Tesis Doctorado

Permanent URI for this collection

https://repositorio.udec.cl/handle/11594/208

Browse

Now showing 1 - 20 of 24

Análisis molecular de la población de cerdos asilvestrados del Parque Natural Karukinka, tierra del Fuego, Chile: caracterización poblacional y relación con cerdos de crianza local.
(Universidad de Concepción., 2015) Aravena Bustos, Paula Verónica; Skewes Ramm, Óscar
En respuesta a la limitada información existente acerca de las poblaciones asilvestradas en Chile y la necesidad de contar con una base de conocimiento sobre la cual gestar estrategias de control, surge el presente trabajo de tesis doctoral. Mediante herramientas de análisis molecular, complementadas con investigación biológica, se interpretó la historia, estado actual y pronóstico esperable de la población de cerdos asilvestrados de Isla Tierra del Fuego, Chile. Entre el verano del 2010 y el otoño del 2011, se recopiló información a partir de encuestas y entrevistas, además de la indagación de signos inequívocos de la presencia de la especie en el sur de Tierra del Fuego (TDF). Posteriormente, se obtuvieron mediante caza, 37 ejemplares del suroeste (Timaukel) y cinco del sureste (Vicuña) del área de distribución. Se analizó la variación genética de la región control del ADN mitocondrial (D−loop) y 12 loci microsatélites de cada ejemplar silvestre incluidos 33 fetos, además de diez cerdos de crianza local. Sumado al análisis molecular, se indagó en las características fenotípicas, reproductivas, tróficas y estado sanitario general de la población en su distribución suroeste. En base a los resultados se identificó el origen de los cerdos asilvestrados de TDF a partir de dos líneas europeas diferentes, que apoyan diferentes eventos de introducción. El primero, originado a partir del ingreso de líneas europeas antiguas en el ecosistema natural de Timaukel, a finales del siglo XIX, con o sin un paso previo por Oceanía. Mientras que el origen de la población de Vicuña se relaciona con las primeras introducciones de cerdos iii europeos en el territorio fueguino argentino, habiéndose establecido primero en esa distribución, para luego migrar a Chile por el suroeste.Finalmente, se determinó que el diseño de un plan de control de esta invasora deberá considerar dos poblaciones que tienen en común el aislamiento, la baja variabilidad genética y el limitado número de individuos, que forman grupos matriarcales fecundados principalmente por un macho alfa y adaptados a la disponibilidad trófica. Se sugiere que es un buen momento para comenzar con un plan de control de este invasor. Debido a que la población asilvestrada de Timaukel colinda con estancias ganaderas y un pequeño centro urbano, es crucial que cualquier estrategia de control sea implementada con un enfoque social, y dado que la frontera Chileno−Argentina de Tierra del Fuego no limita el movimiento de cerdos de un país a otro, se recomienda la elaboración de un plan de acción binacional. Por otra parte, considerando la creciente importancia que tienen los recursos zoogenéticos en la gestión de la ganadería a escala mundial, esta población constituye un posible recurso zoogenético remoto.
Caracterización molecular, evaluación de factores de virulencia y habilidad de adherencia de Staphylococcus aureus aislados desde leche de estanque y superficies del equipo de ordeño en operaciones lecheras.
(Universidad de Concepción., 2020) Pachá Becerra, Paulina Andrea; Latorre Soto, Alejandra A.; Muñoz Domon, Marcos
El objetivo de la presente investigación fue evaluar la diversidad de cepas, factores de virulencia y habilidades de adherencia de S. aureus identificados desde leche de estanque (BTM) y adherencias macroscópicas en superficies de equipo de ordeño en contacto con leche durante el ordeño o enfriamiento de la leche (AMES). Un total de 30 lecherías de la Región de Ñuble fueron incluidas en este estudio. Por rebaño, 3 muestras consecutivas de BTM se recolectaron, correspondientes a una ordeña, y se realizó una inspección del equipo de ordeño en busca de AMES para la detección de S. aureus. Los aislados de S. aureus se subtipificaron por patrones de bandas obtenidos por enzima de macrorestricción SmaI y gel de electroforesis de campo pulsado (PFGE), y además se caracterizaron los patrones de virulencia (PV) y habilidad de adherencia in vitro en superficie de poliestireno. Para la caracterización del perfil de virulencia, genes de importancia en IMI (nuc, coa, fnbA e icaA e icaD) y de importancia en salud pública (resistencia a meticilina, genes mecA y mecC, y genes de enterotoxinas sea y seb) fueron incluidos. En cepas de S. aureus frecuentemente identificados entre lecherías y muestras se evalúa la habilidad de adherencia en microplacas de poliestireno (MPA). Un total de 226 aislados de S. aureus fueron identificados en 23 lecherías y 166 seleccionados para la evaluación de subtipificación por PFGE. Se observó un total de 42 pulsotipos; de los cuales 23 corresponden a pulsotipos principales (A-W) y 19 subtipos. Entre lecherías de la región se identificó una alta heterogeneidad de cepas de S. aureus (diversidad según índice de Simpson [SID] = 0, 99). De los 42 pulsotipos identificados entre las lecherías, 8 de ellos (A, A.1, B.1, D, E, J, K, N, Q) fueron identificados en lecherías diferentes. Estos pulsotipos distribuidos entre lecherías podrían indicar factores asociados que permiten el movimiento de microorganismos entre lecherías geográficamente distanciadas. Dentro de las lecherías, la diversidad de S. aureus fue variable (valores SID de 0 a 1). En 7 lecherías positivas a S. aureus en AMES y BTM, se identificó clonalidad entre pulsotipos de S. aureus de AMES y BTM. Esto podría sugerir que las adherencias presentes en las superficies de ordeño pueden tener un rol importante como potencial fuente de éste microorganismo en BTM. Al realizar la evaluación de los PV de los 166 aislados de S. aureus, se identificaron 5 perfiles de virulencia, donde el perfil nuc (+) coa (+) fnbA (+) icaA (+) icaD (+) mecA (-) mecC (-) sea (-) seb (-) fue el más frecuentemente observado, detectándose en 21 de los 23 pulsotipos principales y en 21 de las 23 lecherías S. aureus (+). No se encontraron diferencias estadísticamente significativa entre los perfiles de virulencia de los aislados de S. aureus de BTM y AMES. Los perfiles de virulencia observados con mayor frecuencia incluyeron genes involucrados en la adherencia y la capacidad de formación de biopelículas de S. aureus, lo que podría representar una ventaja potencial para la bacteria durante las primeras etapas de la IMI y para la persistencia en las superficies. Para la evaluación de adherencia se seleccionaron 24 cepas de S. aureus frecuentemente identificados desde 19 lecherías de la región de Ñuble, identificando 6(25%), 14(58.3%), y 4(16.6%) cepas con alta, mediana y baja adherencia, respectivamente. No se encontraron diferencias significativas en la habilidad de adherencia de poliestireno de cepas identificadas desde BTM-AMEs y sólo de BTM. La presente investigación señala que cepas de S. aureus presentes en BTM y AMES podrían tener una dinámica diferente dentro de los rebaños lecheros. Resaltando la importancia de comprender la epidemiología de S. aureus leche de estanque y en superficies en contacto con leche con el fin de identificar estrategias a considerar en el control de este patógeno intramamario y potencial patógeno humano.
La competencia de embriones bovinos producidos in vitro modifica la señalización embrionaria mediada por vesículas extracelulares.
(Universidad de Concepción., 2018) Mellisho Salas, Edwin Alberto; Mellisho Salas, Edwin Alberto
Las vesículas extracelulares (EVs) secretadas por los blastocistos pueden ser relevantes, como un buen predictor de la competencia de los embriones producidos in vitro. El objetivo de este trabajo fue determinar el perfil de mi ARN contenido en EVs secretadas por embiones bovinos con diferente velocidad de desarrollo in vitro y competencia pre-implantatoria. El trabajo fue abordado con dos experimentos. El primer experimento fue para identificar y caracterizar las EVs secretadas por embiones bovinos pre-implantatorios. Para esto se consideró la secreción durante la etapa de desarrollo posterior a la blastulación (día 7-9 de desarrollo in vitro) y se incluyeron solo embriones protuidos para eliminar el efecto de la zona pelúcida. Además, se consideraron embiones producidos in vitro utilizando dos tecnologías que producen embiones con diferente competencia: 1) partenogénicos (PA), menos competentes y 2) fecundación in vitro (IVF), más competentes. Un segundo experimento fue para realizar una determinación no invasiva de competencia embionaria considerando características de poblaciones de EVs secretadas durante la etapa de blastulación y parámetros morfocinéticos del embrión. Para esto, los embriones fueron cultivados en grupos, hasta el día 5 de desarrollo in vitro, en este momento se seleccionaron las mórulas, las cuales se cultivaron individualmente en SOFaa depletado hasta el día 7.5. Durante este periodo los embriones fueron monitoreados para determinar el momento de la aparición del blastocele, como indicador cinético de desarrollo embrionario: 1) blastulación temprana (EB: Día 6.5) y 2) blastulación tardía (LB: Día 7.5). Al día 7.5, se determinaron las características morfológicas de los blastocistos siguiendo los criterios de la IETS. Al día 7.5, se colectó individualmente el medio de cultivo, se identificó con el embrión correspondiente y se conservó a -80 °C para posteriores análisis.Los blastocistos evaluados (día 7.5) fueron transferidos a medio SOFaa dep fresco hasta el día 11 de desarrollo in vitro para determinar su potencial de desarrollo post-eclosión, de acuerdo a su crecimiento. A los parámetros tamaño y concentración de EVs generados por Nano Tracking Analysis (NTA), se les realizó análisis de varianza y la comparación de medias test HSD. Posteriormente, las variables de morfología del blastocisto y características morfológicas de las EVs fueron sometidas a análisis de componentes principales (PCA) y análisis de conglomerados (CA) para la posibilidad de discriminar los grupos de embiones. Finalmente, se utilizó un análisis de regresión logística binaria, para construir modelos no invasivos de predicción de competencia embrionaria. El análisis estadístico se realizó con el programa SAS versión ocho para Windows y programa IBM SPSS Statistics versión 19. En el experimento 1, el análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM) reveló la presencia de vesículas heterogéneas de diferentes tamaños y población: microvesículas (MVs) y exosomas (Exs) de forma redondeada, encerrados por una capa doble de lípidos y con un rango de 30 a 385 nm de diámetro. Además, el análisis de citometría de flujopermitió identificarproteínas de superficie CD63 y CD9 como marcadores de EVs. El NTA generó datos sobre las características morfológicas de las EVS, tamaño y concentración. El perfil (concentración y tamaño) de partículas secretadas por embriones derivados de IVF, fue diferente a las secretadas por embriones PA. En el experimento 2, las características morfológicas de los blastocistos se diferenciaron estadísticamente de acuerdo con el momento de blastulación y competencia por su tamaño y calidad. Los embriones más competentes del grupo de blastulación temprana secretaron EVs con mayor tamaño (122.9 nm), mientras que la mayor concentración de EVs (5,75 x 10 [9] partículas / ml) correspondió al grupo no competente. La secuenciación de ARN pequeños mostró un total de dos biotipos, miARN (86 a 91%) y snoARN (9 a 14%). Además, se identificó un total de 182 miARN y 31 snoARN. El análisis de expresión diferencial de miARN entre blastocisto competente versus no competente, mostró 12 miARN regulados positivamente y 15 miARN regulados negativamente. Posteriormente, utilizando una regresión logística binaria, se construyó un modelo no invasivo para predecir la competencia embrionaria basada en una combinación de variables morfocinéticas de blastocisto y las características de EVs los cuales mostraron un alto ROC-AUC de 0.853. En conclusión, en este trabajo se demostró que los blastocistos bovinos secretan MVs/EXs a los medios de cultivo y esta secreción tiene características que varía dependiendo de la competencia embrionaria previa a la implantación, por lo tanto, es posible generar un nuevo modelo predictivo no invasivo de alta eficiencia para la selección de embriones bovinos.
El complejo Ornithonyssus bacoti (Acari: Mesostigmata) de roedores de Chile diversidad genética, variaciones morfológicas y patógenos asociados.
(Universidad de Concepción., 2019) Silva de la Fuente, María Carolina; González Acuña, Daniel A.; Moreno Salas, Lucila del Carmen
Un complejo de especies corresponde a especies morfológicamente indistinguibles, pero que presentan distintos linajes evolutivos. Estos complejos serían más frecuentes de encontrar en animales invertebrados, los que utilizan principalmente medios químicos o táctiles para el apareamiento, no así diferenciaciones morfológicas. En el caso de artrópodos vectores, es relevante resolver estos complejos de especies debido a que la incorrecta identificación de una especie, podría ocasionar graves problemas relacionados con salud pública. La presente investigación utilizó como modelo de estudio a los ácaros del genero Ornithonyssus s.l. (Acari: Mesostigmata), actualmente constituido por 13 especies, y considerado un complejo de especies, principalmente producto de su similitud morfológica, lo que genera continuos cambios en su clasificación. Tanto el género Ornithonyssus como O. bacoti son reconocidas por parasitar principalmente roedores, sin embargo, O. bursa, O. sylviarum, O. wernecki, O. aridus y O. bacoti parasitan al humano, siendo consideradas como potenciales vectores mecánicos y/o biológicos de patógenos. En Chile solo se ha reportado la especie O. bacoti en roedores silvestres y sinantrópicos, sin embargo, reconociendo la diversidad geográfica y diversidad de roedores presentes, se espera encontrar más de una especie de ácaro del género Ornithonyssus a través de la distribución de sus hospedadores en Chile, los que a su vez albergaran diferentes especies de patógenos asociados a estos. El objetivo principal de este estudio es evaluar el estatus taxonómico de los ácaros Ornithonyssus presentes en roedores de Chile y determinar la presencia de bacterias del género Rickettsia, Borrelia y/o Bartonella, potencialmente patógenas para hospedadores silvestres y/o humanos. Para ello se visitaron 14 localidades a lo largo de Chile (18°19'34,08''S-70°00'31,86''O a 47°07'41,00''S-72°30'18,50''O) y se capturaron roedores desde los cuales se extrajeron los ácaros, los que se sometieron a análisis moleculares (Inferencia Bayesiana y Red de Haplotipos), morfológicos y morfométricos, comparando 40 medidas anatómicas. Se identificaron dos nuevas especies para el género Ornithonyssus, Ornithonyssus nov. sp. 2 y Ornithonyssus nov. sp. 3 con un 8,4% y un 7,2% de distancia genética con respecto a O. bacoti, respectivamente, y una v especie afín a O. bacoti con un 4% de distancia genética en relación a O. bacoti. Dentro de los caracteres morfométricos que las distinguen destaca el largo del peritrema, largo de pata I, largo de pata IV, largo de placa dorsal y la forma del epistome. Por lo tanto, se desca que las especies propuestas en este estudio pueden ser diferenciadas por caracteres morfométricos y morfológicos, además de los moleculares. Respecto a las bacterias, se identificó sólo una genoespecie de Bartonella (con gen 16S ARNr) presente a lo largo de los puntos de muestreo. De este modo, la presente investigación proporciona caracteres útiles de las especies de Ornithonyssus presentes en Chile e indica el eventual rol de estas especies en la mantención de bacterias que posiblemente pueden estar asociadas a agentes patógenosarta la existencia de un complejo de especies Ornithonyssus en Chile, debido
Desarrollo y evaluación de un prototipo de vacuna contra Circovirus Porcino tipo 2 (PCV2) utilizando Pichia pastoris.
(Universidad de Concepción., 2020) Villamil Pérez, Aura Milena; Ruiz Garrido, Álvaro Rafael; Toledo Alonso, Jorge Roberto
El Circovirus porcino tipo 2 (PCV2) representa una preocupación crucial dentro de la industria porcina a nivel mundial y en Chile, específicamente, los sistemas intensivos de producción de cerdos se han visto obligados a ir a la vanguardia en la implementación de programas de vacunación que permitan mantener controlada la enfermedad. Sin embargo, así como las enfermedades asociadas a este patógeno generan pérdidas económicas importantes, las vacunas también conllevan costos elevados dentro de los planteles, por lo que en los últimos años, el desarrollo de vacunas recombinantes ha tomado fuerza, tendiendo en cuenta que se pueden utilizar microorganismos para la obtención de proteínas específicas. Es el caso de la levadura Pichia pastoris que, debido a sus ventajas productivas, se ha convertido en una herramienta llamativa para la producción eficaz de proteínas recombinantes. El objetivo de esta investigación consistió en generar una formulación vacunal que estimulara en los cerdos, bajo condiciones controladas, la respuesta celular y humoral contra PCV2. Inicialmente, se evaluó la producción de las proteínas expresadas en la levadura P.pastoris MP36 analizando clones transformados y a partir de ellos, se obtuvieron dos proteínas: por una parte y en el interior de la célula, la proteína de una quimera de la cápside de PCV2, ya que es considerada como dominante para la inmunogenicidad del virus en el animal; y por otra, el interferón alfa porcino (IFNα) en el medio extracelular, debido a su característica actividad antiviral y efecto inmunopotenciador. A partir de dichas proteínas, se preparó la formulación vacunal utilizando el adyuvante comercial Montanide 15AVG. Posteriormente, se realizaron ensayos con cerdos provenientes de un plantel comercial chileno, para evaluar la efectividad del uso del IFNα en la preparación vacunal. Estos animales fueron trasladados a instalaciones de la Universidad de Concepción, campus Chillán, teniendo cuidado de no afectar su bienestar y normal desarrollo. Se llevaron a cabo las inmunizaciones para comparar la dosis de la formulación vacunal con respecto a su seguridad en cerdos y además, para determinar su potencia. Adicionalmente, se realizó un desafio con la finalidad de poner a los animales en contacto con el virus, replicar la enfermedad y comparar a los animales infectados clínicamente con los animales protegidos. La formulación vacunal desarrollada, utilizando la quimera de la cápside (sin el IFNα), indujo en los cerdos una respuesta inmune contra PCV2, elevando los valores S/P y disminuyendo la carga viral; no obstante, la seroconversión no se dio de manera clara.
Detección y tipificación molecular de Staphylococcus aureus y Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) en Dakota del Norte, Estados Unidos.
(Universidad de Concepción., 2014) Velasco Pizarro, Valeria; Rojas García, Pedro Pablo
La emergencia y la propagación de patógenos resistentes a agentes antimicrobianos ha aumentado la preocupación en materia de salud pública a nivel mundial. El uso de antibióticos en producción animal, en profilaxis, terapia y promoción del crecimiento, se asocia a la emergencia de patógenos resistentes en el ganado. La exposición del ganado a dosis subterapéuticas de agentes antimicrobianos genera un reservorio de patógenos resistentes en los animales con el riesgo de transmisión a las personas a través de la cadena productiva de la carne. Uno de los patógenos que desarrolla rápidamente resistencia a múltiples agentes antimicrobianos (MR) es Staphylococcus aureus. En especial, las cepas de S. aureus resistente a meticilina (SARM) constituyen una causa importante de infecciones asociadas a hospitales (HA-MRSA), a la comunidad (CA-MRSA) y al ganado (LA-MRSA). La capacidad de colonizar las fosas nasales y piel de humanos y animales que posee S. aureus y la detección de cepas de SARM y S. aureus MR en animales de abasto y en carne, aumentan la probabiliadad de contaminación de los alimentos en las diferentes etapas de la cadena productiva. La resistencia a la meticilina se atribuye a la proteína de unión a la penicilina 2a (PBP2a) codificada en el gen mecA, que forma parte del casssette cromosómico estafilocócico mec (SCCmec). Esta proteína le confiere a las cepas de SARM una baja afinidad por antibióticos b- lactámicos. A su vez, las cepas CA-MRSA produccen generalmente la exotoxina Leucocidina de Panton-Valentine (PVL), la cual constituye un factor de virulencia asociado a infecciones de la piel y necrosis de tejidos. Por lo tanto, debido al impacto que pueden tener estas cepas de S. aureus en la salud humana, resulta relevante evaluar si los productos alimenticalimenticios pueden ser un foco de contaminación que facilite la propagación de estas infecciones. 2 El objetivo de este estudio fue establecer la prevalencia y los tipos moleculares de S. aureus y SARM en animales de abasto, carne cruda, productos cárnicos y humanos, determinando la relación filogenética entre las cepas. Se aisló S. aureus desde 167 muestras nasales de animales, 145 muestras de carne cruda y 46 muestras de productos cárnicos, utilizando una etapa de enriquecimiento selectivo en dos pasos, seguido de cultivo en placa. Los aislados que resultaron ser positivos se sometieron al análisis por PCR múltiple (PCRm) para identificar los genes: ARNr 16S (identificación de S. aureus), mecA (detección de SARM) y PVL (factor de virulencia asociado a CA-MRSA). Para la tipificación molecular de las cepas de S. aureus se utilizó electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) y tipificación de secuencias multilocus (MLST). El análisis de susceptibilidad antimicrobiana se llevó a cabo a través del método de microdilución en caldo. Además, se aisló e identificó S. aureus desde muestras de fosas nasales de 550 personas sanas a través de métodos de cultivo y análisis bioquímico. Un total de 108 aislados clínicos de cepas SARM obtenidos de pacientes hospitalizados se analizaron a través de PCRm para confirmar la presencia de S. aureus y detectar las cepas con los genes mecA y PVL. Se desarrolló un método de PCR múltiple en tiempo real con el fin de disminuir el tiempo de análisis de muestras de animales y carne y para aumentar la sensibilidad de detección de S. aureus y de los genes mecA y PVL. Este procedimiento se realizó con posterioridad al enriquecimiento primario y al secundario que preceden al cultivo en placa. Los resultados se compararon con el método de cultivo que incorpora el enriquecimiento selectivo en dos pasos para aislar S. aureus. Se analizó un total de 234 muestras a través de estos métodos (77 muestras nasales de animales, 112 muestras de carne cruda y 45 muestras de productos cárnicos). La prevalencia total de S. aureus determinada luego del análisis de las muestras por el método de cultivo con doble enriquecimiento fue de 34,7% en animales, siendo más alta en cerdos (50,0%) y corderos (40,6%) (P<0,05). En carne cruda la prevalencia fue de 47,6%, siendo más alta en carne de pollo (67,6%) y de cerdo (49,3%) (P<0,05). En productos cárnicos la prevalencia fue de 13,0% (Figura 1). Cinco muestras de carne de cerdo (7,0%) fueron positivas para el gen mecA, de las cuales tres correspondieron al serotipo ST398 y dos al serotipo ST5. Todas estas cepas exhibieron resistencia a la penicilina y cuatro fueron MR. En ninguna de las muestras se detectaron a través de PCRm los genes PVL.
Distribución, prevalencia y filogeografía de Haemoproteus y Plasmodium en aves del orden Passeriformes en el cono sur de Sudamérica.
(Universidad de Concepción., 2019) Doussang Ortiz, Daniela Ivonne; González Acuña, Daniel A.
Los hemosporidios aviares son protozoos de distribución mundial, transmitidos por vectores (dípteros). Plasmodium y Haemoproteus son los más comunes en aves y son causantes de malaria y pseudomalaria respectivamente. Su distribución, prevalencia y diversidad pueden estar influenciadas por factores bióticos y abióticos, tales como; altitud, latitud, relación parásito-hospedador y barreras biogeográficas como la Cordillera de los Andes. Este estudio tiene como objetivos (1) determinar distribución, prevalencia y diversidad de Plasmodium y Haemoproteus en aves silvestres del orden Passeriformes principalmente de Chile y Argentina, y compararlos con los ya descritos en Sudamérica; (2) Analizar factores bióticos y abióticos que puedan estar influenciando la prevalencia, distribución y diversidad de los haplotipos de Plasmodium y Haemproteus; (3) evaluar el efecto del aislamiento producido por la cordillera de los Andes en la distribución y diversidad de los haplotipos de hemoparásitos de aves; (4) y asignar las especies morfológicas analizadas con sus haplotipos. Para desarrollar estos objetivos, se extrajo sangre de aves desde distintas localidades de Chile, para la detección de Haemoproteus y Plasmodium a través de técnicas de diagnóstico tradicionales (microscopía óptica) y PCR utilizando el gen de citocromo b mitocondrial. Además fueron adicionadas al análisis muestras obtenidas de tejidos (sangre, músculo, hígado o corazón) de chincol (Zonotrichia capensis) provenientes de “Museo de Luisiana”, Estados Unidos y otras muestras de colección de tejidos (sangre y músculo) de Passeriformes de “Museo Argentino de Ciencias Naturales Bernandino Rivadavia”, Buenos Aires, Argentina.
Efectos de la respuesta inflamatoria aguda inducida por el lipopolisacárido de Escherichia coli O128:B12 sobre la disposición plasmática y distribución tisular de florfenicol y florfenicol amina en conejos y ovinos
(Universidad de Concepción, 2023) Cazanga Reyes, Victoria Matilde; Pérez Fernández, Rubén
Las infecciones bacterianas constituyen una de las principales causas de pérdidas económicas en los sistemas ganaderos, por lo que el uso de antibacterianos representa una de las alternativas más frecuentemente utilizadas para el tratamiento y control de estas enfermedades. Florfenicol (FFC) es un antibacteriano de uso veterinario que se utiliza principalmente en el control de infecciones respiratorias tanto en rumiantes como monogástricos y es posible de ser utilizado en conejos. La farmacocinética de FFC ha sido ampliamente estudiada principalmente en animales sanos, sin embargo, se desconoce el efecto de la respuesta inflamatoria aguda (RIA) inducida por sepsis sobre la disposición plasmática y distribución tisular de este antimicrobiano. Asimismo, se desconoce el efecto de la RIA sobre las concentraciones de su principal metabolito, florfenicol amina (FFC-a). Considerando que comúnmente este antibiótico será aplicado a animales que cursan con alguna patología infecciosa o estado inflamatorio, es de importancia conocer cómo influye esta condición sobre su comportamiento farmacocinético. Antecedentes experimentales han demostrado que la RIA inducida por agentes infecciosos puede alterar la farmacocinética y modificar la eficacia de los fármacos o potenciar su toxicidad en los animales. Estas alteraciones son causadas por la liberación de citoquinas proinflamatorias que además de generar un estado febril, producen modificaciones en los procesos de absorción, distribución y eliminación de los fármacos. La administración de lipopolisacárido (LPS) de Escherichia coli (E. coli) ha sido un modelo ampliamente utilizado para inducir en forma experimental una RIA, con el propósito de estudiar los cambios causados por la infección sobre la farmacocinética de antimicrobianos y otros fármacos, ya que permite replicar en los animales la respuesta inflamatoria a la infección. Se realizó el presente estudio con el objetivo de determinar el efecto de la RIA inducida por LPS de E. coli sobre la disposición plasmática y distribución tisular de FFC y FFC-a en dos modelos animales de inflamación aguda sistémica: conejos y ovinos, como representativos de especie monogástrica y rumiante, respectivamente. Además, se estudió si existen diferencias de especie en la disposición plasmática y distribución tisular de FFC y FFC-a posterior a la administración de FFC en animales sanos. También, se evaluó, si existen diferencias de especie sobre los cambios en la disposición plasmática de FFC y FFC-a inducidos por la RIA en respuesta a la administración de LPS. Se utilizaron conejos de raza Neozelandés y ovinos de raza Suffolk Down que fueron distribuidos en grupos de cinco animales cada uno y asignados a grupo control y grupo tratado con LPS de E. coli. Se administraron tres dosis de 1 μg/kg LPS a las 0, 8 y 23 h 15 minutos (Grupo LPS) o solución salina (SS) en igual volumen y frecuencia de administración (Grupo control). Se extrajeron muestras sanguíneas para análisis de hemograma, perfil bioquímico y los marcadores de inflamación interleuquina 6 (IL-6) y proteína C reactiva (PCR). En los animales tratados con LPS se observaron incrementos significativos en las concentraciones de IL-6 y PCR, cambios en el hemograma y perfil bioquímico sanguíneo, modificaciones que estuvieron asociadas a un proceso febril. Estos cambios demuestran la eficacia del modelo de administración de LPS para induciruna RIA en los animales del estudio. Otros grupos de conejos y ovinos fueron tratados con 3 dosis de LPS o solución salina (control) previo a la administración de 20 mg/kg de FFC y se realizaron muestreos sanguíneos seriados para análisis farmacocinético. Se observaron cambios significativos en la farmacocinética de FFC y FFC-a respecto de los valores observados en animales control, los cuales estuvieron asociados a disminuciones significativas del clearance de FFC, acompañados de aumentos en la vida media de eliminación (t1/2el), área bajo la curva (AUC) y tiempo medio de residencia (TMR). Además, se observaron disminuciones significativas en las concentraciones de FFC-a asociadas a disminuciones en los promedios de AUC y en la proporción de metabolito/fármaco activo (MR%). Con el objetivo de estudiar y comparar la distribución tisular de FFC y FFC-a, en otros grupos de animales tratados con SS o LPS se administró FFC en dosis de 20 mg/kg vía intramuscular. En los animales del grupo control las mayores concentraciones tisulares de FFC se observaron en riñones, seguidos en orden decreciente por músculo, bazo, pulmón, hígado y cerebro. Las mayores concentraciones de FFC-a se observaron en riñón e hígado. En el grupo de conejos tratados con LPS se observaron incrementos significativos de las concentraciones de FFC en músculo, mientras que las concentraciones de FFC-a en hígado, músculo y bazo fueron significativamente mayores a las de los conejos control. En los ovinos tratados con LPS las concentraciones plasmáticas de FFC fueron mayores que las observadas en el grupo control, las que estuvieron asociadas a disminuciones significativas del clearance y a incrementos significativo del AUC del antibiótico. También se observaron aumentos significativos en los promedios de Cmáx. Tmáx y AUC del metabolito FFC-a. Las concentraciones tisulares de FFC en riñón, bazo y cerebro fueron significativamente mayores que las observadas en los ovinos del grupo control. En los animales tratados con LPS del presente estudio, la disminución del MR% de FFC- a se explica por alteraciones en la funcionalidad hepática que caracterizan a la RIA. En la comparación de los parámetros farmacocinéticos entre animales sanos (grupos control) de ambas especies, se observó que los conejos presentaron promedios de clearance de FFC significativamente mayores respecto de los ovinos, cambios que se asociaron a incrementos en los promedios de AUC y MR% de FFC-a, los que pueden atribuirse a diferencias de especie en el metabolismo, y en la excreción renal de FFC. La RIA inducida por la administración de LPS de E. coli produjo cambios sobre la disposición plasmática y tisular de FFC y su metabolito FFC-a, en las dos especies en estudio, caracterizados principalmente por un incremento de las concentraciones plasmáticas de FFC, alteraciones en los procesos de eliminación del antibiótico e incremento de las concentraciones tisulares de FFC y FFC-a en los animales tratados con LPS. Los resultados del presente estudio son relevantes ya que entregan antecedentes acerca del comportamiento farmacocinético de FFC en presencia de una respuesta inflamatoria aguda, la cual indujo cambios significativos en la disposición plasmática y distribución tisular del antimicrobiano y su metabolito FFC-a. Por lo tanto, cabría esperar que variaciones similares en la farmacocinética de este antibiótico puedan observarse al ser administrado a animales en condiciones de infección. Los resultados obtenidos también entregan antecedentes que son de utilidad para el cálculo de dosificaciones de FFC y aplicación terapéutica de este antibiótico en conejos y ovinos. Considerando las relaciones observadas entre las concentraciones del antibiótico y los valores de concentraciones mínimas inhibitorias (MIC) para los principales patógenos que afectan al sistema respiratorio, y el nivel de incremento de concentraciones plasmáticas y tisulares de FFC observados en los animales tratados con LPS, estos pueden ser beneficiosos al evaluar la eficacia terapéutica del antibiótico. También es relevante tener en consideración las diferencias de especie observadas en el presente estudio sobre la farmacocinética de FFC, al diseñar regímenes de dosificación de este antibiótico en ovinos y conejos, ya que en conejos se pueden presentar concentraciones del antibiótico menos persistentes debido a su mayor metabolismo y nivel de excreción, frente a lo cual pueden ser necesarias modificaciones en la frecuencia de dosificación entre ambas especies.
Efectos del estado inflamatorio inducido por lipopolisacárido de escherichia coli o128:b12 sobre la disposición plasmática y la distribución tisular de ivermectina en ovinos.
(Universidad de Concepción., 2022) Riquelme Acuña, José Belarmino; Pérez Fernández, Rubén
Antecedentes actuales demuestran que la farmacocinética de antimicrobianos puede ser modificada en animales que estén cursando con un proceso inflamatorio derivado de la acción de agentes patógeno causantes de una infección. Esto se debe a alteraciones en la expresión de proteínas con función enzimática y/o transportadora, lo cual puede modificar el perfil farmacocinético, la distribución tisular pudiendo alterar la eficacia y seguridad del antimicrobiano. La respuesta orgánica a la infección se caracteriza por una reacción sistémica conocida como respuesta de fase aguda (RFA), la que comprende un conjunto de reacciones metabólicas y fisiológicas que forman parte del sistema de defensa temprana y/o sistema inmune innato del huésped y que puede ser activado por diferentes estímulos entre los que destaca el lipopolisacárido (LPS) de Escherichia coli. Para conocer el efecto de la administración de LPS sobre variables fisiológicas, hematológicas y bioquímicas, dos grupos de ovinos se distribuyeron en un grupo experimental (n = 5) tratado con 3 dosis intravenosas de 1 μg/kg de LPS y grupo control (n = 5) tratado con solución salina (SS) a igual volumen y frecuencia que el grupo experimental. Se monitoreó; Temperatura corporal (T°C), frecuencia cardíaca (FC) y frecuencia respiratoria (FR). Se tomaron muestras de sangre para hemograma y determinar actividad enzimática para aspartato amino transferasa (AST) y gamma glutamil transferasa (GGT) entre 1 y 24 h post-LPS. Las ovejas tratadas con LPS presentaron valores medios de T°C (41,2 ± 0,4°C), FC (132 ± 12,3 latidos/min) y FR (107,2 ± 25 ciclos/min) superiores a los observados en ovinos controles (39,8 ± 0,2°C, 88,8 ± 8,7 latidos/min y 53,6 ± 17,1 ciclos/min respectivamente). Entre las 4 y 8 horas posterior a la inyección de LPS, el recuento de leucocitos se asoció a linfopenia, seguida de leucocitosis a las 24 horas. Estos resultados permiten caracterizar la respuesta de fase aguda inducida por LPS en ovinos, por lo que representan un modelo útil para estudiar la farmacocinética de ivermectina en respuesta a una infección. La ivermectina (IVM) es un antiparasitario ampliamente usado en medicina veterinaria y que se aplica a un gran número de animales entre los cuales es posible encontrar aquellos que estén cursando un cuadro inflamatorio asociado a un proceso infeccioso. El objetivo del estudio fue evaluar el efecto del estado inflamatorio inducido por lipopolisacárido de Escherichia coli sobre la disposición plasmática de ivermectina cuando se administra por vía endovenosa, subcutánea e intraruminal en ovinos. Para ello se realizaron tres experimentos, en cada uno de los cuales se distribuyeron dos grupos experimentales de ovejas Suffolk Down: Grupo 1 (LPS, n =5): tratado con tres dosis de LPS de 1 μg/kg a −24, −16 y −0,75 h previo a la administración de IVM; grupo 2 (Control, n =5): tratados con SS. A los 45 minutos posteriores a la tercera dosis de LPS o SS se administraron 0,2 mg de IVM/kg vía intravenosa (IV), subcutánea (SC) o intraruminal (IR) para cada uno de los experimentos. En otro grupo de 12 ovinos, los que siguieron el mismo régimen de tratamiento experimental con LPS o SS se administró IVM por vía SC y a los 2 días post-administración de IVM los animales fueron sometidos a eutanasia para la recolección de tejidos y evaluar la distribución tisular del fármaco. Las concentraciones de plasmáticas y tisulares de IVM se determinaron mediante cromatografía líquida de alta resolución. Los parámetros farmacocinéticos fueron calculados mediante un modelo no compartimental. En cuanto a la IVM administrada por vía IV en ovejas control, los valores de los parámetros farmacocinéticos fueron los siguientes: vida media de eliminación (2,85 días), tiempo medio de residencia (TMR) (2,27 días), área bajo la curva de concentración plasmática a través del tiempo (ABC) (117,4 ng día/mL), volumen de distribución (875,6 mL/kg) y aclaramiento (187,1 L/día). Para IVM SC, los valores de los parámetros farmacocinéticos fueron los siguientes para ovejas sanas: vida media de eliminación (10,2 días), TMR (12,38 días), ABC (211,34 ng-día/mL). Finalmente, para IVM IR se encontraron los siguientes valores de los parámetros farmacocinéticos en ovejas sanas: vida media de eliminación (2,38 días), TMR (2,87 días), ABC (45,96 ng-día/mL). Para los parámetros farmacocinéticos estudiados no se observaron diferencias estadísticamente significativas al comparar con los resultados obtenidos en el grupo de ovinos tratados con LPS respecto a los observados en el grupo control. En cuanto a las concentraciones plasmáticas de IVM, no se observaron diferencias estadísticamente significativas para la vía IV cuando se compararon ovinos control con ovinos tratados con LPS. En cambio, para la vía SC, se observaron diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos de ovinos a las 24 horas de administrada la IVM, siendo menores en el grupo tratado con LPS. La administración IR de IVM en ovinos tratados con LPS produjo disminución significativa de las concentraciones plasmáticas de IVM con respecto al grupo control 12 horas post administración del fármaco. Tanto para la vía SC como para la vía IR, las diferencias fueron observadas en la fase de absorción del fármaco. Con respecto a la distribución tisular de IVM posterior a la administración por vía SC, las mayores concentraciones en ovejas sanas se observaron en la bilis (165,8 ng/mL), hígado (56,7 ng/g) y riñón (22,8 ng/g), no observándose diferencias con los ovinos tratados con LPS. Se concluye que la RFA inducida por la administración intravenosa de LPS de E. coli en ovinos adultos, no produjo cambios en los parámetros farmacocinéticos de IVM cuando esta se administra por vía IV, SC e IR, ni en la distribución tisular de IVM cuando se administra por vía SC, por lo que su administración en dosis terapéuticas es segura en ovinos que cursen un cuadro inflamatorio derivado de un proceso infeccioso.
Estudios de campo de mycoplasma hyopneumoniae, circovirus porcino tipo 2 y actinobacillus pleuropneumoniae, en planteles de producción intensiva de cerdos en Chile.
(Universidad de Concepción., 2012) Neira Ramírez, Víctor Manuel; Ruiz Garrido, Álvaro Rafael
En Chile, los cuadros asociados a Mycoplasma hyopneumoniae (M hyo), Circovirus porcino tipo 2 (PCV2) y Actinobacillus pleuropneumoniae (App), pueden ser considerados como los de mayor relevancia tanto a nivel respiratorio (M hyo, App), como sistémicos (PCV2), siendo ambos muy importantes desde el punto de vista económico y sanitario en Chile y el mundo. En el país es escaso el conocimiento científico de estos tres patógenos y, en general, existen muy pocas publicaciones que describan el estatus sanitario y existiendo principalmente solo reportes informales. Así el presente trabajo tuvo por objetivo contribuir al conocimiento de estos patógenos en Chile, con especial énfasis en conocer el estatus de sus infecciones y determinar la diversidad genética de estos. Lo anteriormente mencionado se llevó a cabo realizando cinco estudios. Dos de ellos se enfocaron en M hyo, los que tuvieron como objetivo determinar la prevalencia y dinámica de seroconversión de M hyo, utilizando ELISA, y determinar la diversidad y variabilidad genética del patógeno, secuenciando el gen de la proteína P146, en planteles de producción intensiva de mono y multisitio. Mediante otros dos estudios se estudió el cuadro de desmedro multisistémico post-destete (PMWS, por sus siglas en inglés) y PCV2 en Chile, analizando y describiendo lesiones según el sistema productivo. El conjunto de datos obtenidos permitió generar un modelo de regresión logística que ayuda a predecir el diagnóstico del cuadro y conocer la variabilidad genética de PCV2 obtenida de los cerdos positivos para PMWS, mediante secuenciación viral y PCRs selectivos. Finalmente, en el caso de App se estudió la variabilidad y distribución de serotipos en el país, evaluando aislados obtenidos desde mono y multisitios, utilizando una técnica rápida de PCR.
Evaluación de diferentes metodologías de administración y alternativas de vacunación contra Circovirus porcino tipo 2 y Mycoplasma hyopneumoniae en dos sistemas de producción porcina intensiva en Chile.
(Universidad de Concepción., 2014) Gutiérrez Jaramis, Cristian Andrés Arturo; Ruiz Garrido, Álvaro Rafael
Tanto en Chile como en el resto de los países del mundo con producción porcina intensiva, los cuadros patológicos asociados a la presencia de circovirus porcino tipo 2 (PCV2) y Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo) tienen gran influencia sobre el estado sanitario general de las piaras y por ende cobran especial relevancia como potenciales causantes de merma sobre el rendimiento económico de las unidades productivas. La vacunación contra estos patógenos se ha vuelto una práctica de rutina en los sistemas productivos y la implementación en terreno de este manejo demanda el uso de mano de obra calificada para la intervención de grandes poblaciones de animales en un acotado periodo de tiempo.
Evaluación de la capacidad predictiva de los marcadores de pluripotencia en embriones bovinos bipartidos sobre el potencial de desarrollo embrionario peri-implantatorio.
(Universidad de Concepción., 2016) Velásquez Órdenes, Alejandra Estela; Rodríguez Álvarez, Lleretny
La producción in vitro de embriones ha sido ampliamente utilizada en diversas especies, no obstante, esta tecnología aún presenta limitaciones que afectan a la competencia del desarrollo embrionario. El reducido potencial de desarrollo es atribuido a la manipulación de los gametos y embriones, lo cual puede tener consecuencias en el desarrollo pre-implantatorio. En el estadio de blastocisto, el embrión experimenta cambios que son el resultado de una expresión génica estrictamente regulada. Existen genes que son cruciales para lograr un correcto desarrollo embrionario, y la ineficiencia en la producción de embriones podría estar causada por una desregulación en la expresión de estos marcadores. Por lo tanto, surge la necesidad de tener una cinética real de expresión génica de lo que pasa en el embrión tras continuar su desarrollo peri-implantatorio. Para ello, una alternativa es generar demi-embriones obteniendo así dos mitades que son cada una el reflejo genético de la otra. El objetivo de esta investigación es evaluar el uso de la bipartición en el estadio de blastocisto como método para validar la capacidad predictiva de los marcadores de pluripotencia sobre el potencial de desarrollo peri-implantatorio. Para establecer un protocolo de bipartición de blastocistos bovinos producidos por fecundación in vitro, se realizó la bipartición a los días 7, 8 ó 9 y estadios temprano, expandido y eclosionado. Se obtuvieron mayores tasas de sobrevida y viabilidad en ambos demi-embriones al bipartir blastocistos al D8 y D9. Sin embargo, se escogió el D8 de desarrollo y estadio de blastocisto eclosionado para los siguientes experimentos. Para determinar el efecto inmediato de la bipartición de blastocistos bovinos, se realizó evaluación morfológica (medición del diámetro y número total de células) y molecular (expresión génica mediante q-RT-PCR) de ambos demi-embriones. Aproximadamente un 70% de los pares de demi-embriones tenían similar tamaño y número total de células. No se observaron diferencias en los niveles de expresión entre ambos demi-embriones en todos los genes analizados (OCT4, SOX2, NANOG, CDX2, TP1 y BAX). Por lo que la bipartición de blastocistos bovinos genera demi-embriones al D9 con características morfológicas y moleculares similares. Para determinar el efecto tardío de la bipartición de blastocistos bovinos al día 13 de desarrollo in vitro, se realizó evaluación morfológica (medición del diámetro) y evaluación molecular (expresión génica mediante q-RT-PCR) de ambos demi-embriones generados. Sólo en el 63,6% de los demi-embriones generados no se encontraron diferencias en el diámetro de éstos. La evaluación molecular mostró diferencias en todos los genes analizados (OCT4, SOX2, CDX2, TP1, TKDP1 y EOMES), excepto BAX. Por lo que la bipartición de blastocistos bovinos producidos por fecundación in vitro genera demi-embriones al D13 con características morfológicas y moleculares diferentes. Además, se evaluó el efecto de la bipartición embrionaria sobre la capacidad de desarrollo peri-implantatorio, tanto in vitro como in vivo. Para el cultivo in vitro de los embriones, se consideraron dos condiciones (cultivo en plástico y co-cultivo en células endometriales). Los embriones cultivados en plástico, mostraron diferencias en el diámetro solo en el D9 y D10 de desarrollo. En cuanto a la expresión de los marcadores estudiados, se observó una tendencia a una mayor expresión en los embriones controles siendo esto significativo para los genes CDX2 y TP1. En el caso de los embriones co-cultivados con células endometriales, no se observaron diferencias en la sobrevida entre embriones bipartidos y controles hasta el D13 de desarrollo. Tanto los embriones bipartidos como controles tuvieron una curva de crecimiento similar donde se observó un crecimiento lineal desde el D9 hasta el D12, sin embargo a partir de este día se observó una disminución en el diámetro embrionario, similar en ambos grupos. En cuanto a la expresión génica, la expresión de TP1 es significativamente menor en los embriones bipartidos. Para evaluar el efecto de la bipartición en el desarrollo peri-implantatorio in vivo, se transfirieron demi-embriones y embriones (controles) a hembras receptoras, los cuales fueron colectados el D17 de desarrollo. No se observaron diferencias en la tasa de recuperación y en la longitud media de los embriones elongados entre ambos grupos. Además, se estudiaron los patrones de expresión génica individual (q-RT-PCR) y global (microarreglo). Se observó mediante q-RT-PCR una sub-expresión de los marcadores OCT4, SOX2, TP1 y EOMES en los embriones derivados de blastocistos bipartidos y se demostró mediante microarreglo, que la bipartición de blastocistos bovinos, afecta la transcriptómica de los embriones elongados al D17, principalmente regulando genes cruciales involucrados en la remodelación de la matriz, control del crecimiento y detoxificación y control del transporte de metabolitos. Finalmente, se demostró que la expresión de los marcadores de pluripotencia (OCT4, SOX2 y NANOG) en estadio de blastocisto, no se correlacionan positivamente con el potencial de desarrollo peri-implantatorio de embriones bovinos producidos por fecundación in vitro.
Evaluación del impacto de la exposición prenatal a un exceso de testosterona sobre la estructura y funcionalidad del páncreas endocrino en ovejas.
(Universidad de Concepción., 2020) Carrasco Morales, Albert Ronald; Recabarren Morgado, Sergio
El feto es un individuo con un potencial genético determinado durante la fecundación. Sin embargo, el fenotipo que adquirirá este individuo depende de la forma en que se exprese su patrimonio genético en función del cómo el ambiente module este proceso. Por ello, las características morfológicas y fisiológicas que tendrá un individuo pueden ser modificadas de acuerdo a las condiciones y las exigencias del ambiente, en función del genoma que este alberga para asegurar la sobrevivencia, proceso conocido como plasticidad. Varias sustancias son capaces de modificar el entorno en el que un individuo vive, incluso durante la vida embrionaria y fetal, provocando una desviación en el desarrollo denominada reprogramación. Entre estas sustancias, la exposición fetal a un exceso de testosterona es un fenómeno que provocaría una reprogramación del desarrollo de este individuo incrementando el riesgo a que padezca diabetes mellitus tipo 2 durante la vida adulta. El objetivo del estudio fue evaluar el efecto de la administración de testosterona, en ovejas gestantes, sobre la fisiología de la madre, las variables morfológicas y endocrinometabólicas de los fetos hembra, la sensibilidad de los tejidos a la insulina en distintas etapas de desarrollo somático (26, 30 y 38 semanas de edad) y el efecto de la administración de testosterona en hembras adultas enteras y ooferectomizadas sobre la sensibilidad a la insulina y la estructura y funcionalidad del páncreas endocrino. Para esto, un rebaño de ovejas adultas de 2-3 años de edad fueron cruzadas con machos de fertilidad probada. El día 28 tras la cruza se confirmó la gestación por ultrasonografía y las hembras preñadas fueron separadas en dos grupos considerando las variables peso y edad como criterios de selección. Un grupo de estas hembras fue sometido a un protocolo de androgenización, que consistió en la administración por vía intramuscular de una solución de propionato de testosterona disuelta en aceite de maravilla, dos veces por semana, en dosis de 30 mg/oveja desde el día 30 al 90 de gestación y 40 mg/oveja desde el día 91 al 120 de gestación (Madres-T). Otro grupo de hembras gestantes (Madres-C) sólo recibió el vehículo en el que se diluyó la testosterona durante el periodo experimental. Desde la cuarta a la decimoséptima semana de gestación las hembras gestantes fueron pesadas y se colectaron muestras de sangre yugular desde las que se determinaron distintas variables endocrino-metabólicas. A los 120 días de gestación en un grupo de hembras preñadas se realizó una cesárea en la que se extrajeron los fetos hembra, éstos fueron pesados y se registraron las medidas zoométricas, se colectó una muestra de sangre yugular para realizar análisis endocrinos y metabólicos. Otro grupo de hembras preñadas parieron y las crías hembra fueron empleadas en los siguientes experimentos. En estas crías, a las 26 semanas de edad (periodo considerado peripuberal), se realizó un test de tolerancia a la glucosa endovenosa (TTGEV) durante la fase folicular del ciclo estral. Tras este estudio la mitad de las hembras de cada grupo fueron ooferectomizadas. A las 30 semanas de edad (periodo considerado como postpuberal temprano) se realizó un segundo TTGEV en las hembras enteras y ooferectomizadas control y expuestas prenatalmente a un exceso de testosterona (EPT) para evaluar el efecto de los esteroides endógenos de origen ovárico sobre la sensibilidad a la insulina.
Evaluación del orujo de uva país como modulador de la fermentación ruminal en dietas para rumiantes.
(Universidad de Concepción, 2023) Suescun Ospina, Sandra Tatiana; Ávila Stagno, Jorge
La producción animal es esencial para satisfacer las demandas de proteína de alta calidad de una población creciente. Sin embargo, las emisiones de metano (CH4) y el óxido nitroso (N2O) generadas en varias etapas del proceso productivo, reducen la eficiencia energética y son perjudiciales para el medio ambiente. Los subproductos agroindustriales como el orujo de uva son una fuente alternativa de fibra, proteínas y lípidos de alta digestibilidad con potencial para la alimentación animal, además de ser fuente de compuestos bioactivos, como polifenoles y grasas, que pueden ejercer efectos positivos en el rendimiento productivo, la composición nutricional de los productos finales, la excreción de nitrógeno y las emisiones de CH4. Se realizaron seis estudios con el objetivo de evaluar los efectos de uso del OU País y de un extracto polifenólico estandarizado de orujo de uva (OU) País, en dietas para rumiantes utilizando los sistemas de fermentación in vitro discontinuo (batch) y semicontinuo (Rusitec). El primer estudio evaluó los efectos de las condiciones de secado (liofilización y secado en horno a 40ºC durante 72 h y 60ºC durante 48 h) sobre el contenido de compuestos bioactivos, la capacidad antioxidante y la composición química del OU País. Posteriormente se utilizó un sistema de fermentación in vitro (batch) para evaluar los parámetros de fermentación ruminal y el potencial de mitigación de CH4 del OU País bajo distintas condiciones de secado. El secado en horno a 60ºC durante 48 h de OU País retuvo el mayor contenido de proantocianidinas (68.9 mg de catequina equivalente/g de materia seca [MS]), y menores contenidos de cenizas, extracto etéreo y carbohidratos no fibrosos. Las muestras secadas en estas condiciones generaron una menor producción y rendimiento de CH4, indicando que estas condiciones de secado permiten conservar el valor nutricional del OU País (contenidos de compuestos fenólicos, grasa y fibra), prolongar su vida útil y, su uso como ingrediente en la alimentación de rumiantes. En el segundo estudio se determinaron las condiciones óptimas de extracción asistida por microondas (EAM) para obtener un extracto polifenólico estandarizado de OU País. Estableciendo el rendimiento de extracción, contenidos de polifenoles totales (CPT), contenidos de proantocianidinas (PA) y capacidad antioxidante, para deteerminar la eficiencia del proceso de extracción. En comparación con la extracción sólido-líquido convencional, la EAM incrementó en 59% los CPT, en 60% los PA y en 182% la capacidad antioxidante de los extractos obtenidos. Los principales compuestos fenólicos primarios del extracto de OU País, identificados por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), fueron ácido gálico, ácido cafeico, ácido cumárico, quercetina, naringina, kaempferol, catequina y epicatequina. El perfil lípidico del OU País esta constituido por 17.4% de ácidos grasos saturados y 82.3% de ácidos grasos insaturados, de los cuales el ácido graso linoleico el más abundante (60.4% del total). En el tercer estudio se evaluaron los efectos de la inclusión de OU País a diferentes concentraciones (0, 10%, 20% MS) en dietas para rumiantes altas (AF) y bajas en forraje (BF) sobre la producción de CH4 y los parámetros de fermentación ruminal en un cultivo in vitro tipo batch. La inclusión de OU al 10% y 20% MS redujo las concentraciones de nitrógeno amoniacal en 48% y 58% respectivamente sin diferencias entre el tipo de dieta. Se registró una reducción el porcentaje de CH4 en gas, las concentraciones de CH4 por materia seca (MS) desaparecida del 14%, por la inclusión de OU al 20% MS, aunque este nivel de inclusión generó una reducción en las concentraciones de ácidos grasos volátiles (AGV) en los dos tipos de dieta. Estos resultados indican que la sustitución parcial de las fuentes fibrosas por OU País seco, hasta un 20% MS en dietas altas y bajas en forraje tiene el potencial de reducir la producción de nitrógeno amoniacal y la producción y el rendimiento de CH4, sin embargo, es esperable una reducción de la desparición in vitro de la MS (DIVMS) cuando sustituye fuentes forrajeras de mayor calidad. El cuarto estudio evaluó los efectos de la inclusión de OU País al 20% MS en dietas para rumiantes altas (AF) y bajas (BF) en forraje, sobre los parámetros de fermentación ruminal, desaparición de nutrientes, producción de CH4 y las poblaciones de metanógenos, hongos y principales bacterias fibrolíticas en un sistema de fermentación Rusitec. En este ensayo se usó OU País para sustituir parcialmente el heno mixto en la dieta AF, y totalmente el ensilaje de maíz en la dieta BF. Los resultados de este estudio indican que la inclusión de OU País 20% MS puede reducir la degradación de la proteína, la producción de nitrógeno amoniacal y las emisiones de CH4, en dietas altas en forraje sin comprometer la digestión de nutrientes, pero su inclusión en dietas bajas en forraje puede reducir la DIVMS y la desaparición de fibra, por efectos sobre las poblaciones fibrolíticas presentes en el cultivo. Este estudio permitió determinar que la inclusión de OU País reduce las poblaciones de metanógenos presentes en las fracciones sólidas y líquidas de cultivo y modifica las poblaciones de microorganismos fibroliticos sin afectar su funcionalidad. El quinto estudio evaluó los efectos de dosis crecientes (0, 0.7, 1.4 y 2.1% MS) de un extracto polifenólico estandarizado de orujo de uva País (EOU) sobre los parámetros de fermentación ruminal, desaparición de nutrientes, producción de CH4 y las poblaciones de metanógenos, hongos y principales bacterias fibrolíticas de una dieta alta en forraje (AF) en un sistema de fermentación semicontinuo Rusitec. La inclusión del EOU a la dieta no afectó la DIVMS, la producción de gas, la producción total de AGV, o la producción de ácido acético, pero incrementó la desaparición in vitro de la fibra detergente neutro (FDN), y redujo la desaparición in vitro de la proteína cruda (PC), la producción diaria de nitrógeno amoniacal (N-NH3) y la proporción molar de los ácidos grasos de cadena ramificada (AGCR; iso-valerato + iso-butirato). La inclusión de EOU hasta 2.1% MS en una dieta AF redujo la producción y el rendimiento de CH4 hasta un 30%, redujo las poblaciones de metanógenos totales y las poblaciones de Fibrobacter succinogenes, una de las principales bacterias celulolíticas del rumen, sin embargo, las poblaciones de Ruminococcus albus, Ruminococcus flavefaciens y de hongos se incrementaron por efecto del EOU. El sexto estudio evaluó los efectos de un extracto polifenólico de OU País solo (2.1% MS) o en combinación con aceite de OU en dosis crecientes (2.5% y 5% MS) en una dieta AF sobre los parámetros de fermentación, la producción de CH4 y las poblaciones microbianas, en condiciones in vitro en un sistema de fermentación tipo batch. La inclusión de aceite de OU redujo la DIVMS, pero no las concentraciones de AGV totales, e incrementó en 18% la proporción molar de propionato. Una reducción en la concentración de N-NH3 en 29% y las concentraciones molares de AGCR en 18% por efecto del extracto de OU, pero no hubo efectos por el aceite de OU. La producción de CH4 fue reducida en 31% y el rendimiento de CH4 en 34% por efecto de la interacción ente el extracto de OU y el aceite de OU cuando se evaluó la dosis máxima de aceite de OU (5% MS). Las poblaciones de metanógenos fueron reducidas por la interacción entre el extracto de OU y el aceite de OU. Las poblaciones de Butyribvibrio fibrisolvens se incrementaron por efecto de la interacción entre el extracto de OU y del aceite de OU. De acuerdo con estos resultados es posible concluir que el extracto polifenólico de OU País posee un mayor potencial antimetanogénico que el aceite de OU o su combinación, además no afecta la fermentación ruminal, y posee un gran potencial para reducir la proteolisis ruminal. Los resultados indican que el secado en horno a 60°C durante 48 horas permite conservar el valor nutricional del OU País (compuestos fenólicos, grasa y fibra), prolongar su vida útil y su uso como ingrediente en dietas para rumiantes. El OU País puede ser incluido en dietas de rumiantes en sustitución parcial de fuentes forrajeras de calidad media, sin afectar la fermentación ruminal, y con efectos positivos como la reducción en la producción de N-NH3 y la producción de CH4 por MS incubada y desaparecida. Su inclusión modifica la estructura de las poblaciones microbianas del rumen, sin perjudicar la diversidad microbiana, la DIVMS, o la producción de gas. Estos resultados indican que los efectos del OU País y su extracto polifenólico sobre la producción y rendimiento de CH4 son resultado de un efecto directo de los polifenoles y los taninos condensados (TC), así como del aceite de OU País sobre los microorganismos involucrados en la metanogénesis.
Generación de embriones bovinos por transferencia nuclear somática: evaluación de la capacidad de desarrollo in vivo e in vitro y de la expresión génica en las etapas pre y peri-implantatorias
(Universidad de Concepción., 2009) Rodríguez Alvarez, Lleretny; Castro Reboredo, Fidel Ovidio
La clonación somática es una poderosa herramienta para la producción de animales con un genotipo específico, ya sea para fines productivos a través de la multiplicación de ejemplares de alto valor genético, la creación de animales transgénicos o para la conservación de especies en peligro de extinción. En la última década esta tecnología se ha ido perfeccionando y hoy en día se ha logrado la obtención de clones en dieciséis especies de mamíferos. La aplicación de la transferencia nuclear es limitada debido a la ineficiencia del proceso en término de animales nacidos y al desconocimiento de la expresión génica que gobierna el proceso de clonación, por lo que es sujeto de estudio a nivel mundial. En este trabajo se empleó una metodología novedosa de transferencia nuclear somática, conocida como Hand Made Cloning (HMC) para generar embriones bovinos clonados, usando dos líneas celulares distintas como donantes de núcleo, una de fibroblastos de piel de un animal adulto y la otra de un feto. Se evaluó el potencial de desarrollo de los embriones generados con ambas líneas, en términos de desarrollo in vitro hasta blastocistos, así como morfología y calidad. Se demostró que con la línea celular adulta es posible generar con mayor eficiencia y calidad embriones clonados en bovinos. Para caracterizar la expresión génica en blastocistos (etapa peri-implantatoria) generados a partir de ambas líneas se empleó PCR tiempo final y real y se comparó ésta con los patrones de expresión de embriones producidos mediante fecundación in vitro (FIV). Se estudiaron los patrones de expresión de genes cruciales para el desarrollo embrionario, concluyendo que los mismos son diferentes entre las líneas celulares y entre éstas y los embriones de FIV. Los patrones de expresión génica de los embriones producidos con la línea celular adulta fueron más parecidos a los de los controles, por ello y por el mayor potencial de desarrollo hasta blastocistos de calidad, se seleccionó esta línea para la producción de embriones elongados (día 17) y de clones a términos. Se transfirieron a hembras receptoras embriones clonados producidos a partir de la línea celular adulta, así como controles producidos por FIV y se recolectaron al día 17. A partir de estos embriones, se estudiaron los patrones de expresión génica por técnicas de PCR tanto a tiempo real como final de los embriones elongados (etapa peri-implantatoria) clonados y de FIV, siendo diferencial la expresión entre ambos y ésta a su vez diferente con respecto a los blastocistos de día 7, tanto para FIV como para los clones. Estos hallazgos, así como la cuantificación de los niveles de expresión de algunos genes cruciales para el desarrollo embrionario temprano, constituyen los primeros reportes de su tipo en la literatura del tema. Adicionalmente se estudió a nivel global, la expresión génica en embriones clonados a partir de células adultas y producidos por FIV, mediante microarreglos, se encontraron más de mil genes expresados en ambos grupos y de éstos alrededor del 4% se encontró diferencialmente expresado (hiper o hipo expresión) en los embriones clonados. Los datos del microarreglo fueron validados por PCR cuantitativo (PCR tiempo real), lo cual a su vez ofreció resultados novedosos en el tema, al reportarse por primera vez los niveles de expresión de ciertos genes en embriones bovinos elongados. Como elemento final, se transfirieron embriones clonados a hembras receptoras, lográndose gestación en la mitad de las hembras transferidas, lo que redundó en el nacimiento de dos terneras clonadas. La eficiencia del proceso fue similar a la descrita para la técnica de HMC y para la especie bovina. A pesar de las pérdidas gestacionales observadas, que también coinciden con lo reportado para la especie, se logró por primera vez en Chile el nacimiento de terneros clonados viables.
Generación de embriones bovinos por transferencia nuclear somática: evaluación de la capacidad de desarrollo in vivo e in vitro y de la expresión génica en las etapas pre y peri-implantatorias.
(Universidad de Concepción., 2009) Rodríguez Álvarez, Lleretny; Castro Reboredo, Fidel Ovidio
La clonación somática es una poderosa herramienta para la producción de animales con un genotipo específico, ya sea para fines productivos a través de la multiplicación de ejemplares de alto valor genético, la creación de animales transgénicos o para la conservación de especies en peligro de extinción. En la última década esta tecnología se ha ido perfeccionando y hoy en día se ha logrado la obtención de clones en dieciséis especies de mamíferos. La aplicación de la transferencia nuclear es limitada debido a la ineficiencia del proceso en término de animales nacidos y al desconocimiento de la expresión génica que gobierna el proceso de clonación, por lo que es sujeto de estudio a nivel mundial. En este trabajo se empleó una metodología novedosa de transferencia nuclear somática, conocida como Hand Made Cloning (HMC) para generar embriones bovinos clonados, usando dos líneas celulares distintas como donantes de núcleo, una de fibroblastos de piel de un animal adulto y la otra de un feto. Se evaluó el potencial de desarrollo de los embriones generados con ambas líneas, en términos de desarrollo in vitro hasta blastocistos, así como morfología y calidad. Se demostró que con la línea celular adulta es posible generar con mayor eficiencia y calidad embriones clonados en bovinos.
Identificación y caracterización de células madre mesenquimales en endometrio bovino durante el ciclo estral y postparto sano y con endometritis.
(Universidad de Concepción., 2017) Lara Navarrete, Evelyn Elia; Castro Reboredo, Fidel Ovidio
El objetivo de esta investigación fue identificar y caracterizar células madre mesenquimales en endometrio bovino a través del ciclo estral y en el postparto de vacas sanas y con endometritis. Por lo tanto, se plantea que el endometrio bovino presenta poblaciones de células madre mesenquimales y células progenitoras estromales que expresan marcadores de pluripotencia/multipotencia que varían en función del transcurso del ciclo estral y de la inflamación inherente a procesos patológicos puerperales. Este estudio permitió establecer un modelo animal para la obtención y caracterización de células madre mesenquimales en endometrio, lo que puede ser de gran utilidad en la obtención, identificación y caracterización de estas células en otras especies y/o potencial uso en medicina regenerativa.
Plasticidad de células felinas diferenciadas y su transición a mayores niveles de potencia.
(Universidad de Concepción., 2019) Echeverry Berrío, Diana Maritza; Castro Reboredo, Fidel Ovidio
La obtención de células madre mesenquimales (MSC) en algunas ocasiones puede ser un procedimiento invasivo en los felinos, particularmente cuando existen patologías, traumas o situaciones específicas en las cuales está contraindicado el procedimiento quirúrgico para obtener biopsias de tejido. La inducción de células somáticas diferenciadas hacia células madre mesenquimales es una herramienta recientemente descrita en humanos y ratones, la cual promete ser exitosa y evadir las complicaciones descritas. Esta metodología se basa principalmente en modificar la expresión génica de las células diferenciadas con el uso de remodeladores epigenéticos, factores de crecimiento y pequeñas moléculas que facilitan la reconversión o de-diferenciación para la obtención de un mayor nivel de potencia. El objetivo del presente estudio fue evaluar la plasticidad de dos tipos celulares de origen felino, fibroblastos y células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo (AMSC), frente a varios protocolos de inducción a multipotencia. Para lograr este objetivo se emplearon dos remodeladores epigenéticos, el ácido valproico y la 5-azacitidina, junto con plasma rico en plaquetas como fuente de factores de crecimiento, factor de crecimiento epidermal y factor de crecimiento derivado de plaquetas para conferir características multipotentes a las células reprogramadas. En este estudio también se produjo el factor de crecimiento derivado de plaquetas (h-PDGF-B) por transfección estable de células mamíferas. Los fibroblastos y AMSC fueron obtenidos de gatas domésticas entre 6 meses y 3 años. Los protocolos fueron estandarizados y se evaluó su efectividad en inducir características multipotentes reflejadas en expresión de genes de pluripotencia, marcadores de superficie y capacidad de diferenciación mesodérmica. La expresión de OCT4 incrementó significativamente en fibroblastos felinos (p < 0,05), así mismo se logró la diferenciación hacia linajes mesodérmicos (adipogénesis, condrogénesis y osteogénesis) con el uso del protocolo de reprogramación con 5AZA y VPA durante 12 días. Otros tratamientos arrojaron resultados parciales, confiriendo aumento en la expresión de OCT4 y/o capacidad limitada de diferenciación hacia uno o dos linajes mesodérmicos. Las AMSCs por su parte no presentaron cambios significativos en la expresión de genes o potencial de diferenciación con el uso de los remodeladores epigenéticos, con excepción de potenciar la diferenciación osteogénica con el pretratamiento con estas moléculas. Los resultados obtenidos demuestran que las células somáticas felinas presentan determinada plasticidad que puede ser aprovechada para diferentes eventos de reprogramación celular, en este caso, para obtener un estado multipotente o favorecer la diferenciación hacia determinado linaje mesodérmico. Sin embargo, este protocolo requiere algunos ajustes en orden de lograr una mayor eficiencia de reprogramación de fibroblastos hacia iMSCs. Estos resultados son de importancia para en el área de la medicina regenerativa y otras aplicaciones biotecnológicas en especies de la familia Felidae.
Pre-condicionamiento in vitro de células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo equino, como herramienta para potenciar la adquisición de una mayor capacidad inmunomoduladora.
(Universidad de Concepción., 2018) Cabezas Salazar, Joel Gustavo; Castro Reboredo, Fidel Ovidio
El objetivo de este trabajo fue aislar MSC desde tejido adiposo y evaluar atributos biológicos e inmunobiológicos a travez del precondicionamiento con PGE2, Sustancia P e IFNγ (molécula precondicionante canónica). Aquí aislamos y caracterizamos con éxito las MSC derivadas de tejido adiposo. Dichas células mostraron morfología similar a los fibroblastos, crecieron en plástico, duplicaron los tiempos de población de 46.4 ± 3.38 h, se diferenciaron en tres linajes (osteo, condro y adipogénicos) después de inducciones apropiadas, migraron hacia la atracción de Suero Fetal Bovino y exhibieron un patrón de marcadores de superficie comúnmente aceptados para caballos MSC. Todas estas son propiedades de MSC. Las células fueron precondicionadas con PGE2, SP e IFNγ y se evaluó la capacidad de las MSC de regular poblaciones de PBMC y la secreción de proteínas bajo estos estímulos. El precondicionamiento resultó en una mantención de las propiedades biológicas de las MSC virgen al precondicionarlas con PGE2 y SP, pero no así con IFNγ y un aumento en las propiedades inmunobiológicas de las MSC bajo los estímulos con PGE2 y SP, tratamiento que resultó ser el que mayor efectos inmunomoduladores generó sobre las MSC, como una mayor capacidad de inhibir poblaciones de PBMC activadas, producción de linfocitos T reguladores (CD4, CD25 y FOXP3)+ y un patrón de secreción de proteínas totamente diferente al estado virgen de éstas células, resultando en el primer análisis conocido de este tipo en MSC de equinos. En conclusión, las MSC derivadas de tejido adiposo equino, pueden ser precondicionadas in vitro, con el tratamiento de PGE2 y SP, para adquirir características que le otorgen un licenciamiento inmunológico más potente sin perder sus características biológicas de MSC. Posiblemente IFNγ, la molécula canónica para otorgar este licenciamiento en MSC, no resulta ser para las MSC equinas.
Reprogramación de células somáticas de güiña (Leopardus guigna) mediante transferencia nuclear heteroespecífica utilizando ovocitos maduros de gata doméstica (Felis silvestris catus).
(Universidad de Concepción., 2018) Veraguas Dávila, Daniel Martín; Rodríguez Álvarez, Lleretny
Actualmente existe un aumento en los trabajos de investigación relacionados al desarrollo de técnicas de reproducción asistida en el gato doméstico con el propósito de implementar estas técnicas en especies de felinos amenazados. La güiña (Leopardus guigna) es una especie endémica de Chile, clasificada como vulnerable según la lista roja de la IUCN (International Union for Conservation of Nature). Debido a esto, la transferencia nuclear somática heteroespecífica (TNSh) podría ser una potencial herramienta para generar embriones de güiña utilizando ovocitos enucleados de gata doméstica y de esta manera a ayudar a su conservación. Sin embargo, los embriones generados por TNSh presentan un bajo potencial de desarrollo principalmente debido a una ineficiente reprogramación nuclear. Por lo cual la hipótesis de esta tesis fue “la transferencia de células somáticas de guiña a ovocitos de gata doméstica genera embriones clonados con similar morfología y expresión génica a los embriones clonados utilizando células de gato doméstico”. De acuerdo a los resultados obtenidos, se demostró que el tratamiento con 200 UI de eCG mejoró la calidad morfológica y el patrón de expresión génica de los complejos cúmulo-ovocito (CCOs) colectados. Por lo cual este protocolo fue seleccionado para la posterior generación de embriones. En cuanto a la sincronización del ciclo celular, se demostró que tanto los fibroblastos de gato doméstico como de güiña pueden sincronizarse en la fase G0/G1 por medio de los métodos de privación de suero e inhibición por contacto. Sin embargo, en el caso de los fibroblastos de güiña la exposición a estos tratamientos por más de tres días genera un efecto negativo sobre la viabilidad celular. Por lo cual, se eligió la privación de suero por no más de tres días para la sincronización celular. Adicionalmente, fue posible demostrar que los embriones de gato doméstico generados por FIV utilizando el tratamiento con eCG son capaces de desarrollarse tanto in vitro como in vivo, con la generación de crías vivas. Además, se demostró que la remoción de la zona pelúcida no afecta el potencial de desarrollo in vitro de los embriones de gato. Finalmente, se demostró que en los embriones de gato doméstico generados por TNS la agregación embrionaria mejora el potencial de desarrollo in vitro aumentando la tasa de blastocistos. En el caso de los embriones de güiña generados por TNSh, solo los xix embriones cultivados en agregado lograron alcanzar el estadio de blastocisto en un bajo porcentaje. Al realizar el análisis de expresión génica, se observó que los blastocistos clonados de gato doméstico presentaban una menor expresión de OCT4 en comparación a los blastocistos generados por FIV. Por otro lado, solo uno de los embriones de güiña generados expresó OCT4, sin expresar ninguno de los otros genes de pluripotencia y diferenciación evaluados. De acuerdo a los resultados obtenidos se puede concluir que el ovocito de gata doméstica es capaz de reprogramar las células somáticas de güiña a través de la TNSh. Sin embargo, la mayoría de los embriones clonados de güiña quedan detenidos en el estadio de mórula y solo un bajo porcentaje de estos logran alcanzar el estadio de blastocisto al ser cultivados en agregado. Lo cual se podría deber a una ineficiente reprogramación nuclear

Browse

Browsing Tesis Doctorado by Title

Results Per Page

Sort Options