y músculo) de Passeriformes de “Museo Argentino de Ciencias Naturales Bernandino Rivadavia”, Buenos Aires, Argentina.
La competencia de embriones bovinos producidos in vitro modifica la señalización embrionaria mediada por vesículas extracelulares.
(Universidad de Concepción., 2018) Mellisho Salas, Edwin Alberto; Mellisho Salas, Edwin Alberto
Las vesículas extracelulares (EVs) secretadas por los blastocistos pueden ser relevantes, como un buen predictor de la competencia de los embriones producidos in vitro. El objetivo de este trabajo fue determinar el perfil de mi ARN contenido en EVs secretadas por embiones bovinos con diferente velocidad de desarrollo in vitro y competencia pre-implantatoria. El trabajo fue abordado con dos experimentos. El primer experimento fue para identificar y caracterizar las EVs secretadas por embiones bovinos pre-implantatorios. Para esto se consideró la secreción durante la etapa de desarrollo posterior a la blastulación (día 7-9 de desarrollo in vitro) y se incluyeron solo embriones protuidos para eliminar el efecto de la zona pelúcida. Además, se consideraron embiones producidos in vitro utilizando dos tecnologías que producen embiones con diferente competencia: 1) partenogénicos (PA), menos competentes y 2) fecundación in vitro (IVF), más competentes. Un segundo experimento fue para realizar una determinación no invasiva de competencia embionaria considerando características de poblaciones de EVs secretadas durante la etapa de blastulación y parámetros morfocinéticos del embrión. Para esto, los embriones fueron cultivados en grupos, hasta el día 5 de desarrollo in vitro, en este momento se seleccionaron las mórulas, las cuales se cultivaron individualmente en SOFaa depletado hasta el día 7.5. Durante este periodo los embriones fueron monitoreados para determinar el momento de la aparición del blastocele, como indicador cinético de desarrollo embrionario: 1) blastulación temprana (EB: Día 6.5) y 2) blastulación tardía (LB: Día 7.5). Al día 7.5, se determinaron las características morfológicas de los blastocistos siguiendo los criterios de la IETS. Al día 7.5, se colectó individualmente el medio de cultivo, se identificó con el embrión correspondiente y se conservó a -80 °C para posteriores análisis.Los blastocistos evaluados (día 7.5) fueron transferidos a medio SOFaa dep fresco hasta el día 11 de desarrollo in vitro para determinar su potencial de desarrollo post-eclosión, de acuerdo a su crecimiento. A los parámetros tamaño y concentración de EVs generados por Nano Tracking Analysis (NTA), se les realizó análisis de varianza y la comparación de medias test HSD. Posteriormente, las variables de morfología del blastocisto y características morfológicas de las EVs fueron sometidas a análisis de componentes principales (PCA) y análisis de conglomerados (CA) para la posibilidad de discriminar los grupos de embiones. Finalmente, se utilizó un análisis de regresión logística binaria, para construir modelos no invasivos de predicción de competencia embrionaria. El análisis estadístico se realizó con el programa SAS versión ocho para Windows y programa IBM SPSS Statistics versión 19. En el experimento 1, el análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM) reveló la presencia de vesículas heterogéneas de diferentes tamaños y población: microvesículas (MVs) y exosomas (Exs) de forma redondeada, encerrados por una capa doble de lípidos y con un rango de 30 a 385 nm de diámetro. Además, el análisis de citometría de flujopermitió identificarproteínas de superficie CD63 y CD9 como marcadores de EVs. El NTA generó datos sobre las características morfológicas de las EVS, tamaño y concentración. El perfil (concentración y tamaño) de partículas secretadas por embriones derivados de IVF, fue diferente a las secretadas por embriones PA. En el experimento 2, las características morfológicas de los blastocistos se diferenciaron estadísticamente de acuerdo con el momento de blastulación y competencia por su tamaño y calidad. Los embriones más competentes del grupo de blastulación temprana secretaron EVs con mayor tamaño (122.9 nm), mientras que la mayor concentración de EVs (5,75 x 10 [9] partículas / ml) correspondió al grupo no competente. La secuenciación de ARN pequeños mostró un total de dos biotipos, miARN (86 a 91%) y snoARN (9 a 14%). Además, se identificó un total de 182 miARN y 31 snoARN. El análisis de expresión diferencial de miARN entre blastocisto competente versus no competente, mostró 12 miARN regulados positivamente y 15 miARN regulados negativamente. Posteriormente, utilizando una regresión logística binaria, se construyó un modelo no invasivo para predecir la competencia embrionaria basada en una combinación de variables morfocinéticas de blastocisto y las características de EVs los cuales mostraron un alto ROC-AUC de 0.853. En conclusión, en este trabajo se demostró que los blastocistos bovinos secretan MVs/EXs a los medios de cultivo y esta secreción tiene características que varía dependiendo de la competencia embrionaria previa a la implantación, por lo tanto, es posible generar un nuevo modelo predictivo no invasivo de alta eficiencia para la selección de embriones bovinos.
Generación de embriones bovinos por transferencia nuclear somática: evaluación de la capacidad de desarrollo in vivo e in vitro y de la expresión génica en las etapas pre y peri-implantatorias.
(Universidad de Concepción., 2009) Rodríguez Álvarez, Lleretny; Castro Reboredo, Fidel Ovidio
La clonación somática es una poderosa herramienta para la producción de animales con un genotipo específico, ya sea para fines productivos a través de la multiplicación de ejemplares de alto valor genético, la creación de animales transgénicos o para la conservación de especies en peligro de extinción. En la última década esta tecnología se ha ido perfeccionando y hoy en día se ha logrado la obtención de clones en dieciséis especies de mamíferos. La aplicación de la transferencia nuclear es limitada debido a la ineficiencia del proceso en término de animales nacidos y al desconocimiento de la expresión génica que gobierna el proceso de clonación, por lo que es sujeto de estudio a nivel mundial. En este trabajo se empleó una metodología novedosa de transferencia nuclear somática, conocida como Hand Made Cloning (HMC) para generar embriones bovinos clonados, usando dos líneas celulares distintas como donantes de núcleo, una de fibroblastos de piel de un animal adulto y la otra de un feto. Se evaluó el potencial de desarrollo de los embriones generados con ambas líneas, en términos de desarrollo in vitro hasta blastocistos, así como morfología y calidad. Se demostró que con la línea celular adulta es posible generar con mayor eficiencia y calidad embriones clonados en bovinos.
Situación actual de la pleuroneumonía contagiosa porcina en planteles de cerdo de la zona centro-sur de Chile y estudio de la patogenicidad y respuesta inmune frente a un aislado nacional (418/07) de actinobacillus pleuropneumoniae.
(Universidad de Concepción., 2010) Muñoz Vergara, Dennis Wilson; Ruiz Garrido, Álvaro Rafael
En la última década la industria porcina nacional se ha desarrollado hasta convertirse en un área económica de importancia y con prometedores índices de crecimiento. Esto, ha promovido no sólo el aumento de la masa de animal, sino también una mayor vulnerabilidad frente a diversos agentes patógenos, dentro de los cuales los respiratorios tienen una importancia esencial, debido a que afectan principalmente a cerdos de engorda. Uno de los más importantes, sin lugar a dudas es Actinobacillus pleuropneumoniae (App), agente etiológico de la Pleuroneumonía Contagiosa Porcina (PCP).
Evaluación de diferentes metodologías de administración y alternativas de vacunación contra Circovirus porcino tipo 2 y Mycoplasma hyopneumoniae en dos sistemas de producción porcina intensiva en Chile.
(Universidad de Concepción., 2014) Gutiérrez Jaramis, Cristian Andrés Arturo; Ruiz Garrido, Álvaro Rafael
Tanto en Chile como en el resto de los países del mundo con producción porcina intensiva, los cuadros patológicos asociados a la presencia de circovirus porcino tipo 2 (PCV2) y Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo) tienen gran influencia sobre el estado sanitario general de las piaras y por ende cobran especial relevancia como potenciales causantes de merma sobre el rendimiento económico de las unidades productivas. La vacunación contra estos patógenos se ha vuelto una práctica de rutina en los sistemas productivos y la implementación en terreno de este manejo demanda el uso de mano de obra calificada para la intervención de grandes poblaciones de animales en un acotado periodo de tiempo.
Plasticidad de células felinas diferenciadas y su transición a mayores niveles de potencia.
(Universidad de Concepción., 2019) Echeverry Berrío, Diana Maritza; Castro Reboredo, Fidel Ovidio
La obtención de células madre mesenquimales (MSC) en algunas ocasiones puede ser un procedimiento invasivo en los felinos, particularmente cuando existen patologías, traumas o situaciones específicas en las cuales está contraindicado el procedimiento quirúrgico para obtener biopsias de tejido. La inducción de células somáticas diferenciadas hacia células madre mesenquimales es una herramienta recientemente descrita en humanos y ratones, la cual promete ser exitosa y evadir las complicaciones descritas. Esta metodología se basa principalmente en modificar la expresión génica de las células diferenciadas con el uso de remodeladores epigenéticos, factores de crecimiento y pequeñas moléculas que facilitan la reconversión o de-diferenciación para la obtención de un mayor nivel de potencia. El objetivo del presente estudio fue evaluar la plasticidad de dos tipos celulares de origen felino, fibroblastos y células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo (AMSC), frente a varios protocolos de inducción a multipotencia. Para lograr este objetivo se emplearon dos remodeladores epigenéticos, el ácido valproico y la 5-azacitidina, junto con plasma rico en plaquetas como fuente de factores de crecimiento, factor de crecimiento epidermal y factor de crecimiento derivado de plaquetas para conferir características multipotentes a las células reprogramadas. En este estudio también se produjo el factor de crecimiento derivado de plaquetas (h-PDGF-B) por transfección estable de células mamíferas. Los fibroblastos y AMSC fueron obtenidos de gatas domésticas entre 6 meses y 3 años. Los protocolos fueron estandarizados y se evaluó su efectividad en inducir características multipotentes reflejadas en expresión de genes de pluripotencia, marcadores de superficie y capacidad de diferenciación mesodérmica. La expresión de OCT4 incrementó significativamente en fibroblastos felinos (p < 0,05), así mismo se logró la diferenciación hacia linajes mesodérmicos (adipogénesis, condrogénesis y osteogénesis) con el uso del protocolo de reprogramación con 5AZA y VPA durante 12 días. Otros tratamientos arrojaron resultados parciales, confiriendo aumento en la expresión de OCT4 y/o capacidad limitada de diferenciación hacia uno o dos linajes mesodérmicos. Las AMSCs por su parte no presentaron cambios significativos en la expresión de genes o potencial de diferenciación con el uso de los remodeladores epigenéticos, con excepción de potenciar la diferenciación osteogénica con el pretratamiento con estas moléculas. Los resultados obtenidos demuestran que las células somáticas felinas presentan determinada plasticidad que puede ser aprovechada para diferentes eventos de reprogramación celular, en este caso, para obtener un estado multipotente o favorecer la diferenciación hacia determinado linaje mesodérmico. Sin embargo, este protocolo requiere algunos ajustes en orden de lograr una mayor eficiencia de reprogramación de fibroblastos hacia iMSCs. Estos resultados son de importancia para en el área de la medicina regenerativa y otras aplicaciones biotecnológicas en especies de la familia Felidae.
Valoración de las propiedades biológicas de las MSCs equinas aisladas de diferentes tejidos y su potencial uso terapéutico en endometritis en yeguas.
(Universidad de Concepción., 2020) Navarrete Aguirre, Felipe Ignacio; Castro Reboredo, Fidel Ovidio
El uso de terapias en base a células madre mesenquiales (MSC), está ampliamente descrito en equino, sin embargo, la mayoría de estas terapias se basan en el tratamiento de lesiones musculo esqueléticas, y en menor medida como uso potencial en afecciones reproductivas. En este estudio se evaluó el efecto de dos fuentes diferentes MSC obtenidas a partir del mismo donante sobre sus principales características biológicas in vitro y sus propiedades anti inflamatorias y anidamiento in vivo en yeguas con endometritis inducida post monta (PMIE). Se aislaron MSC equinas desde endometrio y tejido adiposo (ET-MSC y AT-MSC respectivamente) a partir de los mismos donantes. Las células mostraron rasgos característicos de MSC incluyendo la adherencia al plástico, marcadores de superficie, potencial de migración, así como la diferenciación mesodérmica clásica, además de lograr diferenciaciones neurogénica y cardiomiogénica. Se evaluó la influencia del origen celular en su perfil trascriptómico. Para esto se aisló y secuenció el ARN celular y se obtuvieron vesículas extracelulares (VE) a partir de un medio de cultivo celular libre de VE, y se analizó su carga de microARN (miARN) mediante secuenciación. Se analizó y comparó la expresión diferencial de ARNm y miARN-EV, así como las vías y procesos más representados en cada origen celular. Se identificaron un total de 125 genes regulados positivamente, 51 regulados negativamente y 31 miARN expresados diferencialmente entre células de ambas fuentes. Sobre la base de la secuenciación del ARNm, las ET-MSC mostraron una mayor expresión de genes involucrados en las vías de señalización Hippo, TGF-β y pluripotencia. Junto con esto, las vías involucradas en la reorganización de la matriz extracelular fueron las más representadas en la carga de miARN de las VE secretadas por ET-MSC. El nicho desde el que se originó la MSC definió el perfil transcriptómico de las células, incluida la secreción de VE específica de linaje para garantizar una comunicación y homeostasis adecuada. Posteriormente se evaluó y comparó el potencial uso de MSC de ambas fuentes como herramientas antiinflamatorias para PMIE, para esto se infundieron intrauterinamente (IU) MSC marcadas en yeguas con PMIE para evaluar su acción antiinflamatoria y anidamiento. Se indujo PMIE en nueve yeguas ginecológicamente sanas mediante la infusión IU de 500 millones de espermatozoides muertos en solución salina. Se analizaron marcadores de inflamación en lavados uterinos y biopsias antes (fase I) y 3 h después de la infusión de espermatozoides (fase II). Las mediciones llevadas a cabo fueron: conteo de células polimorfonucleres (PMN), proteínas IL-6 y TNF-α (ELISA en los lavados) e inmunotinción en biopsias, transcritos de IL-1α, 6, 8, 10, TNF-α y COX 2 (RT-qPCR de lavados). A las 24 h después de la deposición de espermatozoides (fase III), se infundio a las yeguas 20 ml IU de solución salina que contenía 2× 107 AT-MSC (n = 3, grupo 1) o ET-MSC (n = 3, grupo 2). Las células se marcaron previamente con el éster succinimidíl diacetato de carboxifluoresceína (CFDA SE). Un tercer grupo (n = 3) recibió solo 20 ml de solución salina estéril. Después de 48 h se realizó otra biopsia / lavado y se analizaron los mismos parámetros descritos anteriormente. Para evaluar el anidamiento, se tomaron biopsias adicionales en los días 10 y 30 post inoculación de MSC y se analizaron mediante microscopía confocal. Los espermatozoides muertos en solución salina aumentaron notablemente los recuentos de PMN, la expresión de IL-6 y TNF-α en el ELISA (p <0,05) y la inmunotinción. En la fase III se encontró una reducción significativa (p <0,0001) de PMN en todas las muestras, incluidas las yeguas control. Mediante ELISA se detectó una disminución (p <0,05) de IL-6 y TNF-α, en los grupos que recibieron MSC, pero no en el grupo control. En el grupo tratado con AT-MSC, se encontró una disminución significativa en la expresión de (IL-1α, p = 0,0003; IL-6 p 0.04; IL-8, p = 0.006, TNF-α p = 0.004). La expresión de IL-10 y COX-2 se mantuvo sin cambios (p = 0,08). En las yeguas que recibieron ET-MSC, IL-6, IL-8 y TNF-α disminuyeron significativamente (p = 0.01), IL-10 aumentó (p = 0.009), mientras que COX-2 e IL-1α no cambiaron significativamente su expresión. Mientras que el análisis de anidamiento, el marcaje con CFDA se encontró con moderación en todas las muestras analizadas hasta el día 30, principalmente en el compartimento estromal del endometrio. No se encontraron diferencias en el patrón de anidamiento entre los orígenes celulares. La inoculación de MSC redujo significativamente la inflamación independientemente del origen de las células y que las células realizan un recorrido limitado detectable después de un mes de infusión. Estos hallazgos pueden ser de ayuda para el diseño de nuevas terapias antiinflamatorias de enfermedades uterinas en yeguas.
El complejo Ornithonyssus bacoti (Acari: Mesostigmata) de roedores de Chile diversidad genética, variaciones morfológicas y patógenos asociados.
(Universidad de Concepción., 2019) Silva de la Fuente, María Carolina; González Acuña, Daniel A.; Moreno Salas, Lucila del Carmen
Un complejo de especies corresponde a especies morfológicamente indistinguibles, pero que presentan distintos linajes evolutivos. Estos complejos serían más frecuentes de encontrar en animales invertebrados, los que utilizan principalmente medios químicos o táctiles para el apareamiento, no así diferenciaciones morfológicas. En el caso de artrópodos vectores, es relevante resolver estos complejos de especies debido a que la incorrecta identificación de una especie, podría ocasionar graves problemas relacionados con salud pública. La presente investigación utilizó como modelo de estudio a los ácaros del genero Ornithonyssus s.l. (Acari: Mesostigmata), actualmente constituido por 13 especies, y considerado un complejo de especies, principalmente producto de su similitud morfológica, lo que genera continuos cambios en su clasificación. Tanto el género Ornithonyssus como O. bacoti son reconocidas por parasitar principalmente roedores, sin embargo, O. bursa, O. sylviarum, O. wernecki, O. aridus y O. bacoti parasitan al humano, siendo consideradas como potenciales vectores mecánicos y/o biológicos de patógenos. En Chile solo se ha reportado la especie O. bacoti en roedores silvestres y sinantrópicos, sin embargo, reconociendo la diversidad geográfica y diversidad de roedores presentes, se espera encontrar más de una especie de ácaro del género Ornithonyssus a través de la distribución de sus hospedadores en Chile, los que a su vez albergaran diferentes especies de patógenos asociados a estos. El objetivo principal de este estudio es evaluar el estatus taxonómico de los ácaros Ornithonyssus presentes en roedores de Chile y determinar la presencia de bacterias del género Rickettsia, Borrelia y/o Bartonella, potencialmente patógenas para hospedadores silvestres y/o humanos. Para ello se visitaron 14 localidades a lo largo de Chile (18°19'34,08''S-70°00'31,86''O a 47°07'41,00''S-72°30'18,50''O) y se capturaron roedores desde los cuales se extrajeron los ácaros, los que se sometieron a análisis moleculares (Inferencia Bayesiana y Red de Haplotipos), morfológicos y morfométricos, comparando 40 medidas anatómicas. Se identificaron dos nuevas especies para el género Ornithonyssus, Ornithonyssus nov. sp. 2 y Ornithonyssus nov. sp. 3 con un 8,4% y un 7,2% de distancia genética con respecto a O. bacoti, respectivamente, y una v especie afín a O. bacoti con un 4% de distancia genética en relación a O. bacoti. Dentro de los caracteres morfométricos que las distinguen destaca el largo del peritrema, largo de pata I, largo de pata IV, largo de placa dorsal y la forma del epistome. Por lo tanto, se desca que las especies propuestas en este estudio pueden ser diferenciadas por caracteres morfométricos y morfológicos, además de los moleculares. Respecto a las bacterias, se identificó sólo una genoespecie de Bartonella (con gen 16S ARNr) presente a lo largo de los puntos de muestreo. De este modo, la presente investigación proporciona caracteres útiles de las especies de Ornithonyssus presentes en Chile e indica el eventual rol de estas especies en la mantención de bacterias que posiblemente pueden estar asociadas a agentes patógenosarta la existencia de un complejo de especies Ornithonyssus en Chile, debido
Evaluación del impacto de la exposición prenatal a un exceso de testosterona sobre la estructura y funcionalidad del páncreas endocrino en ovejas.
(Universidad de Concepción., 2020) Carrasco Morales, Albert Ronald; Recabarren Morgado, Sergio
El feto es un individuo con un potencial genético determinado durante la fecundación. Sin embargo, el fenotipo que adquirirá este individuo depende de la forma en que se exprese su patrimonio genético en función del cómo el ambiente module este proceso. Por ello, las características morfológicas y fisiológicas que tendrá un individuo pueden ser modificadas de acuerdo a las condiciones y las exigencias del ambiente, en función del genoma que este alberga para asegurar la sobrevivencia, proceso conocido como plasticidad. Varias sustancias son capaces de modificar el entorno en el que un individuo vive, incluso durante la vida embrionaria y fetal, provocando una desviación en el desarrollo denominada reprogramación. Entre estas sustancias, la exposición fetal a un exceso de testosterona es un fenómeno que provocaría una reprogramación del desarrollo de este individuo incrementando el riesgo a que padezca diabetes mellitus tipo 2 durante la vida adulta. El objetivo del estudio fue evaluar el efecto de la administración de testosterona, en ovejas gestantes, sobre la fisiología de la madre, las variables morfológicas y endocrinometabólicas de los fetos hembra, la sensibilidad de los tejidos a la insulina en distintas etapas de desarrollo somático (26, 30 y 38 semanas de edad) y el efecto de la administración de testosterona en hembras adultas enteras y ooferectomizadas sobre la sensibilidad a la insulina y la estructura y funcionalidad del páncreas endocrino. Para esto, un rebaño de ovejas adultas de 2-3 años de edad fueron cruzadas con machos de fertilidad probada. El día 28 tras la cruza se confirmó la gestación por ultrasonografía y las hembras preñadas fueron separadas en dos grupos considerando las variables peso y edad como criterios de selección. Un grupo de estas hembras fue sometido a un protocolo de androgenización, que consistió en la administración por vía intramuscular de una solución de propionato de testosterona disuelta en aceite de maravilla, dos veces por semana, en dosis de 30 mg/oveja desde el día 30 al 90 de gestación y 40 mg/oveja desde el día 91 al 120 de gestación (Madres-T). Otro grupo de hembras gestantes (Madres-C) sólo recibió el vehículo en el que se diluyó la testosterona durante el periodo experimental. Desde la cuarta a la decimoséptima semana de gestación las hembras gestantes fueron pesadas y se colectaron muestras de sangre yugular desde las que se determinaron distintas variables endocrino-metabólicas. A los 120 días de gestación en un grupo de hembras preñadas se realizó una cesárea en la que se extrajeron los fetos hembra, éstos fueron pesados y se registraron las medidas zoométricas, se colectó una muestra de sangre yugular para realizar análisis endocrinos y metabólicos. Otro grupo de hembras preñadas parieron y las crías hembra fueron empleadas en los siguientes experimentos. En estas crías, a las 26 semanas de edad (periodo considerado peripuberal), se realizó un test de tolerancia a la glucosa endovenosa (TTGEV) durante la fase folicular del ciclo estral. Tras este estudio la mitad de las hembras de cada grupo fueron ooferectomizadas. A las 30 semanas de edad (periodo considerado como postpuberal temprano) se realizó un segundo TTGEV en las hembras enteras y ooferectomizadas control y expuestas prenatalmente a un exceso de testosterona (EPT) para evaluar el efecto de los esteroides endógenos de origen ovárico sobre la sensibilidad a la insulina.
Desarrollo y evaluación de un prototipo de vacuna contra Circovirus Porcino tipo 2 (PCV2) utilizando Pichia pastoris.
(Universidad de Concepción., 2020) Villamil Pérez, Aura Milena; Ruiz Garrido, Álvaro Rafael; Toledo Alonso, Jorge Roberto
El Circovirus porcino tipo 2 (PCV2) representa una preocupación crucial dentro de la industria porcina a nivel mundial y en Chile, específicamente, los sistemas intensivos de producción de cerdos se han visto obligados a ir a la vanguardia en la implementación de programas de vacunación que permitan mantener controlada la enfermedad. Sin embargo, así como las enfermedades asociadas a este patógeno generan pérdidas económicas importantes, las vacunas también conllevan costos elevados dentro de los planteles, por lo que en los últimos años, el desarrollo de vacunas recombinantes ha tomado fuerza, tendiendo en cuenta que se pueden utilizar microorganismos para la obtención de proteínas específicas. Es el caso de la levadura Pichia pastoris que, debido a sus ventajas productivas, se ha convertido en una herramienta llamativa para la producción eficaz de proteínas recombinantes. El objetivo de esta investigación consistió en generar una formulación vacunal que estimulara en los cerdos, bajo condiciones controladas, la respuesta celular y humoral contra PCV2. Inicialmente, se evaluó la producción de las proteínas expresadas en la levadura P.pastoris MP36 analizando clones transformados y a partir de ellos, se obtuvieron dos proteínas: por una parte y en el interior de la célula, la proteína de una quimera de la cápside de PCV2, ya que es considerada como dominante para la inmunogenicidad del virus en el animal; y por otra, el interferón alfa porcino (IFNα) en el medio extracelular, debido a su característica actividad antiviral y efecto inmunopotenciador. A partir de dichas proteínas, se preparó la formulación vacunal utilizando el adyuvante comercial Montanide 15AVG. Posteriormente, se realizaron ensayos con cerdos provenientes de un plantel comercial chileno, para evaluar la efectividad del uso del IFNα en la preparación vacunal. Estos animales fueron trasladados a instalaciones de la Universidad de Concepción, campus Chillán, teniendo cuidado de no afectar su bienestar y normal desarrollo. Se llevaron a cabo las inmunizaciones para comparar la dosis de la formulación vacunal con respecto a su seguridad en cerdos y además, para determinar su potencia. Adicionalmente, se realizó un desafio con la finalidad de poner a los animales en contacto con el virus, replicar la enfermedad y comparar a los animales infectados clínicamente con los animales protegidos. La formulación vacunal desarrollada, utilizando la quimera de la cápside (sin el IFNα), indujo en los cerdos una respuesta inmune contra PCV2, elevando los valores S/P y disminuyendo la carga viral; no obstante, la seroconversión no se dio de manera clara.
Caracterización molecular, evaluación de factores de virulencia y habilidad de adherencia de Staphylococcus aureus aislados desde leche de estanque y superficies del equipo de ordeño en operaciones lecheras.
(Universidad de Concepción., 2020) Pachá Becerra, Paulina Andrea; Latorre Soto, Alejandra Andrea; Muñoz Domon, Marcos Alberto
El objetivo de la presente investigación fue evaluar la diversidad de cepas, factores de virulencia y habilidades de adherencia de S. aureus identificados desde leche de estanque (BTM) y adherencias macroscópicas en superficies de equipo de ordeño en contacto con leche durante el ordeño o enfriamiento de la leche (AMES). Un total de 30 lecherías de la Región de Ñuble fueron incluidas en este estudio. Por rebaño, 3 muestras consecutivas de BTM se recolectaron, correspondientes a una ordeña, y se realizó una inspección del equipo de ordeño en busca de AMES para la detección de S. aureus. Los aislados de S. aureus se subtipificaron por patrones de bandas obtenidos por enzima de macrorestricción SmaI y gel de electroforesis de campo pulsado (PFGE), y además se caracterizaron los patrones de virulencia (PV) y habilidad de adherencia in vitro en superficie de poliestireno. Para la caracterización del perfil de virulencia, genes de importancia en IMI (nuc, coa, fnbA e icaA e icaD) y de importancia en salud pública (resistencia a meticilina, genes mecA y mecC, y genes de enterotoxinas sea y seb) fueron incluidos. En cepas de S. aureus frecuentemente identificados entre lecherías y muestras se evalúa la habilidad de adherencia en microplacas de poliestireno (MPA). Un total de 226 aislados de S. aureus fueron identificados en 23 lecherías y 166 seleccionados para la evaluación de subtipificación por PFGE. Se observó un total de 42 pulsotipos; de los cuales 23 corresponden a pulsotipos principales (A-W) y 19 subtipos. Entre lecherías de la región se identificó una alta heterogeneidad de cepas de S. aureus (diversidad según índice de Simpson [SID] = 0, 99). De los 42 pulsotipos identificados entre las lecherías, 8 de ellos (A, A.1, B.1, D, E, J, K, N, Q) fueron identificados en lecherías diferentes. Estos pulsotipos distribuidos entre lecherías podrían indicar factores asociados que permiten el movimiento de microorganismos entre lecherías geográficamente distanciadas. Dentro de las lecherías, la diversidad de S. aureus fue variable (valores SID de 0 a 1). En 7 lecherías positivas a S. aureus en AMES y BTM, se identificó clonalidad entre pulsotipos de S. aureus de AMES y BTM. Esto podría sugerir que las adherencias presentes en las superficies de ordeño pueden tener un rol importante como potencial fuente de éste microorganismo en BTM. Al realizar la evaluación de los PV de los 166 aislados de S. aureus, se identificaron 5 perfiles de virulencia, donde el perfil nuc (+) coa (+) fnbA (+) icaA (+) icaD (+) mecA (-) mecC (-) sea (-) seb (-) fue el más frecuentemente observado, detectándose en 21 de los 23 pulsotipos principales y en 21 de las 23 lecherías S. aureus (+). No se encontraron diferencias estadísticamente significativa entre los perfiles de virulencia de los aislados de S. aureus de BTM y AMES. Los perfiles de virulencia observados con mayor frecuencia incluyeron genes involucrados en la adherencia y la capacidad de formación de biopelículas de S. aureus, lo que podría representar una ventaja potencial para la bacteria durante las primeras etapas de la IMI y para la persistencia en las superficies. Para la evaluación de adherencia se seleccionaron 24 cepas de S. aureus frecuentemente identificados desde 19 lecherías de la región de Ñuble, identificando 6(25%), 14(58.3%), y 4(16.6%) cepas con alta, mediana y baja adherencia, respectivamente. No se encontraron diferencias significativas en la habilidad de adherencia de poliestireno de cepas identificadas desde BTM-AMEs y sólo de BTM. La presente investigación señala que cepas de S. aureus presentes en BTM y AMES podrían tener una dinámica diferente dentro de los rebaños lecheros. Resaltando la importancia de comprender la epidemiología de S. aureus leche de estanque y en superficies en contacto con leche con el fin de identificar estrategias a considerar en el control de este patógeno intramamario y potencial patógeno humano.
Reprogramación de células somáticas de güiña (Leopardus guigna) mediante transferencia nuclear heteroespecífica utilizando ovocitos maduros de gata doméstica (Felis silvestris catus).
(Universidad de Concepción., 2018) Veraguas Dávila, Daniel Martín; Rodríguez Álvarez, Lleretny
Actualmente existe un aumento en los trabajos de investigación relacionados al desarrollo de técnicas de reproducción asistida en el gato doméstico con el propósito de implementar estas técnicas en especies de felinos amenazados. La güiña (Leopardus guigna) es una especie endémica de Chile, clasificada como vulnerable según la lista roja de la IUCN (International Union for Conservation of Nature). Debido a esto, la transferencia nuclear somática heteroespecífica (TNSh) podría ser una potencial herramienta para generar embriones de güiña utilizando ovocitos enucleados de gata doméstica y de esta manera a ayudar a su conservación. Sin embargo, los embriones generados por TNSh presentan un bajo potencial de desarrollo principalmente debido a una ineficiente reprogramación nuclear. Por lo cual la hipótesis de esta tesis fue “la transferencia de células somáticas de guiña a ovocitos de gata doméstica genera embriones clonados con similar morfología y expresión génica a los embriones clonados utilizando células de gato doméstico”. De acuerdo a los resultados obtenidos, se demostró que el tratamiento con 200 UI de eCG mejoró la calidad morfológica y el patrón de expresión génica de los complejos cúmulo-ovocito (CCOs) colectados. Por lo cual este protocolo fue seleccionado para la posterior generación de embriones. En cuanto a la sincronización del ciclo celular, se demostró que tanto los fibroblastos de gato doméstico como de güiña pueden sincronizarse en la fase G0/G1 por medio de los métodos de privación de suero e inhibición por contacto. Sin embargo, en el caso de los fibroblastos de güiña la exposición a estos tratamientos por más de tres días genera un efecto negativo sobre la viabilidad celular. Por lo cual, se eligió la privación de suero por no más de tres días para la sincronización celular. Adicionalmente, fue posible demostrar que los embriones de gato doméstico generados por FIV utilizando el tratamiento con eCG son capaces de desarrollarse tanto in vitro como in vivo, con la generación de crías vivas. Además, se demostró que la remoción de la zona pelúcida no afecta el potencial de desarrollo in vitro de los embriones de gato. Finalmente, se demostró que en los embriones de gato doméstico generados por TNS la agregación embrionaria mejora el potencial de desarrollo in vitro aumentando la tasa de blastocistos. En el caso de los embriones de güiña generados por TNSh, solo los xix embriones cultivados en agregado lograron alcanzar el estadio de blastocisto en un bajo porcentaje. Al realizar el análisis de expresión génica, se observó que los blastocistos clonados de gato doméstico presentaban una menor expresión de OCT4 en comparación a los blastocistos generados por FIV. Por otro lado, solo uno de los embriones de güiña generados expresó OCT4, sin expresar ninguno de los otros genes de pluripotencia y diferenciación evaluados. De acuerdo a los resultados obtenidos se puede concluir que el ovocito de gata doméstica es capaz de reprogramar las células somáticas de güiña a través de la TNSh. Sin embargo, la mayoría de los embriones clonados de güiña quedan detenidos en el estadio de mórula y solo un bajo porcentaje de estos logran alcanzar el estadio de blastocisto al ser cultivados en agregado. Lo cual se podría deber a una ineficiente reprogramación nuclear

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