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Generación de embriones bovinos por transferencia nuclear somática: evaluación de la capacidad de desarrollo in vivo e in vitro y de la expresión génica en las etapas pre y peri-implantatorias.
(Universidad de Concepción., 2009) Rodríguez Álvarez, Lleretny; Castro Reboredo, Fidel Ovidio
La clonación somática es una poderosa herramienta para la producción de animales con un genotipo específico, ya sea para fines productivos a través de la multiplicación de ejemplares de alto valor genético, la creación de animales transgénicos o para la conservación de especies en peligro de extinción. En la última década esta tecnología se ha ido perfeccionando y hoy en día se ha logrado la obtención de clones en dieciséis especies de mamíferos. La aplicación de la transferencia nuclear es limitada debido a la ineficiencia del proceso en término de animales nacidos y al desconocimiento de la expresión génica que gobierna el proceso de clonación, por lo que es sujeto de estudio a nivel mundial. En este trabajo se empleó una metodología novedosa de transferencia nuclear somática, conocida como Hand Made Cloning (HMC) para generar embriones bovinos clonados, usando dos líneas celulares distintas como donantes de núcleo, una de fibroblastos de piel de un animal adulto y la otra de un feto. Se evaluó el potencial de desarrollo de los embriones generados con ambas líneas, en términos de desarrollo in vitro hasta blastocistos, así como morfología y calidad. Se demostró que con la línea celular adulta es posible generar con mayor eficiencia y calidad embriones clonados en bovinos.
Generación de embriones bovinos por transferencia nuclear somática: evaluación de la capacidad de desarrollo in vivo e in vitro y de la expresión génica en las etapas pre y peri-implantatorias
(Universidad de Concepción., 2009) Rodríguez Alvarez, Lleretny; Castro Reboredo, Fidel Ovidio
La clonación somática es una poderosa herramienta para la producción de animales con un genotipo específico, ya sea para fines productivos a través de la multiplicación de ejemplares de alto valor genético, la creación de animales transgénicos o para la conservación de especies en peligro de extinción. En la última década esta tecnología se ha ido perfeccionando y hoy en día se ha logrado la obtención de clones en dieciséis especies de mamíferos. La aplicación de la transferencia nuclear es limitada debido a la ineficiencia del proceso en término de animales nacidos y al desconocimiento de la expresión génica que gobierna el proceso de clonación, por lo que es sujeto de estudio a nivel mundial. En este trabajo se empleó una metodología novedosa de transferencia nuclear somática, conocida como Hand Made Cloning (HMC) para generar embriones bovinos clonados, usando dos líneas celulares distintas como donantes de núcleo, una de fibroblastos de piel de un animal adulto y la otra de un feto. Se evaluó el potencial de desarrollo de los embriones generados con ambas líneas, en términos de desarrollo in vitro hasta blastocistos, así como morfología y calidad. Se demostró que con la línea celular adulta es posible generar con mayor eficiencia y calidad embriones clonados en bovinos. Para caracterizar la expresión génica en blastocistos (etapa peri-implantatoria) generados a partir de ambas líneas se empleó PCR tiempo final y real y se comparó ésta con los patrones de expresión de embriones producidos mediante fecundación in vitro (FIV). Se estudiaron los patrones de expresión de genes cruciales para el desarrollo embrionario, concluyendo que los mismos son diferentes entre las líneas celulares y entre éstas y los embriones de FIV. Los patrones de expresión génica de los embriones producidos con la línea celular adulta fueron más parecidos a los de los controles, por ello y por el mayor potencial de desarrollo hasta blastocistos de calidad, se seleccionó esta línea para la producción de embriones elongados (día 17) y de clones a términos. Se transfirieron a hembras receptoras embriones clonados producidos a partir de la línea celular adulta, así como controles producidos por FIV y se recolectaron al día 17. A partir de estos embriones, se estudiaron los patrones de expresión génica por técnicas de PCR tanto a tiempo real como final de los embriones elongados (etapa peri-implantatoria) clonados y de FIV, siendo diferencial la expresión entre ambos y ésta a su vez diferente con respecto a los blastocistos de día 7, tanto para FIV como para los clones. Estos hallazgos, así como la cuantificación de los niveles de expresión de algunos genes cruciales para el desarrollo embrionario temprano, constituyen los primeros reportes de su tipo en la literatura del tema. Adicionalmente se estudió a nivel global, la expresión génica en embriones clonados a partir de células adultas y producidos por FIV, mediante microarreglos, se encontraron más de mil genes expresados en ambos grupos y de éstos alrededor del 4% se encontró diferencialmente expresado (hiper o hipo expresión) en los embriones clonados. Los datos del microarreglo fueron validados por PCR cuantitativo (PCR tiempo real), lo cual a su vez ofreció resultados novedosos en el tema, al reportarse por primera vez los niveles de expresión de ciertos genes en embriones bovinos elongados. Como elemento final, se transfirieron embriones clonados a hembras receptoras, lográndose gestación en la mitad de las hembras transferidas, lo que redundó en el nacimiento de dos terneras clonadas. La eficiencia del proceso fue similar a la descrita para la técnica de HMC y para la especie bovina. A pesar de las pérdidas gestacionales observadas, que también coinciden con lo reportado para la especie, se logró por primera vez en Chile el nacimiento de terneros clonados viables.
Situación actual de la pleuroneumonía contagiosa porcina en planteles de cerdo de la zona centro-sur de Chile y estudio de la patogenicidad y respuesta inmune frente a un aislado nacional (418/07) de actinobacillus pleuropneumoniae.
(Universidad de Concepción., 2010) Muñoz Vergara, Dennis Wilson; Ruiz Garrido, Álvaro Rafael
En la última década la industria porcina nacional se ha desarrollado hasta convertirse en un área económica de importancia y con prometedores índices de crecimiento. Esto, ha promovido no sólo el aumento de la masa de animal, sino también una mayor vulnerabilidad frente a diversos agentes patógenos, dentro de los cuales los respiratorios tienen una importancia esencial, debido a que afectan principalmente a cerdos de engorda. Uno de los más importantes, sin lugar a dudas es Actinobacillus pleuropneumoniae (App), agente etiológico de la Pleuroneumonía Contagiosa Porcina (PCP).
Estudios de campo de mycoplasma hyopneumoniae, circovirus porcino tipo 2 y actinobacillus pleuropneumoniae, en planteles de producción intensiva de cerdos en Chile.
(Universidad de Concepción., 2012) Neira Ramírez, Víctor Manuel; Ruiz Garrido, Álvaro Rafael
En Chile, los cuadros asociados a Mycoplasma hyopneumoniae (M hyo), Circovirus porcino tipo 2 (PCV2) y Actinobacillus pleuropneumoniae (App), pueden ser considerados como los de mayor relevancia tanto a nivel respiratorio (M hyo, App), como sistémicos (PCV2), siendo ambos muy importantes desde el punto de vista económico y sanitario en Chile y el mundo. En el país es escaso el conocimiento científico de estos tres patógenos y, en general, existen muy pocas publicaciones que describan el estatus sanitario y existiendo principalmente solo reportes informales. Así el presente trabajo tuvo por objetivo contribuir al conocimiento de estos patógenos en Chile, con especial énfasis en conocer el estatus de sus infecciones y determinar la diversidad genética de estos. Lo anteriormente mencionado se llevó a cabo realizando cinco estudios. Dos de ellos se enfocaron en M hyo, los que tuvieron como objetivo determinar la prevalencia y dinámica de seroconversión de M hyo, utilizando ELISA, y determinar la diversidad y variabilidad genética del patógeno, secuenciando el gen de la proteína P146, en planteles de producción intensiva de mono y multisitio. Mediante otros dos estudios se estudió el cuadro de desmedro multisistémico post-destete (PMWS, por sus siglas en inglés) y PCV2 en Chile, analizando y describiendo lesiones según el sistema productivo. El conjunto de datos obtenidos permitió generar un modelo de regresión logística que ayuda a predecir el diagnóstico del cuadro y conocer la variabilidad genética de PCV2 obtenida de los cerdos positivos para PMWS, mediante secuenciación viral y PCRs selectivos. Finalmente, en el caso de App se estudió la variabilidad y distribución de serotipos en el país, evaluando aislados obtenidos desde mono y multisitios, utilizando una técnica rápida de PCR.
Evaluación de diferentes metodologías de administración y alternativas de vacunación contra Circovirus porcino tipo 2 y Mycoplasma hyopneumoniae en dos sistemas de producción porcina intensiva en Chile.
(Universidad de Concepción., 2014) Gutiérrez Jaramis, Cristian Andrés Arturo; Ruiz Garrido, Álvaro Rafael
Tanto en Chile como en el resto de los países del mundo con producción porcina intensiva, los cuadros patológicos asociados a la presencia de circovirus porcino tipo 2 (PCV2) y Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo) tienen gran influencia sobre el estado sanitario general de las piaras y por ende cobran especial relevancia como potenciales causantes de merma sobre el rendimiento económico de las unidades productivas. La vacunación contra estos patógenos se ha vuelto una práctica de rutina en los sistemas productivos y la implementación en terreno de este manejo demanda el uso de mano de obra calificada para la intervención de grandes poblaciones de animales en un acotado periodo de tiempo.
Detección y tipificación molecular de Staphylococcus aureus y Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) en Dakota del Norte, Estados Unidos.
(Universidad de Concepción., 2014) Velasco Pizarro, Valeria; Rojas García, Pedro Pablo
La emergencia y la propagación de patógenos resistentes a agentes antimicrobianos ha aumentado la preocupación en materia de salud pública a nivel mundial. El uso de antibióticos en producción animal, en profilaxis, terapia y promoción del crecimiento, se asocia a la emergencia de patógenos resistentes en el ganado. La exposición del ganado a dosis subterapéuticas de agentes antimicrobianos genera un reservorio de patógenos resistentes en los animales con el riesgo de transmisión a las personas a través de la cadena productiva de la carne. Uno de los patógenos que desarrolla rápidamente resistencia a múltiples agentes antimicrobianos (MR) es Staphylococcus aureus. En especial, las cepas de S. aureus resistente a meticilina (SARM) constituyen una causa importante de infecciones asociadas a hospitales (HA-MRSA), a la comunidad (CA-MRSA) y al ganado (LA-MRSA). La capacidad de colonizar las fosas nasales y piel de humanos y animales que posee S. aureus y la detección de cepas de SARM y S. aureus MR en animales de abasto y en carne, aumentan la probabiliadad de contaminación de los alimentos en las diferentes etapas de la cadena productiva. La resistencia a la meticilina se atribuye a la proteína de unión a la penicilina 2a (PBP2a) codificada en el gen mecA, que forma parte del casssette cromosómico estafilocócico mec (SCCmec). Esta proteína le confiere a las cepas de SARM una baja afinidad por antibióticos b- lactámicos. A su vez, las cepas CA-MRSA produccen generalmente la exotoxina Leucocidina de Panton-Valentine (PVL), la cual constituye un factor de virulencia asociado a infecciones de la piel y necrosis de tejidos. Por lo tanto, debido al impacto que pueden tener estas cepas de S. aureus en la salud humana, resulta relevante evaluar si los productos alimenticalimenticios pueden ser un foco de contaminación que facilite la propagación de estas infecciones. 2 El objetivo de este estudio fue establecer la prevalencia y los tipos moleculares de S. aureus y SARM en animales de abasto, carne cruda, productos cárnicos y humanos, determinando la relación filogenética entre las cepas. Se aisló S. aureus desde 167 muestras nasales de animales, 145 muestras de carne cruda y 46 muestras de productos cárnicos, utilizando una etapa de enriquecimiento selectivo en dos pasos, seguido de cultivo en placa. Los aislados que resultaron ser positivos se sometieron al análisis por PCR múltiple (PCRm) para identificar los genes: ARNr 16S (identificación de S. aureus), mecA (detección de SARM) y PVL (factor de virulencia asociado a CA-MRSA). Para la tipificación molecular de las cepas de S. aureus se utilizó electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) y tipificación de secuencias multilocus (MLST). El análisis de susceptibilidad antimicrobiana se llevó a cabo a través del método de microdilución en caldo. Además, se aisló e identificó S. aureus desde muestras de fosas nasales de 550 personas sanas a través de métodos de cultivo y análisis bioquímico. Un total de 108 aislados clínicos de cepas SARM obtenidos de pacientes hospitalizados se analizaron a través de PCRm para confirmar la presencia de S. aureus y detectar las cepas con los genes mecA y PVL. Se desarrolló un método de PCR múltiple en tiempo real con el fin de disminuir el tiempo de análisis de muestras de animales y carne y para aumentar la sensibilidad de detección de S. aureus y de los genes mecA y PVL. Este procedimiento se realizó con posterioridad al enriquecimiento primario y al secundario que preceden al cultivo en placa. Los resultados se compararon con el método de cultivo que incorpora el enriquecimiento selectivo en dos pasos para aislar S. aureus. Se analizó un total de 234 muestras a través de estos métodos (77 muestras nasales de animales, 112 muestras de carne cruda y 45 muestras de productos cárnicos). La prevalencia total de S. aureus determinada luego del análisis de las muestras por el método de cultivo con doble enriquecimiento fue de 34,7% en animales, siendo más alta en cerdos (50,0%) y corderos (40,6%) (P<0,05). En carne cruda la prevalencia fue de 47,6%, siendo más alta en carne de pollo (67,6%) y de cerdo (49,3%) (P<0,05). En productos cárnicos la prevalencia fue de 13,0% (Figura 1). Cinco muestras de carne de cerdo (7,0%) fueron positivas para el gen mecA, de las cuales tres correspondieron al serotipo ST398 y dos al serotipo ST5. Todas estas cepas exhibieron resistencia a la penicilina y cuatro fueron MR. En ninguna de las muestras se detectaron a través de PCRm los genes PVL.
Análisis molecular de la población de cerdos asilvestrados del Parque Natural Karukinka, tierra del Fuego, Chile: caracterización poblacional y relación con cerdos de crianza local.
(Universidad de Concepción., 2015) Aravena Bustos, Paula Verónica; Skewes Ramm, Óscar
En respuesta a la limitada información existente acerca de las poblaciones asilvestradas en Chile y la necesidad de contar con una base de conocimiento sobre la cual gestar estrategias de control, surge el presente trabajo de tesis doctoral. Mediante herramientas de análisis molecular, complementadas con investigación biológica, se interpretó la historia, estado actual y pronóstico esperable de la población de cerdos asilvestrados de Isla Tierra del Fuego, Chile. Entre el verano del 2010 y el otoño del 2011, se recopiló información a partir de encuestas y entrevistas, además de la indagación de signos inequívocos de la presencia de la especie en el sur de Tierra del Fuego (TDF). Posteriormente, se obtuvieron mediante caza, 37 ejemplares del suroeste (Timaukel) y cinco del sureste (Vicuña) del área de distribución. Se analizó la variación genética de la región control del ADN mitocondrial (D−loop) y 12 loci microsatélites de cada ejemplar silvestre incluidos 33 fetos, además de diez cerdos de crianza local. Sumado al análisis molecular, se indagó en las características fenotípicas, reproductivas, tróficas y estado sanitario general de la población en su distribución suroeste. En base a los resultados se identificó el origen de los cerdos asilvestrados de TDF a partir de dos líneas europeas diferentes, que apoyan diferentes eventos de introducción. El primero, originado a partir del ingreso de líneas europeas antiguas en el ecosistema natural de Timaukel, a finales del siglo XIX, con o sin un paso previo por Oceanía. Mientras que el origen de la población de Vicuña se relaciona con las primeras introducciones de cerdos iii europeos en el territorio fueguino argentino, habiéndose establecido primero en esa distribución, para luego migrar a Chile por el suroeste.Finalmente, se determinó que el diseño de un plan de control de esta invasora deberá considerar dos poblaciones que tienen en común el aislamiento, la baja variabilidad genética y el limitado número de individuos, que forman grupos matriarcales fecundados principalmente por un macho alfa y adaptados a la disponibilidad trófica. Se sugiere que es un buen momento para comenzar con un plan de control de este invasor. Debido a que la población asilvestrada de Timaukel colinda con estancias ganaderas y un pequeño centro urbano, es crucial que cualquier estrategia de control sea implementada con un enfoque social, y dado que la frontera Chileno−Argentina de Tierra del Fuego no limita el movimiento de cerdos de un país a otro, se recomienda la elaboración de un plan de acción binacional. Por otra parte, considerando la creciente importancia que tienen los recursos zoogenéticos en la gestión de la ganadería a escala mundial, esta población constituye un posible recurso zoogenético remoto.
Evaluación de la capacidad predictiva de los marcadores de pluripotencia en embriones bovinos bipartidos sobre el potencial de desarrollo embrionario peri-implantatorio.
(Universidad de Concepción., 2016) Velásquez Órdenes, Alejandra Estela; Rodríguez Álvarez, Lleretny
La producción in vitro de embriones ha sido ampliamente utilizada en diversas especies, no obstante, esta tecnología aún presenta limitaciones que afectan a la competencia del desarrollo embrionario. El reducido potencial de desarrollo es atribuido a la manipulación de los gametos y embriones, lo cual puede tener consecuencias en el desarrollo pre-implantatorio. En el estadio de blastocisto, el embrión experimenta cambios que son el resultado de una expresión génica estrictamente regulada. Existen genes que son cruciales para lograr un correcto desarrollo embrionario, y la ineficiencia en la producción de embriones podría estar causada por una desregulación en la expresión de estos marcadores. Por lo tanto, surge la necesidad de tener una cinética real de expresión génica de lo que pasa en el embrión tras continuar su desarrollo peri-implantatorio. Para ello, una alternativa es generar demi-embriones obteniendo así dos mitades que son cada una el reflejo genético de la otra. El objetivo de esta investigación es evaluar el uso de la bipartición en el estadio de blastocisto como método para validar la capacidad predictiva de los marcadores de pluripotencia sobre el potencial de desarrollo peri-implantatorio. Para establecer un protocolo de bipartición de blastocistos bovinos producidos por fecundación in vitro, se realizó la bipartición a los días 7, 8 ó 9 y estadios temprano, expandido y eclosionado. Se obtuvieron mayores tasas de sobrevida y viabilidad en ambos demi-embriones al bipartir blastocistos al D8 y D9. Sin embargo, se escogió el D8 de desarrollo y estadio de blastocisto eclosionado para los siguientes experimentos. Para determinar el efecto inmediato de la bipartición de blastocistos bovinos, se realizó evaluación morfológica (medición del diámetro y número total de células) y molecular (expresión génica mediante q-RT-PCR) de ambos demi-embriones. Aproximadamente un 70% de los pares de demi-embriones tenían similar tamaño y número total de células. No se observaron diferencias en los niveles de expresión entre ambos demi-embriones en todos los genes analizados (OCT4, SOX2, NANOG, CDX2, TP1 y BAX). Por lo que la bipartición de blastocistos bovinos genera demi-embriones al D9 con características morfológicas y moleculares similares. Para determinar el efecto tardío de la bipartición de blastocistos bovinos al día 13 de desarrollo in vitro, se realizó evaluación morfológica (medición del diámetro) y evaluación molecular (expresión génica mediante q-RT-PCR) de ambos demi-embriones generados. Sólo en el 63,6% de los demi-embriones generados no se encontraron diferencias en el diámetro de éstos. La evaluación molecular mostró diferencias en todos los genes analizados (OCT4, SOX2, CDX2, TP1, TKDP1 y EOMES), excepto BAX. Por lo que la bipartición de blastocistos bovinos producidos por fecundación in vitro genera demi-embriones al D13 con características morfológicas y moleculares diferentes. Además, se evaluó el efecto de la bipartición embrionaria sobre la capacidad de desarrollo peri-implantatorio, tanto in vitro como in vivo. Para el cultivo in vitro de los embriones, se consideraron dos condiciones (cultivo en plástico y co-cultivo en células endometriales). Los embriones cultivados en plástico, mostraron diferencias en el diámetro solo en el D9 y D10 de desarrollo. En cuanto a la expresión de los marcadores estudiados, se observó una tendencia a una mayor expresión en los embriones controles siendo esto significativo para los genes CDX2 y TP1. En el caso de los embriones co-cultivados con células endometriales, no se observaron diferencias en la sobrevida entre embriones bipartidos y controles hasta el D13 de desarrollo. Tanto los embriones bipartidos como controles tuvieron una curva de crecimiento similar donde se observó un crecimiento lineal desde el D9 hasta el D12, sin embargo a partir de este día se observó una disminución en el diámetro embrionario, similar en ambos grupos. En cuanto a la expresión génica, la expresión de TP1 es significativamente menor en los embriones bipartidos. Para evaluar el efecto de la bipartición en el desarrollo peri-implantatorio in vivo, se transfirieron demi-embriones y embriones (controles) a hembras receptoras, los cuales fueron colectados el D17 de desarrollo. No se observaron diferencias en la tasa de recuperación y en la longitud media de los embriones elongados entre ambos grupos. Además, se estudiaron los patrones de expresión génica individual (q-RT-PCR) y global (microarreglo). Se observó mediante q-RT-PCR una sub-expresión de los marcadores OCT4, SOX2, TP1 y EOMES en los embriones derivados de blastocistos bipartidos y se demostró mediante microarreglo, que la bipartición de blastocistos bovinos, afecta la transcriptómica de los embriones elongados al D17, principalmente regulando genes cruciales involucrados en la remodelación de la matriz, control del crecimiento y detoxificación y control del transporte de metabolitos. Finalmente, se demostró que la expresión de los marcadores de pluripotencia (OCT4, SOX2 y NANOG) en estadio de blastocisto, no se correlacionan positivamente con el potencial de desarrollo peri-implantatorio de embriones bovinos producidos por fecundación in vitro.
Identificación y caracterización de células madre mesenquimales en endometrio bovino durante el ciclo estral y postparto sano y con endometritis.
(Universidad de Concepción., 2017) Lara Navarrete, Evelyn Elia; Castro Reboredo, Fidel Ovidio
El objetivo de esta investigación fue identificar y caracterizar células madre mesenquimales en endometrio bovino a través del ciclo estral y en el postparto de vacas sanas y con endometritis. Por lo tanto, se plantea que el endometrio bovino presenta poblaciones de células madre mesenquimales y células progenitoras estromales que expresan marcadores de pluripotencia/multipotencia que varían en función del transcurso del ciclo estral y de la inflamación inherente a procesos patológicos puerperales. Este estudio permitió establecer un modelo animal para la obtención y caracterización de células madre mesenquimales en endometrio, lo que puede ser de gran utilidad en la obtención, identificación y caracterización de estas células en otras especies y/o potencial uso en medicina regenerativa.
Reprogramación de células somáticas de güiña (Leopardus guigna) mediante transferencia nuclear heteroespecífica utilizando ovocitos maduros de gata doméstica (Felis silvestris catus).
(Universidad de Concepción., 2018) Veraguas Dávila, Daniel Martín; Rodríguez Álvarez, Lleretny
Actualmente existe un aumento en los trabajos de investigación relacionados al desarrollo de técnicas de reproducción asistida en el gato doméstico con el propósito de implementar estas técnicas en especies de felinos amenazados. La güiña (Leopardus guigna) es una especie endémica de Chile, clasificada como vulnerable según la lista roja de la IUCN (International Union for Conservation of Nature). Debido a esto, la transferencia nuclear somática heteroespecífica (TNSh) podría ser una potencial herramienta para generar embriones de güiña utilizando ovocitos enucleados de gata doméstica y de esta manera a ayudar a su conservación. Sin embargo, los embriones generados por TNSh presentan un bajo potencial de desarrollo principalmente debido a una ineficiente reprogramación nuclear. Por lo cual la hipótesis de esta tesis fue “la transferencia de células somáticas de guiña a ovocitos de gata doméstica genera embriones clonados con similar morfología y expresión génica a los embriones clonados utilizando células de gato doméstico”. De acuerdo a los resultados obtenidos, se demostró que el tratamiento con 200 UI de eCG mejoró la calidad morfológica y el patrón de expresión génica de los complejos cúmulo-ovocito (CCOs) colectados. Por lo cual este protocolo fue seleccionado para la posterior generación de embriones. En cuanto a la sincronización del ciclo celular, se demostró que tanto los fibroblastos de gato doméstico como de güiña pueden sincronizarse en la fase G0/G1 por medio de los métodos de privación de suero e inhibición por contacto. Sin embargo, en el caso de los fibroblastos de güiña la exposición a estos tratamientos por más de tres días genera un efecto negativo sobre la viabilidad celular. Por lo cual, se eligió la privación de suero por no más de tres días para la sincronización celular. Adicionalmente, fue posible demostrar que los embriones de gato doméstico generados por FIV utilizando el tratamiento con eCG son capaces de desarrollarse tanto in vitro como in vivo, con la generación de crías vivas. Además, se demostró que la remoción de la zona pelúcida no afecta el potencial de desarrollo in vitro de los embriones de gato. Finalmente, se demostró que en los embriones de gato doméstico generados por TNS la agregación embrionaria mejora el potencial de desarrollo in vitro aumentando la tasa de blastocistos. En el caso de los embriones de güiña generados por TNSh, solo los xix embriones cultivados en agregado lograron alcanzar el estadio de blastocisto en un bajo porcentaje. Al realizar el análisis de expresión génica, se observó que los blastocistos clonados de gato doméstico presentaban una menor expresión de OCT4 en comparación a los blastocistos generados por FIV. Por otro lado, solo uno de los embriones de güiña generados expresó OCT4, sin expresar ninguno de los otros genes de pluripotencia y diferenciación evaluados. De acuerdo a los resultados obtenidos se puede concluir que el ovocito de gata doméstica es capaz de reprogramar las células somáticas de güiña a través de la TNSh. Sin embargo, la mayoría de los embriones clonados de güiña quedan detenidos en el estadio de mórula y solo un bajo porcentaje de estos logran alcanzar el estadio de blastocisto al ser cultivados en agregado. Lo cual se podría deber a una ineficiente reprogramación nuclear
Pre-condicionamiento in vitro de células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo equino, como herramienta para potenciar la adquisición de una mayor capacidad inmunomoduladora.
(Universidad de Concepción., 2018) Cabezas Salazar, Joel Gustavo; Castro Reboredo, Fidel Ovidio
El objetivo de este trabajo fue aislar MSC desde tejido adiposo y evaluar atributos biológicos e inmunobiológicos a travez del precondicionamiento con PGE2, Sustancia P e IFNγ (molécula precondicionante canónica). Aquí aislamos y caracterizamos con éxito las MSC derivadas de tejido adiposo. Dichas células mostraron morfología similar a los fibroblastos, crecieron en plástico, duplicaron los tiempos de población de 46.4 ± 3.38 h, se diferenciaron en tres linajes (osteo, condro y adipogénicos) después de inducciones apropiadas, migraron hacia la atracción de Suero Fetal Bovino y exhibieron un patrón de marcadores de superficie comúnmente aceptados para caballos MSC. Todas estas son propiedades de MSC. Las células fueron precondicionadas con PGE2, SP e IFNγ y se evaluó la capacidad de las MSC de regular poblaciones de PBMC y la secreción de proteínas bajo estos estímulos. El precondicionamiento resultó en una mantención de las propiedades biológicas de las MSC virgen al precondicionarlas con PGE2 y SP, pero no así con IFNγ y un aumento en las propiedades inmunobiológicas de las MSC bajo los estímulos con PGE2 y SP, tratamiento que resultó ser el que mayor efectos inmunomoduladores generó sobre las MSC, como una mayor capacidad de inhibir poblaciones de PBMC activadas, producción de linfocitos T reguladores (CD4, CD25 y FOXP3)+ y un patrón de secreción de proteínas totamente diferente al estado virgen de éstas células, resultando en el primer análisis conocido de este tipo en MSC de equinos. En conclusión, las MSC derivadas de tejido adiposo equino, pueden ser precondicionadas in vitro, con el tratamiento de PGE2 y SP, para adquirir características que le otorgen un licenciamiento inmunológico más potente sin perder sus características biológicas de MSC. Posiblemente IFNγ, la molécula canónica para otorgar este licenciamiento en MSC, no resulta ser para las MSC equinas.
La competencia de embriones bovinos producidos in vitro modifica la señalización embrionaria mediada por vesículas extracelulares.
(Universidad de Concepción., 2018) Mellisho Salas, Edwin Alberto; Mellisho Salas, Edwin Alberto
Las vesículas extracelulares (EVs) secretadas por los blastocistos pueden ser relevantes, como un buen predictor de la competencia de los embriones producidos in vitro. El objetivo de este trabajo fue determinar el perfil de mi ARN contenido en EVs secretadas por embiones bovinos con diferente velocidad de desarrollo in vitro y competencia pre-implantatoria. El trabajo fue abordado con dos experimentos. El primer experimento fue para identificar y caracterizar las EVs secretadas por embiones bovinos pre-implantatorios. Para esto se consideró la secreción durante la etapa de desarrollo posterior a la blastulación (día 7-9 de desarrollo in vitro) y se incluyeron solo embriones protuidos para eliminar el efecto de la zona pelúcida. Además, se consideraron embiones producidos in vitro utilizando dos tecnologías que producen embiones con diferente competencia: 1) partenogénicos (PA), menos competentes y 2) fecundación in vitro (IVF), más competentes. Un segundo experimento fue para realizar una determinación no invasiva de competencia embionaria considerando características de poblaciones de EVs secretadas durante la etapa de blastulación y parámetros morfocinéticos del embrión. Para esto, los embriones fueron cultivados en grupos, hasta el día 5 de desarrollo in vitro, en este momento se seleccionaron las mórulas, las cuales se cultivaron individualmente en SOFaa depletado hasta el día 7.5. Durante este periodo los embriones fueron monitoreados para determinar el momento de la aparición del blastocele, como indicador cinético de desarrollo embrionario: 1) blastulación temprana (EB: Día 6.5) y 2) blastulación tardía (LB: Día 7.5). Al día 7.5, se determinaron las características morfológicas de los blastocistos siguiendo los criterios de la IETS. Al día 7.5, se colectó individualmente el medio de cultivo, se identificó con el embrión correspondiente y se conservó a -80 °C para posteriores análisis.Los blastocistos evaluados (día 7.5) fueron transferidos a medio SOFaa dep fresco hasta el día 11 de desarrollo in vitro para determinar su potencial de desarrollo post-eclosión, de acuerdo a su crecimiento. A los parámetros tamaño y concentración de EVs generados por Nano Tracking Analysis (NTA), se les realizó análisis de varianza y la comparación de medias test HSD. Posteriormente, las variables de morfología del blastocisto y características morfológicas de las EVs fueron sometidas a análisis de componentes principales (PCA) y análisis de conglomerados (CA) para la posibilidad de discriminar los grupos de embiones. Finalmente, se utilizó un análisis de regresión logística binaria, para construir modelos no invasivos de predicción de competencia embrionaria. El análisis estadístico se realizó con el programa SAS versión ocho para Windows y programa IBM SPSS Statistics versión 19. En el experimento 1, el análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM) reveló la presencia de vesículas heterogéneas de diferentes tamaños y población: microvesículas (MVs) y exosomas (Exs) de forma redondeada, encerrados por una capa doble de lípidos y con un rango de 30 a 385 nm de diámetro. Además, el análisis de citometría de flujopermitió identificarproteínas de superficie CD63 y CD9 como marcadores de EVs. El NTA generó datos sobre las características morfológicas de las EVS, tamaño y concentración. El perfil (concentración y tamaño) de partículas secretadas por embriones derivados de IVF, fue diferente a las secretadas por embriones PA. En el experimento 2, las características morfológicas de los blastocistos se diferenciaron estadísticamente de acuerdo con el momento de blastulación y competencia por su tamaño y calidad. Los embriones más competentes del grupo de blastulación temprana secretaron EVs con mayor tamaño (122.9 nm), mientras que la mayor concentración de EVs (5,75 x 10 [9] partículas / ml) correspondió al grupo no competente. La secuenciación de ARN pequeños mostró un total de dos biotipos, miARN (86 a 91%) y snoARN (9 a 14%). Además, se identificó un total de 182 miARN y 31 snoARN. El análisis de expresión diferencial de miARN entre blastocisto competente versus no competente, mostró 12 miARN regulados positivamente y 15 miARN regulados negativamente. Posteriormente, utilizando una regresión logística binaria, se construyó un modelo no invasivo para predecir la competencia embrionaria basada en una combinación de variables morfocinéticas de blastocisto y las características de EVs los cuales mostraron un alto ROC-AUC de 0.853. En conclusión, en este trabajo se demostró que los blastocistos bovinos secretan MVs/EXs a los medios de cultivo y esta secreción tiene características que varía dependiendo de la competencia embrionaria previa a la implantación, por lo tanto, es posible generar un nuevo modelo predictivo no invasivo de alta eficiencia para la selección de embriones bovinos.
El complejo Ornithonyssus bacoti (Acari: Mesostigmata) de roedores de Chile diversidad genética, variaciones morfológicas y patógenos asociados.
(Universidad de Concepción., 2019) Silva de la Fuente, María Carolina; González Acuña, Daniel A.; Moreno Salas, Lucila del Carmen
Un complejo de especies corresponde a especies morfológicamente indistinguibles, pero que presentan distintos linajes evolutivos. Estos complejos serían más frecuentes de encontrar en animales invertebrados, los que utilizan principalmente medios químicos o táctiles para el apareamiento, no así diferenciaciones morfológicas. En el caso de artrópodos vectores, es relevante resolver estos complejos de especies debido a que la incorrecta identificación de una especie, podría ocasionar graves problemas relacionados con salud pública. La presente investigación utilizó como modelo de estudio a los ácaros del genero Ornithonyssus s.l. (Acari: Mesostigmata), actualmente constituido por 13 especies, y considerado un complejo de especies, principalmente producto de su similitud morfológica, lo que genera continuos cambios en su clasificación. Tanto el género Ornithonyssus como O. bacoti son reconocidas por parasitar principalmente roedores, sin embargo, O. bursa, O. sylviarum, O. wernecki, O. aridus y O. bacoti parasitan al humano, siendo consideradas como potenciales vectores mecánicos y/o biológicos de patógenos. En Chile solo se ha reportado la especie O. bacoti en roedores silvestres y sinantrópicos, sin embargo, reconociendo la diversidad geográfica y diversidad de roedores presentes, se espera encontrar más de una especie de ácaro del género Ornithonyssus a través de la distribución de sus hospedadores en Chile, los que a su vez albergaran diferentes especies de patógenos asociados a estos. El objetivo principal de este estudio es evaluar el estatus taxonómico de los ácaros Ornithonyssus presentes en roedores de Chile y determinar la presencia de bacterias del género Rickettsia, Borrelia y/o Bartonella, potencialmente patógenas para hospedadores silvestres y/o humanos. Para ello se visitaron 14 localidades a lo largo de Chile (18°19'34,08''S-70°00'31,86''O a 47°07'41,00''S-72°30'18,50''O) y se capturaron roedores desde los cuales se extrajeron los ácaros, los que se sometieron a análisis moleculares (Inferencia Bayesiana y Red de Haplotipos), morfológicos y morfométricos, comparando 40 medidas anatómicas. Se identificaron dos nuevas especies para el género Ornithonyssus, Ornithonyssus nov. sp. 2 y Ornithonyssus nov. sp. 3 con un 8,4% y un 7,2% de distancia genética con respecto a O. bacoti, respectivamente, y una v especie afín a O. bacoti con un 4% de distancia genética en relación a O. bacoti. Dentro de los caracteres morfométricos que las distinguen destaca el largo del peritrema, largo de pata I, largo de pata IV, largo de placa dorsal y la forma del epistome. Por lo tanto, se desca que las especies propuestas en este estudio pueden ser diferenciadas por caracteres morfométricos y morfológicos, además de los moleculares. Respecto a las bacterias, se identificó sólo una genoespecie de Bartonella (con gen 16S ARNr) presente a lo largo de los puntos de muestreo. De este modo, la presente investigación proporciona caracteres útiles de las especies de Ornithonyssus presentes en Chile e indica el eventual rol de estas especies en la mantención de bacterias que posiblemente pueden estar asociadas a agentes patógenosarta la existencia de un complejo de especies Ornithonyssus en Chile, debido
Plasticidad de células felinas diferenciadas y su transición a mayores niveles de potencia.
(Universidad de Concepción., 2019) Echeverry Berrío, Diana Maritza; Castro Reboredo, Fidel Ovidio
La obtención de células madre mesenquimales (MSC) en algunas ocasiones puede ser un procedimiento invasivo en los felinos, particularmente cuando existen patologías, traumas o situaciones específicas en las cuales está contraindicado el procedimiento quirúrgico para obtener biopsias de tejido. La inducción de células somáticas diferenciadas hacia células madre mesenquimales es una herramienta recientemente descrita en humanos y ratones, la cual promete ser exitosa y evadir las complicaciones descritas. Esta metodología se basa principalmente en modificar la expresión génica de las células diferenciadas con el uso de remodeladores epigenéticos, factores de crecimiento y pequeñas moléculas que facilitan la reconversión o de-diferenciación para la obtención de un mayor nivel de potencia. El objetivo del presente estudio fue evaluar la plasticidad de dos tipos celulares de origen felino, fibroblastos y células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo (AMSC), frente a varios protocolos de inducción a multipotencia. Para lograr este objetivo se emplearon dos remodeladores epigenéticos, el ácido valproico y la 5-azacitidina, junto con plasma rico en plaquetas como fuente de factores de crecimiento, factor de crecimiento epidermal y factor de crecimiento derivado de plaquetas para conferir características multipotentes a las células reprogramadas. En este estudio también se produjo el factor de crecimiento derivado de plaquetas (h-PDGF-B) por transfección estable de células mamíferas. Los fibroblastos y AMSC fueron obtenidos de gatas domésticas entre 6 meses y 3 años. Los protocolos fueron estandarizados y se evaluó su efectividad en inducir características multipotentes reflejadas en expresión de genes de pluripotencia, marcadores de superficie y capacidad de diferenciación mesodérmica. La expresión de OCT4 incrementó significativamente en fibroblastos felinos (p < 0,05), así mismo se logró la diferenciación hacia linajes mesodérmicos (adipogénesis, condrogénesis y osteogénesis) con el uso del protocolo de reprogramación con 5AZA y VPA durante 12 días. Otros tratamientos arrojaron resultados parciales, confiriendo aumento en la expresión de OCT4 y/o capacidad limitada de diferenciación hacia uno o dos linajes mesodérmicos. Las AMSCs por su parte no presentaron cambios significativos en la expresión de genes o potencial de diferenciación con el uso de los remodeladores epigenéticos, con excepción de potenciar la diferenciación osteogénica con el pretratamiento con estas moléculas. Los resultados obtenidos demuestran que las células somáticas felinas presentan determinada plasticidad que puede ser aprovechada para diferentes eventos de reprogramación celular, en este caso, para obtener un estado multipotente o favorecer la diferenciación hacia determinado linaje mesodérmico. Sin embargo, este protocolo requiere algunos ajustes en orden de lograr una mayor eficiencia de reprogramación de fibroblastos hacia iMSCs. Estos resultados son de importancia para en el área de la medicina regenerativa y otras aplicaciones biotecnológicas en especies de la familia Felidae.
Distribución, prevalencia y filogeografía de Haemoproteus y Plasmodium en aves del orden Passeriformes en el cono sur de Sudamérica.
(Universidad de Concepción., 2019) Doussang Ortiz, Daniela Ivonne; González Acuña, Daniel A.
Los hemosporidios aviares son protozoos de distribución mundial, transmitidos por vectores (dípteros). Plasmodium y Haemoproteus son los más comunes en aves y son causantes de malaria y pseudomalaria respectivamente. Su distribución, prevalencia y diversidad pueden estar influenciadas por factores bióticos y abióticos, tales como; altitud, latitud, relación parásito-hospedador y barreras biogeográficas como la Cordillera de los Andes. Este estudio tiene como objetivos (1) determinar distribución, prevalencia y diversidad de Plasmodium y Haemoproteus en aves silvestres del orden Passeriformes principalmente de Chile y Argentina, y compararlos con los ya descritos en Sudamérica; (2) Analizar factores bióticos y abióticos que puedan estar influenciando la prevalencia, distribución y diversidad de los haplotipos de Plasmodium y Haemproteus; (3) evaluar el efecto del aislamiento producido por la cordillera de los Andes en la distribución y diversidad de los haplotipos de hemoparásitos de aves; (4) y asignar las especies morfológicas analizadas con sus haplotipos. Para desarrollar estos objetivos, se extrajo sangre de aves desde distintas localidades de Chile, para la detección de Haemoproteus y Plasmodium a través de técnicas de diagnóstico tradicionales (microscopía óptica) y PCR utilizando el gen de citocromo b mitocondrial. Además fueron adicionadas al análisis muestras obtenidas de tejidos (sangre, músculo, hígado o corazón) de chincol (Zonotrichia capensis) provenientes de “Museo de Luisiana”, Estados Unidos y otras muestras de colección de tejidos (sangre y músculo) de Passeriformes de “Museo Argentino de Ciencias Naturales Bernandino Rivadavia”, Buenos Aires, Argentina.
Valoración de las propiedades biológicas de las MSCs equinas aisladas de diferentes tejidos y su potencial uso terapéutico en endometritis en yeguas.
(Universidad de Concepción., 2020) Navarrete Aguirre, Felipe Ignacio; Castro Reboredo, Fidel Ovidio
El uso de terapias en base a células madre mesenquiales (MSC), está ampliamente descrito en equino, sin embargo, la mayoría de estas terapias se basan en el tratamiento de lesiones musculo esqueléticas, y en menor medida como uso potencial en afecciones reproductivas. En este estudio se evaluó el efecto de dos fuentes diferentes MSC obtenidas a partir del mismo donante sobre sus principales características biológicas in vitro y sus propiedades anti inflamatorias y anidamiento in vivo en yeguas con endometritis inducida post monta (PMIE). Se aislaron MSC equinas desde endometrio y tejido adiposo (ET-MSC y AT-MSC respectivamente) a partir de los mismos donantes. Las células mostraron rasgos característicos de MSC incluyendo la adherencia al plástico, marcadores de superficie, potencial de migración, así como la diferenciación mesodérmica clásica, además de lograr diferenciaciones neurogénica y cardiomiogénica. Se evaluó la influencia del origen celular en su perfil trascriptómico. Para esto se aisló y secuenció el ARN celular y se obtuvieron vesículas extracelulares (VE) a partir de un medio de cultivo celular libre de VE, y se analizó su carga de microARN (miARN) mediante secuenciación. Se analizó y comparó la expresión diferencial de ARNm y miARN-EV, así como las vías y procesos más representados en cada origen celular. Se identificaron un total de 125 genes regulados positivamente, 51 regulados negativamente y 31 miARN expresados diferencialmente entre células de ambas fuentes. Sobre la base de la secuenciación del ARNm, las ET-MSC mostraron una mayor expresión de genes involucrados en las vías de señalización Hippo, TGF-β y pluripotencia. Junto con esto, las vías involucradas en la reorganización de la matriz extracelular fueron las más representadas en la carga de miARN de las VE secretadas por ET-MSC. El nicho desde el que se originó la MSC definió el perfil transcriptómico de las células, incluida la secreción de VE específica de linaje para garantizar una comunicación y homeostasis adecuada. Posteriormente se evaluó y comparó el potencial uso de MSC de ambas fuentes como herramientas antiinflamatorias para PMIE, para esto se infundieron intrauterinamente (IU) MSC marcadas en yeguas con PMIE para evaluar su acción antiinflamatoria y anidamiento. Se indujo PMIE en nueve yeguas ginecológicamente sanas mediante la infusión IU de 500 millones de espermatozoides muertos en solución salina. Se analizaron marcadores de inflamación en lavados uterinos y biopsias antes (fase I) y 3 h después de la infusión de espermatozoides (fase II). Las mediciones llevadas a cabo fueron: conteo de células polimorfonucleres (PMN), proteínas IL-6 y TNF-α (ELISA en los lavados) e inmunotinción en biopsias, transcritos de IL-1α, 6, 8, 10, TNF-α y COX 2 (RT-qPCR de lavados). A las 24 h después de la deposición de espermatozoides (fase III), se infundio a las yeguas 20 ml IU de solución salina que contenía 2× 107 AT-MSC (n = 3, grupo 1) o ET-MSC (n = 3, grupo 2). Las células se marcaron previamente con el éster succinimidíl diacetato de carboxifluoresceína (CFDA SE). Un tercer grupo (n = 3) recibió solo 20 ml de solución salina estéril. Después de 48 h se realizó otra biopsia / lavado y se analizaron los mismos parámetros descritos anteriormente. Para evaluar el anidamiento, se tomaron biopsias adicionales en los días 10 y 30 post inoculación de MSC y se analizaron mediante microscopía confocal. Los espermatozoides muertos en solución salina aumentaron notablemente los recuentos de PMN, la expresión de IL-6 y TNF-α en el ELISA (p <0,05) y la inmunotinción. En la fase III se encontró una reducción significativa (p <0,0001) de PMN en todas las muestras, incluidas las yeguas control. Mediante ELISA se detectó una disminución (p <0,05) de IL-6 y TNF-α, en los grupos que recibieron MSC, pero no en el grupo control. En el grupo tratado con AT-MSC, se encontró una disminución significativa en la expresión de (IL-1α, p = 0,0003; IL-6 p 0.04; IL-8, p = 0.006, TNF-α p = 0.004). La expresión de IL-10 y COX-2 se mantuvo sin cambios (p = 0,08). En las yeguas que recibieron ET-MSC, IL-6, IL-8 y TNF-α disminuyeron significativamente (p = 0.01), IL-10 aumentó (p = 0.009), mientras que COX-2 e IL-1α no cambiaron significativamente su expresión. Mientras que el análisis de anidamiento, el marcaje con CFDA se encontró con moderación en todas las muestras analizadas hasta el día 30, principalmente en el compartimento estromal del endometrio. No se encontraron diferencias en el patrón de anidamiento entre los orígenes celulares. La inoculación de MSC redujo significativamente la inflamación independientemente del origen de las células y que las células realizan un recorrido limitado detectable después de un mes de infusión. Estos hallazgos pueden ser de ayuda para el diseño de nuevas terapias antiinflamatorias de enfermedades uterinas en yeguas.
Desarrollo y evaluación de un prototipo de vacuna contra Circovirus Porcino tipo 2 (PCV2) utilizando Pichia pastoris.
(Universidad de Concepción., 2020) Villamil Pérez, Aura Milena; Ruiz Garrido, Álvaro Rafael; Toledo Alonso, Jorge Roberto
El Circovirus porcino tipo 2 (PCV2) representa una preocupación crucial dentro de la industria porcina a nivel mundial y en Chile, específicamente, los sistemas intensivos de producción de cerdos se han visto obligados a ir a la vanguardia en la implementación de programas de vacunación que permitan mantener controlada la enfermedad. Sin embargo, así como las enfermedades asociadas a este patógeno generan pérdidas económicas importantes, las vacunas también conllevan costos elevados dentro de los planteles, por lo que en los últimos años, el desarrollo de vacunas recombinantes ha tomado fuerza, tendiendo en cuenta que se pueden utilizar microorganismos para la obtención de proteínas específicas. Es el caso de la levadura Pichia pastoris que, debido a sus ventajas productivas, se ha convertido en una herramienta llamativa para la producción eficaz de proteínas recombinantes. El objetivo de esta investigación consistió en generar una formulación vacunal que estimulara en los cerdos, bajo condiciones controladas, la respuesta celular y humoral contra PCV2. Inicialmente, se evaluó la producción de las proteínas expresadas en la levadura P.pastoris MP36 analizando clones transformados y a partir de ellos, se obtuvieron dos proteínas: por una parte y en el interior de la célula, la proteína de una quimera de la cápside de PCV2, ya que es considerada como dominante para la inmunogenicidad del virus en el animal; y por otra, el interferón alfa porcino (IFNα) en el medio extracelular, debido a su característica actividad antiviral y efecto inmunopotenciador. A partir de dichas proteínas, se preparó la formulación vacunal utilizando el adyuvante comercial Montanide 15AVG. Posteriormente, se realizaron ensayos con cerdos provenientes de un plantel comercial chileno, para evaluar la efectividad del uso del IFNα en la preparación vacunal. Estos animales fueron trasladados a instalaciones de la Universidad de Concepción, campus Chillán, teniendo cuidado de no afectar su bienestar y normal desarrollo. Se llevaron a cabo las inmunizaciones para comparar la dosis de la formulación vacunal con respecto a su seguridad en cerdos y además, para determinar su potencia. Adicionalmente, se realizó un desafio con la finalidad de poner a los animales en contacto con el virus, replicar la enfermedad y comparar a los animales infectados clínicamente con los animales protegidos. La formulación vacunal desarrollada, utilizando la quimera de la cápside (sin el IFNα), indujo en los cerdos una respuesta inmune contra PCV2, elevando los valores S/P y disminuyendo la carga viral; no obstante, la seroconversión no se dio de manera clara.
Caracterización molecular, evaluación de factores de virulencia y habilidad de adherencia de Staphylococcus aureus aislados desde leche de estanque y superficies del equipo de ordeño en operaciones lecheras.
(Universidad de Concepción., 2020) Pachá Becerra, Paulina Andrea; Latorre Soto, Alejandra A.; Muñoz Domon, Marcos
El objetivo de la presente investigación fue evaluar la diversidad de cepas, factores de virulencia y habilidades de adherencia de S. aureus identificados desde leche de estanque (BTM) y adherencias macroscópicas en superficies de equipo de ordeño en contacto con leche durante el ordeño o enfriamiento de la leche (AMES). Un total de 30 lecherías de la Región de Ñuble fueron incluidas en este estudio. Por rebaño, 3 muestras consecutivas de BTM se recolectaron, correspondientes a una ordeña, y se realizó una inspección del equipo de ordeño en busca de AMES para la detección de S. aureus. Los aislados de S. aureus se subtipificaron por patrones de bandas obtenidos por enzima de macrorestricción SmaI y gel de electroforesis de campo pulsado (PFGE), y además se caracterizaron los patrones de virulencia (PV) y habilidad de adherencia in vitro en superficie de poliestireno. Para la caracterización del perfil de virulencia, genes de importancia en IMI (nuc, coa, fnbA e icaA e icaD) y de importancia en salud pública (resistencia a meticilina, genes mecA y mecC, y genes de enterotoxinas sea y seb) fueron incluidos. En cepas de S. aureus frecuentemente identificados entre lecherías y muestras se evalúa la habilidad de adherencia en microplacas de poliestireno (MPA). Un total de 226 aislados de S. aureus fueron identificados en 23 lecherías y 166 seleccionados para la evaluación de subtipificación por PFGE. Se observó un total de 42 pulsotipos; de los cuales 23 corresponden a pulsotipos principales (A-W) y 19 subtipos. Entre lecherías de la región se identificó una alta heterogeneidad de cepas de S. aureus (diversidad según índice de Simpson [SID] = 0, 99). De los 42 pulsotipos identificados entre las lecherías, 8 de ellos (A, A.1, B.1, D, E, J, K, N, Q) fueron identificados en lecherías diferentes. Estos pulsotipos distribuidos entre lecherías podrían indicar factores asociados que permiten el movimiento de microorganismos entre lecherías geográficamente distanciadas. Dentro de las lecherías, la diversidad de S. aureus fue variable (valores SID de 0 a 1). En 7 lecherías positivas a S. aureus en AMES y BTM, se identificó clonalidad entre pulsotipos de S. aureus de AMES y BTM. Esto podría sugerir que las adherencias presentes en las superficies de ordeño pueden tener un rol importante como potencial fuente de éste microorganismo en BTM. Al realizar la evaluación de los PV de los 166 aislados de S. aureus, se identificaron 5 perfiles de virulencia, donde el perfil nuc (+) coa (+) fnbA (+) icaA (+) icaD (+) mecA (-) mecC (-) sea (-) seb (-) fue el más frecuentemente observado, detectándose en 21 de los 23 pulsotipos principales y en 21 de las 23 lecherías S. aureus (+). No se encontraron diferencias estadísticamente significativa entre los perfiles de virulencia de los aislados de S. aureus de BTM y AMES. Los perfiles de virulencia observados con mayor frecuencia incluyeron genes involucrados en la adherencia y la capacidad de formación de biopelículas de S. aureus, lo que podría representar una ventaja potencial para la bacteria durante las primeras etapas de la IMI y para la persistencia en las superficies. Para la evaluación de adherencia se seleccionaron 24 cepas de S. aureus frecuentemente identificados desde 19 lecherías de la región de Ñuble, identificando 6(25%), 14(58.3%), y 4(16.6%) cepas con alta, mediana y baja adherencia, respectivamente. No se encontraron diferencias significativas en la habilidad de adherencia de poliestireno de cepas identificadas desde BTM-AMEs y sólo de BTM. La presente investigación señala que cepas de S. aureus presentes en BTM y AMES podrían tener una dinámica diferente dentro de los rebaños lecheros. Resaltando la importancia de comprender la epidemiología de S. aureus leche de estanque y en superficies en contacto con leche con el fin de identificar estrategias a considerar en el control de este patógeno intramamario y potencial patógeno humano.
Evaluación del impacto de la exposición prenatal a un exceso de testosterona sobre la estructura y funcionalidad del páncreas endocrino en ovejas.
(Universidad de Concepción., 2020) Carrasco Morales, Albert Ronald; Recabarren Morgado, Sergio
El feto es un individuo con un potencial genético determinado durante la fecundación. Sin embargo, el fenotipo que adquirirá este individuo depende de la forma en que se exprese su patrimonio genético en función del cómo el ambiente module este proceso. Por ello, las características morfológicas y fisiológicas que tendrá un individuo pueden ser modificadas de acuerdo a las condiciones y las exigencias del ambiente, en función del genoma que este alberga para asegurar la sobrevivencia, proceso conocido como plasticidad. Varias sustancias son capaces de modificar el entorno en el que un individuo vive, incluso durante la vida embrionaria y fetal, provocando una desviación en el desarrollo denominada reprogramación. Entre estas sustancias, la exposición fetal a un exceso de testosterona es un fenómeno que provocaría una reprogramación del desarrollo de este individuo incrementando el riesgo a que padezca diabetes mellitus tipo 2 durante la vida adulta. El objetivo del estudio fue evaluar el efecto de la administración de testosterona, en ovejas gestantes, sobre la fisiología de la madre, las variables morfológicas y endocrinometabólicas de los fetos hembra, la sensibilidad de los tejidos a la insulina en distintas etapas de desarrollo somático (26, 30 y 38 semanas de edad) y el efecto de la administración de testosterona en hembras adultas enteras y ooferectomizadas sobre la sensibilidad a la insulina y la estructura y funcionalidad del páncreas endocrino. Para esto, un rebaño de ovejas adultas de 2-3 años de edad fueron cruzadas con machos de fertilidad probada. El día 28 tras la cruza se confirmó la gestación por ultrasonografía y las hembras preñadas fueron separadas en dos grupos considerando las variables peso y edad como criterios de selección. Un grupo de estas hembras fue sometido a un protocolo de androgenización, que consistió en la administración por vía intramuscular de una solución de propionato de testosterona disuelta en aceite de maravilla, dos veces por semana, en dosis de 30 mg/oveja desde el día 30 al 90 de gestación y 40 mg/oveja desde el día 91 al 120 de gestación (Madres-T). Otro grupo de hembras gestantes (Madres-C) sólo recibió el vehículo en el que se diluyó la testosterona durante el periodo experimental. Desde la cuarta a la decimoséptima semana de gestación las hembras gestantes fueron pesadas y se colectaron muestras de sangre yugular desde las que se determinaron distintas variables endocrino-metabólicas. A los 120 días de gestación en un grupo de hembras preñadas se realizó una cesárea en la que se extrajeron los fetos hembra, éstos fueron pesados y se registraron las medidas zoométricas, se colectó una muestra de sangre yugular para realizar análisis endocrinos y metabólicos. Otro grupo de hembras preñadas parieron y las crías hembra fueron empleadas en los siguientes experimentos. En estas crías, a las 26 semanas de edad (periodo considerado peripuberal), se realizó un test de tolerancia a la glucosa endovenosa (TTGEV) durante la fase folicular del ciclo estral. Tras este estudio la mitad de las hembras de cada grupo fueron ooferectomizadas. A las 30 semanas de edad (periodo considerado como postpuberal temprano) se realizó un segundo TTGEV en las hembras enteras y ooferectomizadas control y expuestas prenatalmente a un exceso de testosterona (EPT) para evaluar el efecto de los esteroides endógenos de origen ovárico sobre la sensibilidad a la insulina.
Trematodos Schistosomatidae en Anseriformes y moluscos dulceacuícolas del centro y sur de Chile: Agentes de la dermatitis cercarial humana.
(Universidad de Concepción., 2022) Oyarzún Ruiz, Pablo Enrique; Moreno Salas, Lucila del Carmen
Los esquistosomas son trematodos sanguíneos de la familia Schistosomatidae, compuesto por 13 géneros parasitando aves dulceacuícolas y marinas como sus hospederos definitivos, y caracoles acuáticos como hospederos intermediarios. Son responsables de un cuadro zoonótico conocido como dermatitis cercarial (DC), el cual ocurre por la penetración de furcocercarias liberadas por los caracoles hospederos. El género Trichobilharzia es considerado el mayor responsable de los brotes de DC en seres humanos en el mundo. Estos trematodos han sido ampliamente estudiados en el hemisferio Norte, donde se han determinado áreas de endemia de la parasitosis, y recientemente se ha planteado como una enfermedad re-emergente, o incluso emergente en áreas de poca atención. Esto último es el escenario existente en el Neotrópico, donde las principales investigaciones sólo provienen de Argentina y Brasil, no obstante, la sistemática de estos parásitos sigue siendo, en general, pobremente abarcada. Si bien en Chile existe un brote de dermatitis cercarial reportado, y otros dos registros de esquistosomas en aves silvestres, la identificación específica de dichos esquistosomas en cada caso es desconocido a la fecha. En la presente tesis doctoral se plantearon dos hipótesis: (1) "Si la mayoría de los registros de esquistosomas aviares en Sudamérica provienen de la familia Chilinidae, entonces los hospederos intermediarios de estos trematodos en los sitios a muestrear en las zonas centro y sur de Chile corresponden a representantes de dicha familia" y (2) “Teniendo en consideración la especificidad de los esquistosomas aviares entre diferentes especies de anátidos, las comunidades de esquistosomas de patos y cisnes de cuello negro son distintas”. Para poner a prueba ambas hipótesis, se colectaron un total de 2284 caracoles dulceacuícolas de cinco familias provenientes de las regiones del Ñuble, Biobío y Los Ríos. Estos fueron estimulados para liberación cercarial y diseccionados para determinar la presencia de esporoquistes. Además, con el fin de determinar la presencia de esquistosomas viscerales como nasales, se realizó la necropsia parasitaria de 95 anátidos de cinco especies distintas procedentes de las regiones antes mencionadas. Los parásitos colectados fueron caracterizados morfológica y molecularmente considerando los genes 28S y COI. Del total de caracoles analizados, 35 caracoles de la especie Chilina dombeyana (Chilinidae) (Prevalencia= 1,53%) provenientes de la Laguna Chica de San Pedro (región del Biobío) resultaron parasitados con tres linajes distintos de esquistosomas aviares (Linajes I, II y III), dos de los cuales (I y II) fueron caracterizados molecularmente. Esta prevalencia coincide con lo reportado previamente en otras áreas geográficas. Desde el punto de vista filogenético, el Linaje I fue conespecífico con un taxón descrito desde Cygnus melancoryphus en Argentina, Nasusbilharzia melancorhypha. Mientras que el Linaje II no formó parte de ningún clado de género conocido y, por lo tanto, con el potencial de corresponder a un taxón nuevo. En el caso de las aves, 58 (Prevalencia= 61,05%) de ellas albergaron esquistosomas, con cada especie resultando parasitada con al menos un taxón de esquistosoma aviar visceral y/o nasal. En el caso de los viscerales se describieron cinco taxones para el género Trichobilharzia y cuatro para Dendritobilharzia. Mientras que en los nasales se describió un taxón del género Trichobilharzia y otro de Nasusbilharzia. Todos los taxones descritos, con excepción de los relacionados a Dendritobilharzia, obtuvieron soportes robustos en los análisis filogenéticos de ambos genes. Además, se expandió la distribución geográfica conocida de Trichobilharzia querquedulae y N. melancorhypha a Chile. Así mismo, se entrega evidencia sobre la especificidad de ciertos esquistosomas descritos hacia sus hospederos definitivos: Trichobilharzia sp. 4-Mareca sibilatrix, T. querquedulae-Spatula cyanoptera y N. melancorhypha-C. melancoryphus, lo cual fue soportado filogenéticamente. Adicionalmente, se plantea la necesidad de análisis filogenéticos adicionales para los taxones de Dendritobilharzia, género que ha resultado históricamente conflictivo desde el punto de vista morfológico, contando desafortunadamente con escasas secuencias de ADN para su comparación. En relación con los ciclos biológicos, se lograron dilucidar dos ciclos biológicos, indicando al menos un hospedero definitivo y uno intermediario para cada uno; el de N. melancorhypha, aislado desde C. melancoryphus y C. dombeyana, y el de un taxón aún pendiente por describir aislado desde los mismos dos hospederos. Es importante mencionar que en esta tesis doctoral se logró la caracterización de nueve taxones con el potencial de corresponder a nuevas especies para la familia Schistosomatidae, los cuales fueron colectados desde las cinco especies de anátidos muestreados. Este notable registro plantea la necesidad de continuar la investigación de los esquistosomas aviares, cuya diversidad está evidentemente subestimada. Acorde a los resultados obtenidos, ambas hipótesis fueron aceptadas. Además, este estudio corresponde a la primera caracterización morfológica como molecular de los esquistosomas aviares presentes en Chile, entregándose evidencia adicional a este grupo escasamente estudiado en el continente Sudamericano, además de aportar a la discusión sobre la especificidad de estos parásitos hacia sus hospederos aviares.

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