Interacción diferencial de las isoformas de hC/EBPβ con proteínas HMG
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Date
2017
Authors
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Publisher
Universidad de Concepción.
Abstract
La transcripción es un proceso altamente regulado, en el cual existe la participación de una gran cantidad de proteínas como los factores de transcripción, complejos remodeladores de cromatina y otras proteínas nucleares. Entre estas últimas se encuentran las proteínas HMG, las cuales tienen una función directa en la regulación del estado de la cromatina al tener la capacidad de doblar el ADN, competir con la histona H1 por sitios de unión a la cromatina y, en algunos casos, de estimular actividad remodeladora de cromatina dependiente de ATP. Así, estas proteínas pueden facilitar la acción de complejos remodeladores de cromatina y factores de transcripción, lo que se traduce usualmente en una activación de la transcripción. Entre los factores de transcripción con los cuales se ha descrito participación junto a proteínas HMG se encuentra C/EBPβ, un factor que participa en procesos de diferenciación y proliferación, entre otros. Esta proteína se presenta como tres isoformas: C/EBPβ1, C/EBPβ2 y C/EBPβ3, en donde generalmente C/EBPβ1 y C/EBPβ2 actúan como activadores transcripcionales, mientras que C/EBPβ3 actúa como un represor transcripcional. Se ha descrito que hC/EBPβ y HMGA1 interaccionan físicamente y esta última estimula la unión de C/EBPβ al promotor del gen del receptor de insulina (INSR) humano. Sin embargo, no se ha determinado si existe interacción diferencial entre las isoformas de C/EBPβ con HMGA1. Para HMGB1 solo se ha descrito una posible interacción física con C/EBPβ1 en forma teórica. En este contexto, análisis de GST pull-down asociados a espectrometría de masas realizados en nuestro laboratorio sugirieron la existencia de interacción diferencial entre las isoformas de hC/EBPβ y HMGA1 (igualmente para HMGB1). Por otro lado, también se observó interacción entre hC/EBPβ3 y la histona H1. En esta tesis se buscó verificar la existencia de estas interacciones,
a través de ensayos de GST pull-down asociados a inmunodetección, analizando la influencia de C/EBPβ sobre la unión de HMGB1 y HMGA1 a regiones regulatorias de genes, mediante ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Para los ensayos de ChIP, se seleccionó genes blanco analizando por qRT-PCR variaciones en niveles de ARNm tras sobreexpresión de cada isoforma de C/EBPβ. Se realizaron además ensayos de EMSA para observar la influencia de estas interacciones sobre la unión de las isoformas de C/EBPβ y las proteínas HMG a sus secuencias en el ADN. Los resultados obtenidos, muestran la existencia de interacción diferencial entre las isoformas de C/EBPβ y las proteínas HMG, lo cual no se observó para la histona H1. Por otro lado, nuestros ensayos de qRT-PCR mostraron que los genes ALB, SMAD6, BRCA2, INSR y CCND1 son regulados de manera diferencial por las isoformas de C/EBPβ. Adicionalmente, los análisis de ChIP mostraron que al sobreexpresar C/EBPβ1 aumenta la unión de HMGB1 a los promotores de estos genes blanco, con similar resultado para HMGA1 en algunos de estos genes. Sin embargo, en los ensayos de EMSA no se observó el mismo efecto para HMGA1, situación que podría deberse a la distancia en los probadores utilizados entre el sitio de unión para HMGA1 y C/EBPβ, como lo sugieren análisis adicionales de este tipo realizados en nuestro estudio.
Los resultados obtenidos en esta tesis conforman una base que estimula la realización de estudios futuros que aborden aspectos funcionales de la interacción diferencial de las isoformas de C/EBPβ con estas proteínas HMG, como es estudiar condiciones fisiológicas bajo las cuales estén ocurriendo estas interacciones, influencia de la distancia entre los sitios de unión para C/EBPβ y HMGA1 y el efecto de estas interacciones sobre la acción de otras proteínas o complejos de proteínas que puedan afectar la regulación transcripcional.
Description
Tesis para optar al grado de Magíster en Bioquímica y Bioinformática.
Keywords
Transcripción Genética, Cromatina - Análisis, Isoformas de ARN, Electroforesis.