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Item SVCT2 y sus efectos en la arborización dendrítica de motoneuronas humanas; un modelo de Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) in vitro.(Universidad de Concepción, 2024) Smith Ghigliotto, Javiera Fernanda; Nualart Santander, Francisco; Salazar Martínez, KatterineLa Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa multifactorial caracterizada principalmente por la pérdida selectiva y progresiva de motoneuronas (MNs). Los pacientes rara vez sobreviven más de 5 años luego de la aparición de los síntomas, debido a que el conocimiento limitado de sus causas subyacentes ha dificultado el desarrollo de terapias con efectos más significativos que los modestamente desarrollados hasta ahora. La primera mutación descubierta causante de ELA se encuentra en el gen que codifica la Superóxido Dismutasa de Cobre y Zinc 1 (SOD1), una enzima antioxidante que cataliza la dismutación del anión superóxido en oxígeno y peróxido de hidrógeno, cuyas mutaciones se convierten en la segunda causa más frecuente de la enfermedad. En específico, la mutación SOD1G93A, el modelo más utilizado en el estudio de la enfermedad provoca en un primer momento, estrés oxidativo y reducciones en la arborización dendrítica y axonal, seguido de hiperexcitabilidad, denervación y finalmente la muerte de MNs. En el desafío de buscar moléculas neuroprotectoras en el contexto de ELA, investigaciones anteriores han asociado a deficiencias en los niveles de vitamina C (VC), con un alto riesgo en la obtención de la enfermedad, lo que podría explicarse principalmente por sus propiedades antioxidantes, así como por el fortalecimiento que el ácido ascórbico (AA), la forma reducida de la VC y su transportador cerebral, SVCT2 provocan en la viabilidad celular y en la diferenciación y maduración de distintas células neuronales, demostrando así, sus efectos neuroprotectores. Por lo tanto, nuestra hipótesis de trabajo se basó en que la sobreexpresión de SVCT2 promueve la recuperación de la arborización dendrítica luego del daño celular inducido por la mutación SOD1G93A en un modelo in vitro de ELA en MNs espinales humanas generadas desde células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). En este contexto, se demostró que la sobreexpresión de SVCT2 en neuronas enfermas, recuperó el 63,9% y el 105% de la red dendrítica y axonal, respectivamente, redes que, fueron gravemente disminuidas por la mutación SOD1G93A. Por otra parte, en MNs la mutación causó pérdidas en la expresión de la tinción de la proteína presináptica piccolo y aumentos en la inmunofluorescencia de PSD95, probablemente fortaleciendo la excitotoxicidad. Mientras que al sobreexpresar SVCT2, las células recuperaron parcialmente los niveles de piccolo y disminuyeron la tinción de PSD95, probablemente reduciendo a su vez la excitotoxicidad. Los efectos morfológicos y a nivel de proteínas sinápticas provocados por la mutación SOD1G93A en nuestras MNs humanas representan temporalmente a la etapa presintomática de la enfermedad. Finalmente, la sobreexpresión de SVCT2 fortaleció la maduración morfológica de MNs sanas y recuperó la red dendrítica y axonal, previamente degenerada por la expresión de SOD1G93A en MNs humanas.Item Análisis del perfil metabolómico y de los micro ARN de nanovesículas extracelulares pequeñas derivadas de células madre/estromales mesenquimales tratadas con oligomicina.(Universidad de Concepción, 2024) Lagos Aillon, Raul Alejandro; Elizondo Vega, Roberto; Pérez de Armas, AndyLa osteoartritis (OA), es un trastorno articular caracterizado por la pérdida de cartílago hialino, alteraciones óseas e inflamación sinovial (IS), lo que conduce a dolor crónico y discapacidad progresiva. Las terapias celulares basadas en células madre/estromales mesenquimales (MSC) destacan por su capacidad para promover la regeneración del cartílago y reducir la IS. Antecedentes de nuestro equipo de investigación han explorado el impacto de la inducción de un metabolismo glucolítico mediante oligomicina (OLG) en las MSC, y sobre las vesículas extracelulares pequeñas derivadas (sEV) de MSC, en sus propiedades inmunomoduladoras y regenerativas. Datos no publicados indican que sEV de MSC pre-tratadas con OLG promueven el desarrollo de nuevo cartílago y reducen la inflamación en modelos de OA murinos. Para profundizar en los posibles mecanismos asociados a los efectos funcionales de las sEV, hemos decidido determinar el contenido del metaboloma, lipidoma y miRNA de las sEV derivadas de MSC de cordón umbilical (MSC-UC), y analizar su asociación con propiedades condroprotectoras y anti-inflamatorias. Mediante un análisis de secuenciación dirigida, identificamos un aumento significativo en la expresión de 178 miRNA bajo el tratamiento con OLG en sEV derivadas de MSC-UC. Diversos genes blanco de estos miRNA se encuentran asociados a la vía de señalización de TGF-β, la vía de señalización de p53, así como a genes que potenciarían cambios metabólicos. Los análisis metabolómicos a través de espectrometría de masa revelaron la presencia de metabolitos polares como estreptomicina y apolares como prostaglandina D, ácidos grasos y ácido palmítico. Finalmente, un análisis detallado del contenido de estos miRNA, nos permiten establecer una asociación entre el uso de sEV derivados de MSC-UC glucolíticas con sus efectos regenerativos y anti-inflamatorios. Este estudio contribuye a la profundización de los mecanismos asociados a la funcionalidad de las terapias basadas en sEV en el tratamiento de la OA.Item Evaluación de las comunidades microbianas en sedimentos de un área de uso acuícola (Fiordo Puyuhuapi, Chile) y su posible rol como reservorio de Piscirickettsia salmonis asociado al proceso productivo.(Universidad de Concepción, 2024) Villagrán Chacón, Soraya Betzabeth; Campos Araneda, Víctor; González Saldia, RodrigoLa salmonicultura es una actividad que impacta los sedimentos a través de los residuos de la alimentación. Los microorganismos juegan un rol fundamental en el reciclaje de la materia orgánica; sin embargo, el efecto de la salmonicultura sobre la composición microbiana aún es poco conocido. En particular, Piscirickettsia salmonis es una bacteria patógena presente en los cultivos durante largo tiempo en Chile. En este trabajo se estudiaron las comunidades microbianas asociadas al sedimento (metagenómica) y particularmente P. salmonis (qPCR), ya que el sedimento podría ser un posible reservorio. Así también, se determinaron los parámetros fisicoquímicos del sedimento (C, N, P, Redox y Materia Orgánica Total), en el área de estudio del fiordo Puyuhuapi. El programa de muestreo fue desde el inicio del periodo productivo (primavera 2022) hasta el otoño 2023. Se obtuvieron muestras en un gradiente desde las balsas jaulas de un centro productivo y hasta 7 kilómetros distante de él. Los resultados demuestran que existe un incremento significativo (p < 0,05), en la concentración de C, N, P y Redox, en los sedimentos a través del tiempo y una correlación significativa (p<0,05) de estos parámetros con la señal molecular (Log) de la presencia de P. salmonis. Así también, se observó un incremento de la diversidad de bacterias asociadas a la degradación anaeróbica de materia orgánica bajo la balsa jaula. Finalmente se determinó un incremento de la señal molecular de P. salmonis en los sedimentos del área de estudio a través del tiempo, siendo este el primer indicio de que esta matriz ambiental pudiese actuar como un reservorio, asociado al proceso productivo de la cría de salmón.Item Rol de la proteína codificada por el marco de lectura BAB2_0534 en la producción de melanina como un nuevo factor de virulencia en Brucella abortus 2308.(Universidad de Concepción, 2024) Coloma Rivero, Roberto Felipe; Oñate Contreras, ÁngelBrucella abortus es una bacteria Gram negativa facultativa e intracelular, causante de brucelosis bovina y humana, una enfermedad zoonótica que es responsable de pérdidas económicas considerables para los propietarios de animales con destino comercial. El proceso de infección de Brucella no está claro del todo, contemplando el alto número de rutas que tiene para infectar, establecer su nicho replicativo y evadir la respuesta inmune del hospedador, logrando sobrevivir a la acción de especies reactivas de oxígeno en células profesionales presentadoras de antígenos como macrófagos. Este mecanismo de evasión se presenta también en otros organismos de vida intracelular como Cryptococcus neoformans, una levadura que por acción de proteínas multi cobre oxidasa, como las lacasas forman pigmentos de melanina, ambos elementos considerados factores de virulencia. Las melaninas son compuestos químicos aromáticos coloreados con una alta carga negativa, presentes en diversos organismos tanto plantas, hongos y bacterias (Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas spp., Bacillus subtilis, etc); y participan en el mecanismo defensivo contra antibióticos y estrés oxidativo, atenuando la acción de células del sistema inmune y participando activamente, en ciertos casos; en el cambio de polaridad de los macrófagos a M2, y también en el cambio metabólico de ellos hacia una metabolismo de Warburg. B. abortus posee múltiples factores de virulencia descritos, pero aún no están del todo claros. Este trabajo tiene como objetivo identificar la función de la proteína multi cobre oxidasa, codificada en el marco de lectura BAB2_0534 de B. abortus 2308; vincularla a procesos de crecimiento bacteriano, tolerancia al cobre y al estrés ambiental, siendo su producto génico un potencial factor de virulencia, así como también el pigmento melanina que se formaría como producto enzimático en presencia del sustrato L-DOPA. El producto génico de BAB2_0534 participaría tanto en la evasión de la respuesta inmune en células macrofágicas, como en el cambio de polaridad de macrófagos a M2.Item Determinación de la capacidad de las cepas Limosilactobacillus fermentum UCO-979C y Lacticaseibacillus rhamnosus UCO-25A para modular la respuesta inmune en modelo celular THP-1 enfrentado a activadores Inmunológicos.(Universidad de Concepción, 2023) Valdebenito Navarrete, Héctor Isaías; García Cancino, ApolinariaCOVID-19, una infección producida por el virus SARS-CoV-2 en humanos, se extendió rápidamente hasta convertirse en una pandemia de alta mortalidad. Han surgido diversas variantes del virus, alterando la eficacia de los tratamientos y, por tanto, atrayendo la atención sobre terapias alternativas, entre ellas los inmunobióticos. Considerando que la microbiota intestinal puede alterar beneficiosamente la inmunidad intestinal así como la inmunidad pulmonar a través del eje intestino-pulmón, es que las propiedades inmunomoduladoras de las bacterias inmunobióticas cobran relevancia. Ante esta alternativa de tratamiento esta tesis tuvo por objetivo determinar la capacidad inmunomoduladora preventiva de las cepas probióticas L. fermentum UCO-979C y L. rhamnosus UCO-25A frente a activadores Inmunológicos (ARN viral de SARS-CoV-2, Agonista de TLR-3 y de TLR-7) en modelo celular THP-1, mediante la realización de ensayos de citotoxicidad y ensayos para medir la capacidad preventiva inmunomoduladora en el modelo celular enfrentados a los activadores inmunológicos por la técnica de citometría de flujo. Como resultado se obtuvo que las cepas redujeron la viabilidad de la línea celular casi en un 50%, esto se deba posiblemente a propiedades oncobióticas. También las cepas mostraron una acción dual tanto anti-inflamatoria modulando la respuesta de las citoquinas IL-1b, IL-6, IL-8 y TNF ante los enfrentamientos con los activadores inmunológicos y acción pro-inflamatoria aumentando los niveles de TNF cuando sólo se administran las cepas, y tienen una respuesta sinérgica en la modulación cuando son usadas en conjunto, como tratamiento previo a los activadores inmunológicos, por lo que podemos concluir que el uso de las cepas UCO 979-C y UCO 25-A sería una alternativa para mitigar la sintomatología de la infección por SARS-CoV-2 y sus variantes.Item Caracterización de la expresión de la familia de FGFs y FGFRs en la placa del techo diencefálica durante estadios embrionarios tempranos.(Universidad de Concepción, 2023) González Olivero, Maryori Fernanda; Caprile Elola-Olaso, Teresa; Farkas Pool, CarlosLos centros organizadores cerebrales son agrupaciones celulares situadas en las fronteras morfológicas que tienen la capacidad de secretar moléculas señalizadoras como las proteínas morfogénicas óseas (BMPs, bone morphogenic proteins), wingless (Wnts) o factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), las cuales influyen en la determinación de la identidad neuronal o glial en células neuroepiteliales adyacentes. Adicionalmente, los centros organizadores secundarios presentan un patrón diferencial de factores de transcripción, diferentes a las zonas aledañas. A la luz de este concepto, el órgano subcomisural (OSC) emerge como un candidato potencial para cumplir con las características de un centro organizador cerebral. Esto se sustenta en su ubicación estratégica en la interfaz entre el diencéfalo y el mesencéfalo, su diferenciación muy temprana como glándula cerebral, su expresión de diversos factores de transcripción, receptores (incluyendo leptina y FGF) y la secreción de OSC-espondina, una proteína vinculada con la proliferación y diferenciación del neuroepitelio y guía axonal. Basándonos en esta información, planteamos la hipótesis de que el OSC podría operar como un centro organizador cerebral secundario. Para dilucidar la función del OSC se realizaron análisis de RNA-seq en dos estadios, validación por RT-qPCR, identificación de proteínas mediante western blot y localización mediante inmunofluorescencia. Nuestro análisis transcriptómico de OSC en estadios HH23 (4 días de desarrollo) y HH30 (7 días de desarrollo) en embriones de pollo revela que el OSC opera como una glándula altamente secretora, con productos que pueden ser clasificados en tres grupos principales, que no son excluyentes entre sí. En primer lugar, identificamos moléculas implicadas en la guía axonal y la neurogénesis. En segundo lugar, encontramos una variedad de moléculas relacionadas con la secreción y la matriz extracelular. Por último, observamos la presencia de factores de crecimiento y hormonas en el OSC. Dentro de los múltiples productos secretorios encontrados, se analizó en detalle la expresión de diversos receptores de FGF en el techo diencefálico. Nuestra evidencia sugiere que el OSC podría secretar FGF hacia el líquido cefalorraquídeo, lo que podría activar señalización paracrina en el neuroepitelio cercano. Además, la presencia de receptores de FGF en el propio OSC sugiere la posibilidad de una señalización autocrina en esta región. Los resultados obtenidos sugieren fuertemente un rol morfogénico del OSC, y apoyan la hipótesis de que sería un nuevo centro organizador cerebral.Item Determinación del efecto de precursores semisintéticos de epicatequina y teaflavinas lipofílicas preparadas a partir de ellos sobre la formación de biopelículas in vitro de las bacterias asociadas a cáncer colorrectal Escherichia coli 25922, Bacteroides fragilis 25285 y Fusobacterium nucleatum 25586 y de las bacterias probióticas Limosilactobacillus fermentum UCO-979C y Lacticaseibacillus rhamnosus UCO-25A.(Universidad de Concepción, 2023) Berríos Henríquez, Bárbara Andrea; García Cancino, Apolinaria; Pastene Navarrete, EdgarLa formación de biopelículas de B. fragilis enterotoxigénica, E. coli pks+ y F. nucleatum se han asociado epidemiológicamente con el cáncer colorrectal (CCR), sin embargo, con bacterias probióticas como Lactobacillus spp. se considera una propiedad beneficiosa. En este trabajo de tesis se ensayó el efecto antibacteriano y sobre biopelículas de teaflavinas naturales, precursores semisintéticos de epicatequina y teaflavinas lipofílicas sintetizadas a partir de ellos, sobre las cepas probióticas Limosilactobacillus fermentum UCO-979C, Lacticaseibacillus rhamnosus UCO-25A y patógenas Listeria monocytogenes 19115, Escherichia coli 25922, Bacteroides fragilis 25285 y Fusobacterium nucleatum 25586. Para esto, se realizaron ensayos de difusión en agar, CMI y CMB, en la que ninguno de los 3 grupos de compuestos presentó actividad antibacteriana; seguido de ensayos de formación de biopelículas mediante tinción con cristal violeta, en que todas las cepas fueron capaces de formar biopelículas in vitro en presencia y ausencia de los compuestos a la concentración de 500 μg/mL. Se observó estimulación en las biopelículas de las bacterias probióticas, principalmente por las teaflavinas lipofílicas, y, contrario a lo esperado, se obtuvo el mismo resultado para las cepas patógenas, siendo significativos sobre E. coli 25922 en presencia de los 3 compuestos. De esta forma, los compuestos produjeron un efecto mayormente estimulante que inhibitorio sobre la formación de biopelículas de las cepas ensayadas.Item Análisis de la región catalítica de agmatinase like protein (ALP).(Universidad de Concepción., 2023) Reyes Cuevas, María Belén; Uribe, Elena Amparo, profesora guía; Martínez-Oyanedel, José, profesor co-guíaLa agmatina es una amina que es hidrolizada por la enzima agmatinasa a putrescina y urea generando una vía alternativa de la síntesis de poliaminas. Esta amina posee propiedades de neurotransmisor y múltiples acciones farmacológicas. En el Laboratorio de Enzimología de la Universidad de Concepción se realizó el clonamiento de una proteína expresada en cerebro de rata con actividad agmatinasa in vitro, la cual fue denominada “agmatinase like protein” (ALP). Esta enzima contiene en su C-terminal un dominio LIM, el cual cumple un rol de regulación auto inhibitoria. ALP requiere manganeso para su actividad catalítica, al igual que las enzimas de la familia ureahidrolasas, sin embargo, posee un bajo grado de identidad con respecto a otras agmatinasas conocidas, por lo que, se desconoce la región y los residuos críticos en la secuencia que participan en la interacción con el cofactor metálico y en el proceso catalítico. En este trabajo a través de herramientas bioinformáticas, se generó un modelo comparativo estructural de ALP a partir del cual se han propuesto residuos putativos que estarían coordinando con los iones de Mn2+. Utilizando este modelo se generaron dos mutantes simples (E288A y D217A), una mutante doble (E288A/K290A) y una mutante triple (N213A/Q215A/D217A), ninguna de las cuales presentó actividad agmatinasa. Estos resultados apoyan nuestro modelo propuesto para los residuos que serían relevantes en la actividad catalítica de ALP y que se dan a conocer en el presente trabajo.Item Efecto de NUAK1 en el splicing de G6PD dependiente de hnRNPK en células de cáncer colorrectal.(Universidad de Concepción., 2023) Coliboro Dannich, Viviana Ivelise; Castro Alma, Ariel Fernando; profesor guía; Pincheira Barrera, Roxana; profesora guíaEl cáncer es una patología con elevada incidencia y mortalidad a nivel mundial, donde destaca el cáncer colorrectal. A nivel molecular, las células tumorales requieren reprogramar su metabolismo para poder sobrevivir a condiciones de estrés o permitir la patológica tasa de crecimiento y proliferación. En consecuencia, las células tumorales presentan elevada tasa biosintética, bioenergética alterada y necesidad de balance redox. En particular, se encuentra alterada la vía de las pentosas fosfato, que se ha descrito como fundamental en la transformación neoplásica. Esta vía es regulada principalmente a través de los niveles de G6PD, la enzima limitante. Esta enzima incrementa su expresión frente a distintos contextos, como el estrés oxidativo o el factor de crecimiento insulina. Adicionalmente se ha descrito como blanco de múltiples oncogenes. Un tipo de regulación para G6PD ocurre a nivel post-transcripcional, donde la ribonucleoproteína hnRNPK regula negativamente sus niveles de ARNm maduro al unirse al exón 12 y promover la retención de intrones. De manera interesante, en nuestro laboratorio encontramos que hnRNPK es un interactor nuclear de la quinasa NUAK1 y presenta potenciales sitios de fosforilación para esta quinasa, en los residuos de serina89 y serina417. NUAK1 es una serina/treonina quinasa de la familia de las AMP quinasas que está sobre expresada en diferentes tipos de cáncer y que se ha relacionado con una menor sobrevida y un peor pronóstico en general. Según los antecedentes, propusimos que NUAK1 favorece la respuesta proliferativa al fosforilar a hnRNPK, inactivándola e interfiriendo con su acción en el splicing de G6PD. Para dilucidar esta relación, estudiamos el rol de NUAK1 en el procesamiento de G6PD mediado por hnRNPK. Realizamos modelamientos moleculares para evaluar si la fosforilación de residuos serina89 y serina417 puede inducir un efecto inhibitorio en la unión de hnRNPK al pre-ARNm de G6PD. Obtuvimos un cambio conformacional que impide a la hnRNPK unirse al exón 12 de G6PD de manera eficiente. Por otro lado, evaluamos el efecto de NUAK1 en el procesamiento de G6PD, en la unión de hnRNPK con el ARNm inmaduro de G6PD y adicionalmente diseñamos un reportero de splicing de doble luciferasa. Encontramos que en la línea HCT116P53-/-, NUAK1 favorece el procesamiento del ARNm inmaduro de G6PD asociado a su regulación sobre hnRNPK. Nuestros hallazgos indican que NUAK1 regula los niveles de G6PD, y lo proponen como un potencial promotor de la vía de las pentosas.Item Biomarcadores Proteicos. Hacia el desarrollo de metodologías para la estimación del intervalo post mortem (IPM) en osamentas humanas.(Universidad de Concepción., 2023) Garcés Parra, Camila Catalina; Tarifeño Saldivia, Estefanía; profesora guíaLa estimación del intervalo post mortem (IPM) resulta todo un desafío, más aún cuando se enmarca en contextos forenses que requieren establecer la data de muerte de restos en etapas tardías de descomposición. Actualmente, las investigaciones tafonómicas buscan proporcionar marcadores que permitan desarrollar estimaciones precisas y objetivas, de manera tal que sean admisibles en los procesos judiciales. En dicho esfuerzo, los estudios de degradación proteica han resultado prometedores. La presente investigación exploró las dinámicas del proteoma de osamentas humanas a distintos IPM en términos de diversidad y abundancia, a fin de evaluar si estas son informativas para la estimación de la data de muerte en restos óseos. Para ello se tomaron muestras de tejido cortical de costillas y tibias de 15 individuos masculinos con edades entre 20 a 50 años provenientes de contextos cadavéricos y de resacas de cementerio, cuyos IPM corresponden a <1 año, 15 años y 20 años en muestras de costillas, y con IPM de 15 y 20 años para muestras de tibias. Los resultados proteómicos indican que muestras tempranas (IPM<1 año) exhiben una mayor diversidad y abundancia de proteínas que muestras tardías (IPM=15 y 20 años), identificando 7 proteínas discriminantes entre ambos IPM. Se observó que otras 7 proteínas siguen un decaimiento gradual y progresivo en su abundancia que se correlaciona significativamente con el aumento del IPM. A su vez, se evidenció que las propiedades estructurales de las proteínas como el peso molecular y composición aminoacídica podrían ser cruciales para la preservación post mortem. Se sugiere además que el uso de péptidos semitrípticos refleja mejor la degradación del proteoma en los análisis de espectrometría que los péptidos trípticos.Item Obtención de cepas mutantes de Mycobacterium sp. con actividad biotransformadora de fitoesteroles.(Universidad de Concepción., 2001) Vidal Oyarce, Maricel de Lourdes; Silva Osorio, Mario; Mondaca Jara, María AngélicaLas transformaciones microbiológicas de compuestos orgánicos han sido estudiadas desde hace varias décadas, siendo uno de los mayores aportes en la industria farmacéutica, para la obtención de antibióticos y esteroides. El consumo de esteroides y sus derivados han tenido un aumento continuo a nivel mundial, por otro lado, las fuentes de obtención, a partir de productos naturales mediante hemisíntesis química, han sufrido una disminución paulatina, debido a un agotamiento de la principal materia prima, las plantas del género Dioscorea. La ruta microbiológica, en la obtención de esteroides, nace como una alternativa de bajo costo y de menos etapas, en donde se han utilizado una variedad de cepas de hongos, bacterias y microalgas. En este trabajo, se seleccionaron cepas mutantes de Mycobacterium sp. MB-3683 y Mycobacterium fortuitum B-11045 con capacidad biotransformadora de fitoesteroles. Sobre estas cepas, se ejerció una presión selectiva mediante el uso de altas concentraciones de sustrato. Para esto, se cultivaron ambas cepas de Mycobacterium en un medio enriquecido con -sitosterol (14 gr/l) como única fuente de carbono. Durante este proceso, se realizaron siete traspasos sucesivos de los cultivos bacterianos en un período de dos meses. La extracción de productos de biotransformación se realizó con metanol y acetato de etilo y posteriormente los análisis cualitativo y cuantitativo se llevaron a cabo mediante cromatografía en capa fina, cromatografía gas-líquido (GLC) y GLC-masa. Bajo estas condiciones, se observó que después de los siete traspasos, las cepas Mycobacterium sp. MB-3683 y M. fortuitum B-11045, aumentaron su porcentaje de biotransformación desde un 20% a un 64% y desde un 34% a un 55%, respectivamente. Los productos de biotransformación obtenidos, en mayor proporción, para cada 2 experiencia fueron la androstenediona (AD) y androstadienediona (ADD). Además, se aisló a partir del quinto traspaso, un producto derivado del AD que posee un grupo hidroxilo en posición 9, que es una excelente alternativa para la obtención de un grupo de hormonas esteroidales, del tipo corticoides. Los resultados sugieren que, una elevada concentración de sustrato es un buen mecanismo selectivo de cepas más eficientes en la biotransformación de ß-sitosterol a bases esteroidales, y que, además, la biotransformación puede dirigirse hacia la obtención de productos definidos como el 9-OH-AD.Item Actividad antibacteriana y biocompatibilidad de nanopartículas funcionalizadas como desinfección en neoterapias endodónticas.(Universidad de Concepción., 2023) Jerez Olate, Christian Andrés; Sánchez Sanhueza, Gabriela; profesora guíaIntroducción: En endodoncia, existen múltiples infecciones de origen bacteriano, que provocan una enfermedad común conocida como periodontitis apical. Por consiguiente, el objetivo principal de los tratamientos en endodoncia es tratar o prevenir el desarrollo de lesiones perirradiculares asociadas a esta enfermedad, mediante la erradicación del componente bacteriano durante la preparación quimio-mecánica. Sin embargo, la tasa de éxito de dientes con estas lesiones alcanza un 85%, disminuyendo a un 68% en los retratamientos. En consecuencia, existe una búsqueda constante de nuevos materiales que puedan contribuir a mejorar la tasa de éxito de la terapia endodóntica. Desde esta perspectiva, basándonos en las beneficiosas propiedades y características antibacterianas y de biocompatibilidad de las nanopartículas metálicas, estas pueden ser una alternativa o coadyuvante a los protocolos actuales como nuevas terapias de desinfección. Objetivo: El objetivo de este estudio fue evaluar la actividad antibacteriana y la biocompatibilidad de nanogeles nanoestructurados de cobre y plata combinados con una matriz polimérica de PVA/PVP. Metodología: En primer lugar, se realizó un screening de la actividad antibacteriana de los nanogeles mediante la determinación de la cinética de muerte por el test de contacto directo frente a Enterococcus faecalis, seleccionando los nanogeles con mayor actividad antibacteriana. En segundo lugar, utilizando un modelo de diente ex vivo con una biopelícula bacteriana multiespecie madura de 21 días, se cuantificó la viabilidad bacteriana postratamiento de los nanogeles por medio de microscopia confocal; además, mediante, el uso de células humanas del ligamento periodontal y de la plataforma de célula viva en tiempo real IncuCyte S3 fue posible evaluar la biocompatibilidad de los nanogeles. Resultados y Conclusión: Este es el primer reporte en el cual se evalúan nanopartículas de cobre y plata estabilizadas con matrices poliméricas de PVA/PVP (nanogeles) en biopelículas bacterianas endodónticas multiespecies y la citotoxicidad empleando la plataforma de célula viva en tiempo real IncuCyte S3. Dentro de los resultados obtenidos en este estudio con relación a la actividad antibacteriana y la citotoxicidad de los nanogeles testeados, evidenciaron que el tiempo de utilización óptimo de estos nanomateriales frente a una biopelícula bacteriana endodóntica multiespecie, es a las 168 h. Asimismo, a medida aumentan los tiempos de acción frente a las células humanas del ligamento periodontal disminuye la citotoxicidad de los nanogeles, proporcionando un material alternativo al hidróxido de calcio durante la medicación en los tratamientos de conductos.Item Formulación probiótica derivada de cepas nativas de perro usada como complemento en el tratamiento de enfermedades gastrointestinales de mascotas.(Universidad de Concepción., 2023) Buldres Inzunza, Paula Kathein; Toledo Alonso, Jorge Roberto; profesor guíaEn este estudio se caracterizaron cepas potencialmente probióticas aisladas de la leche materna para su uso en enteropatías caninas. Se utilizaron dos cepas de leche materna canina y una cepa de leche materna porcina previamente caracterizadas según sus propiedades funcionales, propiedades presuntivas de seguridad y efecto inhibitorio sobre patógenos. Estas bacterias se formularon mediante liofilización y secado por atomización, comparando rendimiento y almacenamiento en tiempo normal y acelerado. Se analizaron el efecto citotóxico, adhesión al intestino y el efecto inmunomodulador de las formulaciones con mejor caracterización probiótica in vitro e in vivo. Se determinó que, en base al rendimiento de encapsulación y la viabilidad de las formulaciones, el recubrimiento óptimo para las cepas TUCO-17 y TUCO-4 fue FOS e inulina; y para la cepa TUCO-16 fue maltodextrina e inulina. Todas las cepas resultaron no citotóxicas en cultivos de células de perro MDCK y TUCO-17 mostró mayor adhesión a las células epiteliales intestinales. Resultó relevante que la administración de la formulación probiótica disminuyó la expresión de marcadores proinflamatorios in vivo, tanto en el intestino como en el bazo de ratones. Además, su administración en perros con alteraciones entéricas indujo una reducción de la duración de la diarrea, mejoró la consistencia de las heces y los parámetros clínicos. Finalmente, la combinación de estas tres cepas en estudio (TUCO-16, TUCO-17 y TUCO-4) cubriría las propiedades probióticas en formulación e inmunomodulación de todos los marcadores en estudio.Item Evaluación de protocolos de inactivación de cepas de Helicobacter pylori y su efecto sobre integridad de membrana y citotoxicidad sobre la línea celular AGS.(Universidad de Concepción., 2023) Arellano Arriagada, Luciano Andrés; García Cancino, Apolinaria del Rosario; profesora guíaDebido a que Helicobacter pylori presenta elevada resistencia antimicrobiana, se ha establecido como un microorganismo de alta prioridad para la Organización mundial de la salud. A raíz de esto, consensos internacionales han establecido los beneficios de desarrollar una vacuna contra el patógeno. Sin embargo, las distintas vacunas desarrolladas han fallado debido a la plasticidad de esta bacteria. Con el fin de ofrecer una alternativa terapéutica, este estudio se centró en la estandarización de los primeros pasos para el desarrollo de una autovacuna contra H. pylori, definida como vacunas constituidas por una cepa inactivada previamente aislada desde el paciente que presentó el foco infeccioso. Para esto, se estandarizaron protocolos de inactivación basados en calor, formaldehido, NaOH y etanol y se evaluó su capacidad para inhibir el crecimiento de 5 cepas clínicas y 2 cepas comerciales de H. pylori, obteniendo una completa inhibición mediante los cuatro protocolos. Por otra parte, también se evaluó la agresividad de estos protocolos sobre la membrana mediante microscopía de fluorescencia y de barrido, donde los protocolos mediados por formaldehido y etanol presentaron un menor daño a nivel de la integridad de membrana. Finalmente, se evaluó la citotoxicidad de las muestras mediante Sulforodamina B, donde al utilizar una densidad celular McFarland 1, los protocolos que presentaron una menor citotoxicidad fueron los mediados por calor y formaldehido. Los resultados obtenidos sugieren que el protocolo más prometedor son los mediados por formaldehido.Item Epigenética y Obesidad: Dilucidando qué Ocurre en las Neuronas Pomc.(Universidad de Concepción., 2023) Opazo Mellado, Valentina Paz; Tarifeño Saldivia, Estefanía; profesora guíaLas neuronas hipotalámicas POMC desempeñan un papel importante en el comportamiento alimentario, ya que pueden disminuir la ingesta de alimentos y aumentar el gasto energético en respuesta a las necesidades metabólicas. Sin embargo, múltiples evidencias han demostrado que, tras el desarrollo de obesidad, estas neuronas sufren diversas alteraciones en su normal funcionamiento que afectan su capacidad de inhibir el apetito. Un mecanismo molecular que podría estar involucrado en el desarrollo y/o mantención de estas alteraciones es la metilación del ADN, puesto que tiene la capacidad de regular la expresión génica y está fuertemente influenciada por factores ambientales como la exposición a dietas calóricas. Además, en particular con el gen Pomc, diferentes investigaciones han mostrado que la obesidad induce la hipermetilación de su promotor, interrumpiendo la señalización normal de la leptina; no obstante, aún se desconocen los efectos a nivel genómico. En este contexto, nos analizamos los efectos de la obesidad sobre el metiloma de las neuronas POMC y asociarlo con cambios en la expresión génica. Para ello, se expuso a ratones transgénicos POMC:eGFP machos a una dieta alta en grasas durante 11 semanas para inducir obesidad mediante dieta. Desde neuronas POMC purificadas por FACS se prepararon librerías de secuenciación de bisulfito de representación reducida (RRBS), luego de lo cual, se efectuó un análisis de metilación diferencial por locus CpG. Paralelamente, se utilizaron datos de RNA-seq generados a partir de neuronas POMC sometidas al mismo tratamiento (11 semanas de alimentación y purificación por FACS) para correlacionar los cambios de metilación con cambios en la expresión génica. Nuestros resultados revelan que la obesidad inducida por el consumo de una dieta alta en grasa provoca una profunda modulación del metiloma en las neuronas POMC caracterizada principalmente por la metilación en promotores proximales de los genes y, más específicamente, dentro de motivos de unión a factores de transcripción. Estos cambios en el estado de metilación, si bien ocurren en varios genes relevantes en el funcionamiento de las neuronas POMC (como Pomc, Cartpt y Stat3), no necesariamente están asociados con una modulación transcriptómica. De la respuesta transcripcional asociada a un cambio de metilación, destaca el aumento de Gal y Loxl3, genes asociados al consumo de grasa y señalización de STAT3, respectivamente; así como la disminución de genes anti apoptóticos como Gdnf y Ntrk1. De esta manera, es importante considerar que los resultados obtenidos en esta tesis son los primeros en dilucidar los efectos que la obesidad causa en la metilación de ADN a nivel genómico y más específico aún en neuronas POMC purificadas.Item Control de la Conductancia del Receptor GABAA por Residuos Intracelulares: Implicancias en la Regulación del Canal por Fosforilación.(Universidad de Concepción., 2023) Fraig Lobos, David Esteban; Moraga Cid, Gustavo; profesor guíaLos receptores de ácido -aminobutírico tipo A (GABAARs) son los principales responsables de la neurotransmisión inhibitoria en el sistema nervioso central (SNC) en mamíferos. Estos receptores pertenecen a la familia de canales iónicos pentaméricos activados por ligando (pLGICs). Cada subunidad que forma el pentámero, presenta una arquitectura común entre todos los miembros de la familia, con el extremo N-terminal (ECD) expuesto hacia el exterior de la membrana, conteniendo el sitio ortostérico, un dominio transmembrana (TMD) compuesto por 4 hélices alfa (TM1-TM4), de los cuales el dominio TM1 está unido al dominio N-terminal, el dominio TM2 delimita el poro central y los dominios TM3-TM4 se encuentran unidos por una larga asa localizada en el dominio intracelular (ICD). En un contexto funcional, el ICD de los GABAARs es blanco de acción de diversas proteínas quinasas, como PKA y PKC, las cuales regulan la función, el tráfico y expresión de los GABAARs. Diversos mecanismos moleculares han sido propuestos para explicar la modulación alostérica ejercida por eventos de fosforilación. Estos mecanismos proponen un aumento en la tasa de internalización luego de un evento de fosforilación. Además, se ha propuesto que la fosforilación de residuos en el ICD impacta sobre la estructura del ECD, afectado la afinidad del receptor por su agonista. Sin embargo, aun cuando estos mecanismos parecen plausibles, la posibilidad de que los eventos de fosforilación afecten propiedades intrínsecas del canal, como la probabilidad de apertura o su conductancia no han sido estudiados de forma extensiva. En esta línea, un trabajo reciente en otro miembro de la familia, el receptor de glicina alfa 3 (GlyR 3), ha propuesto que la fosforilación del residuo serina 346, localizado en el ICD, reduce de forma significativa la conductancia del canal. Usando registros de canal único en GlyR 3 que portan una mutación fosfomimética (S346E), los autores reportaron una reducción significativa de las corrientes unitarias, sin cambios en la distribución del receptor en la superficie de la membrana plasmática. En este contexto, debido a la estrecha relación, en términos de estructura, función y farmacología que existe entre los receptores GABAARs y GlyRs es posible sugerir que los efectos inhibitorios en las corrientes unitarias mediadas por la fosforilación del residuo S346 en el receptor GlyR 3 pueden constituir un mecanismo de acción conservado en los miembros de la familia. Basados en estos antecedentes, en el presente trabajo proponemos que “La introducción de una mutación fosfomimética en el residuo S410 en el ICD de la subunidad 2 del receptor GABAA altera la sensibilidad a GABA y la conductancia unitaria del receptor”. Usando registros electrofisiológicos en la modalidad de célula completa o de canal único se evaluó el efecto de la introducción de una mutación fosfomimética (S410E) en la actividad del receptor GABAAR 12. Los estudios de la respuesta macroscópica a concentraciones crecientes de GABA, mostraron que la introducción de la mutación S410E no tuvo impacto sobre los parámetros de afinidad aparente (EC50), corrientes máximas (Imax) o densidad de corriente (J). De manera interesante, los análisis de canal único mostraron que la introducción de la mutación S410E tuvo un impacto significativo en las corrientes unitarias del canal. Este efecto no fue observado cuando se introdujo una mutación no fosfomimética (S410A), indicando un efecto específico del residuo cargado negativamente. De esta forma, el presente trabajo propone que los efectos de una fosforilación en residuos localizados en el ICD pueden ser explicados por una reducción en la conductancia unitaria del canal, el cual es un mecanismo molecular conservado en al menos, dos miembros de la familia pLGICs.Item Estudio de la Función de Gαi2 sobre la Polaridad Celular y Dinámica de los Microtúbulos Durante la Migración Colectiva en Células de la Cresta Neural Craneal de Xenopus.(Universidad de Concepción., 2023) Villaseca Herrera, Soraya Constanza; Torrejón Quezada, Marcela Eliana, profesor guíaLa dinámica de los microtúbulos es esencial para la mantención de la polaridad celular durante la migración, ya que intervienen en el tráfico y destino de las proteínas requeridas para establecer una correcta polaridad antero-posterior. Sin embargo, cambios en la estabilidad de los microtúbulos podrían contribuir a la pérdida de esta polaridad, a la disrupción del desensamblaje de las adhesiones focales, a un cambio severo en el nivel de polimerización del citoesqueleto de actina, en resumen, afectar la migración celular colectiva. Análisis previos en nuestro laboratorio muestran que la proteína G heterotrimérica, específicamente Gαi2, regula la migración de las células de la Cresta Neural Craneal (CNC), ya que la pérdida de función de Gαi2 se traduce en la inhibición de la migración de estas células y deslocalización de proteínas de polaridad celular como Par3 y ζPKC, resultados que se apoyan con estudios de otros investigadores en células del sistema inmune, donde también la ausencia de Gαi2 inhibe la migración de los linfocitos T y macrófagos hacia los sitios de inflamación. Adicionalmente, también se ha reportado en C. elegans que Gαi controla la polaridad celular durante la división asimétrica, a través de la regulación de las fuerzas de los microtúbulos para orientar correctamente el huso mitótico. Por lo tanto, con el fin de indagar en el mecanismo funcional de la subunidad Gαi2 durante la migración celular, y con ello su posible contribución a regular los microtúbulos y la polaridad celular, en esta tesis se investigó el papel de la subunidad Gαi2 de la proteína G heterotrimérica en la CNC, una población embrionaria que migra extensivamente y colectivamente a lo largo del embrión con el fin de formar otros tejidos. Nuestros resultados muestran que Gαi2 se localiza en toda la célula, pero en la corteza celular se localiza cercana a la red de microtúbulos, posiblemente controlando la dinámica de éstos. La disminución de la expresión de Gαi2 a través de un morfolino específico, redujo fuertemente la despolimerización de los microtúbulos aumentando su estabilidad, afectando la polimerización del citoesqueleto de actina a través del aumento del tamaño de las protrusiones y el área de las adhesiones focales en el tiempo. También observamos un aumento en la actividad de Rac1 en el borde libre y en el contacto célula-célula, cambiando la localización de RhoA hacia el borde director, lo que en conclusión afecta la migración de la CNC. Este efecto pudo ser rescatado con bajas concentraciones de nocodazol como droga despolimerizante de los microtúbulos, y sólo parcialmente por inhibición de Rac1. Además, encontramos que Gαi2 interacciona con EB1, EB3, tubulina, α5-integrina y ζPKC, como se muestra por co-immunoprecipitación, lo que apoya el papel crítico de Gαi2 en la dinámica de los microtúbulos, el desensamblaje de las adhesiones focales y la polaridad celular. Por lo tanto, nuestros resultados nos permiten proponer a Gαi2 como un regulador maestro de la polaridad, morfología y dinámica de la adhesión célula-matriz, a través del control de la dinámica de los microtúbulos, y con ello, de la conversación cruzada entre los citoesqueletos de actina y tubulina, permitiendo de esta forma la correcta migración colectiva de las células de la CNC.Item Caracterización del receptor de acetilcolina nicotínico (nAChR) en la sinapsis neuromuscular de la especie Branchiostoma lanceolatum(Universidad de Concepción., 2023) Martínez Campos, María Esperanza; Henríquez Hohmann, Juan Pablo, profesor guíaLa unión neuromuscular (UNM) es la sinapsis periférica entre neuronas motoras y fibras musculares que controla el movimiento coordinado de una gran variedad de organismos. El estudio de la UNM se ha realizado en distintos modelos animales. En dicho contexto, una alternativa concreta para adquirir conocimiento sobre los requerimientos celulares y moleculares básicos de las sinapsis es conocer los procesos evolutivos que han dado lugar a los primeros contactos neuromusculares. Los cordados se dividen en el subfilo de los urocordados, cefalocordados y vertebrados. Los cefalocordados o anfioxos (en el caso de esta tesis, la especie Branchiostoma lanceolatum) son particularmente interesantes, pues poseen una anatomía que comparte estructuras similares con los vertebrados. Entre ellas destacan la presencia de un tubo neural, una notocorda (presente en etapa embrionaria y adulta) y miotomas (músculos esqueléticos del tronco). Diversos estudios estructurales han determinado que el tubo neural establece contactos con la región dorsal de la notocorda mediante estructuras llamadas astas notocordales, las cuales emergen de placas musculares transversales que la notocorda posee en su interior. Además, se han observado procesos citoplasmáticos que emergen desde las láminas musculares de los miotomas y que establecen contacto con las regiones ventrolaterales del tubo neural. En cuanto a la identidad de dichos contactos sinápticos, se desconoce la naturaleza de los receptores que cumplen esta función en los anfioxos. Al respecto, diferentes experimentos de hibridación in situ y detección enzimática de acetilcolinesterasa han identificado componentes colinérgicos en la interacción del tubo neural con la notocorda y con los procesos citoplasmáticos de los miotomas, lo que sugiere la presencia de sinapsis colinérgicas en la UNM de los anfioxos. Aun cuando en la UNM de vertebrados la despolarización de las fibras musculares y la consecuente contracción muscular dependen del receptor de acetilcolina nicotínico (nAChR), en el anfioxo no se ha identificado la presencia ni identidad de los receptores presentes en estas sinapsis neuromusculares. En base a estos antecedentes, se propone como hipótesis que “En la especie Branchiostoma lanceolatum, se encuentran nAChR en las interacciones neuromusculares que establece el tubo neural tanto con proyecciones de los miotomas como con la región dorsal de la notocorda”. Nuestros estudios de histología y detección de sondas y anticuerpos específicos en cortes de anfioxos adultos muestran una distribución de nAChRs en regiones delineadas alrededor y dentro de la porción ventral del tubo neural. Sorprendentemente, estas regiones muestran una distribución segmentada en el eje antero-posterior del tubo neural. Nuestros estudios in silico arrojaron la presencia de genes ortólogos para las subunidades α1, α3, α5-11 y β2-4 del nAChR, lo que sugiere que la conformación neuromuscular del receptor es diferente a la de los vertebrados. Estos hallazgos en B. lanceolatum amplían nuestros conocimientos sobre los requisitos celulares y moleculares básicos de las sinapsis que dieron lugar a los primeros contactos neuromusculares mediante el análisis comparativo entre vertebrados e invertebrados.Item Rol de ARMC9 en el establecimiento y mantención del eje axial de la espina dorsal en el pez cebra(Universidad de Concepción, 2022) Muñoz Montecinos, Carlos Humberto; Fuentes Pardo, Ricardo; Aguilera Muñoz, FelipeLa columna vertebral (CV) constituye el eje central del esqueleto que define a los vertebrados. Diversas malformaciones afectan a la CV, siendo la escoliosis idiopática adolescente (EIA) una de las más comunes. Esta condición consiste en una curvatura lateral que se desarrolla en ausencia de anormalidades congénitas. A pesar de ser un importante problema de salud pública, la etiología de esta condición es desconocida, principalmente por su heterogeneidad genética y la falta de modelos animales adecuados para su estudio. Recientemente, estudios genéticos utilizando el sistema modelo conocido como pez cebra han vinculado el desarrollo de curvaturas tipo EIA a alteraciones en la esqueletogénesis, en la estructura y organización de cilios, en el flujo del líquido cefalorraquídeo, y en la respuesta inflamatoria. Sin embargo, la identidad de la mayoría de los genes que regulan el establecimiento y mantención del eje axial de la CV es aún desconocida. En este trabajo se realizó una caracterización fenotípica del mutante armc9 del pez cebra, el cual muestra una malformación tipo EIA y anomalías asociadas a ciliopatías. Nuestros hallazgos revelaron que el fenotipo curvado no se debe a deformaciones de las vértebras. Por otro lado, la organización de componentes asociados a la biología del líquido cefalorraquídeo, como del órgano subcomisural (OSC) y la fibra de Reissner, no se encontró alterada en los individuos mutantes. Adicionalmente, se evaluó la respuesta inflamatoria mediante el estudio in vivo del comportamiento de macrófagos en la región en que se origina la curvatura espinal, sin un claro reclutamiento de estas células en dicho lugar. Asimismo, se realizó una caracterización bioinformática de la proteína Armc9, la cual está constituida por dominios LisH y Armadillo (ARM)-type fold en la región N- y C-terminal, respectivamente. Una predicción de Armc9 mutante sugiere que este último estaría ausente en la proteína. Además, nuestro análisis in silico indica que Armc9 interaccionaría con Togaram1 (Tog1) en el pez cebra, a través del dominio ARM-type fold. Finalmente, se analizaron las relaciones evolutivas de los miembros de la familia ARMC, indicando que estos se pueden clasificar en 12 grupos filogenéticos. En resumen, los resultados de esta tesis muestran que el mutante armc9 representa el fenotipo de EIA, y sugieren que este sería causado por la pérdida de la porción C-terminal del dominio “ARM-type fold” de la proteína Armc9. Además, los análisis bioinformáticos y filogenéticos nos permitieron determinar los sitios y regiones funcionalmente importantes de la proteína Armc9 y las posibles funciones de los otros miembros de la familia ARMC.Item Análisis transcriptómico y comparativo de genes de síntesis de cutícula en aclimatación a estrés por bajas temperaturas en Eucalyptus SPP.(Universidad de Concepción., 2023) Conejera Albornoz, Daniel Alejandro; Fernández, MartaEucalyptus globulus y Eucalyptus nitens tienen un gran impacto en la industria forestal y maderera en Chile, principalmente por su calidad de fibra y alta tasa de crecimiento. Sin embargo, una de las principales limitaciones para E. globulus es la sensibilidad a condiciones a bajas temperaturas y sequía prolongada, en comparación a E. nitens que tiene capacidad de tolerar condiciones de bajas temperaturas. A raíz de esto, se han generado diversos enfoques para determinar la capacidad genética respecto a la tolerancia a bajas temperaturas entre estas dos especies y un híbrido (Eucalyptus globulus x Eucalyptus nitens), una de ellas a través de Espectroscopia infrarroja (FT-IR), donde se ha establecido diferencias en la composición química de la cutícula, evidenciando una similitud entre individuos tolerantes (E. nitens e híbrido) y sensibles (E. globulus) en respuesta a tratamientos de congelación. El presente trabajo tiene como objetivo evaluar los perfiles transcriptómicos de genes que participan en la biosíntesis de cutícula relacionados con tratamientos de aclimatación después de helada (ADH) y control (NA) en tres genotipos de Eucalyptus spp. Se evaluó la expresión diferencial de genes implicados en la síntesis y regulación de la síntesis de cuticula, lo que permitió establecer un total de 422 genes anotados con E. grandis como referencia, los que corresponden a 188 de A. thaliana. Los cuales corresponden a 54 factores de transcripción y 134 genes obtenidos por literatura y bases de datos de síntesis cuticular. Además se evaluó por qPCR 8 proteínas que participan en la red de regulación de la síntesis de cutícula que permitió establecer diferencias entre genotipos tolerantes y sensibles implicadas en estrés por bajas temperaturas en tejido foliar de Eucalyptus spp.