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Abatimiento de la toxicidad de compuestos arsenicales presentes en suelos agrícolas, a través de un sistema de tratamiento biológico aeróbico secuencial.
(Universidad de Concepción., 2018) Ravanal Pineda, Javiera Francisca; Campos Araneda, Víctor Leandro
Durante muchos años, compuestos orgánicos que contienen arsénico en su estructura (organoarsenicales) han sido utilizados como aditivos alimenticios en la industria avícola. Utilizar el estiércol de las aves como fertilizante en cultivos, es una práctica común que aumenta la concentración de arsénico en los suelos, ya que los organoarsenicales se liberan inalterados en las heces de los animales. En la agricultura, durante décadas se utilizaron pesticidas inorgánicos y orgánicos de arsénico en cultivos. El impacto generado en este período ha sido el aumento de la concentración de arsénico en los suelos. Actualmente aún se permite el uso de algunos pesticidas como el metanoarsenato monosódico y en países asiáticos aún se utilizan compuestos organoarsenicales en la industria avícola. En el suelo, los compuestos organoarsenicales sufren transformaciones mediadas por microorganismos produciendo arsénico inorgánico, principalmente arsenito (As(III)) y arseniato (As(V)), siendo el primero más tóxico, soluble y móvil. Debido a su naturaleza, estas especies de arsénico pueden lixiviar o movilizarse por escorrentía, llegando a fuentes hidrológicas de uso humano y generar problemas sanitarios, pues el arsénico es carcinogénico y se asocia a enfermedad cardiovascular, hiperqueratosis y déficit neurocognitivo. La transformación biológica de organoarsenicales mediada por microorganismos, es una alternativa para el abatimiento de estos compuestos desde el suelo y/o el agua. Sin embargo, se genera arsenito y arseniato como productos de estas transformaciones por lo que es necesario desarrollar alternativas que logren abatir tanto los compuestos organoarsenicales, como el arsénico inorgánico generado. La precipitación de carbonato de calcio mediada por microorganismos (MICP), específicamente por bacterias ureolíticas, es un proceso mediante el cual bacterias metabolizan la urea generando amonio y bicarbonato, provocando un aumento del pH en el medio extracelular. Si existen iones calcio en el medio, se desencadena la precipitación de carbonato de calcio o Calcita, que es un mineral con la capacidad de absorber y/o co-precipitar arsénico inorgánico, principalmente arseniato.El objetivo de esta investigación fue implementar un sistema de tratamiento biológico aeróbico secuencial para el abatimiento de la toxicidad de compuestos arsenicales. Para ello, se caracterizó la reducción de compuestos organoarsenicales a arsénico inorgánico, por un consorcio bacteriano utilizando los parámetros cinéticos obtenidos mediante curvas de crecimiento, y curvas de reducción de mediante la detección de arsénico inorgánico. Luego, se caracterizó la producción de calcita y la oxidación/co-precipitación de arsénico inorgánico por Pseudomonas arsenicoxydans en un medio de cultivo modificado para la MICP utilizando los parámetros cinéticos obtenidos mediante curvas de crecimiento en estado planctónico y sésil. Finalmente, se implementó un sistema de tratamiento biológico aeróbico secuencial a escala de laboratorio, para estudiar el abatimiento de la toxicidad de arsénico de un afluente artificial suplementado con arsénico orgánico. Este sistema de tratamiento se dividió en 2 etapas, la primera fue un sistema discontinuo dónde se cultivó el consorcio bacteriano aeróbico con el fin de reducir los compuestos organoarsenicales roxarsona, nitarsona y metanoarsenato monosódico, hasta arsénico inorgánico. En la segunda etapa, el efluente del primer sistema fue alimentado en un sistema semi-continuo en el que se cultivó P. arsenicoxydans en un medio modificado para la MICP, con el fin de abatir el arsénico presente en el efluente mediante la simultánea oxidación de arsenito y co-precipitación de arsénico en la calcita producida a través de MIPC. La toxicidad del efluente final fue evaluada a través de un ensayo de viabilidad con células HUVEC. Los resultados demuestran que a las 144 h de operación de la primera etapa del sistema de tratamiento se alcanzó un 96,70% de transformación de compuestos organoarsenicales a arsénico inorgánico con una velocidad máxima de aparición de arsénico inorgánico de 0,033 ± 0,001 mg·l-1 ·h -1 . El efluente de este reactor fue diluido al 12% v/v y usado para alimentar el biorreactor de la segunda etapa. A partir de las 72 h de operación de esta segunda etapa, la remoción de arsénico del medio líquido fue de 100% con una velocidad de remoción de 0,033 ± 8,750e-007 mg·l-1 ·h -1 . El 99,3 ± 0,51% de las células HUVEC fue viable al ser expuestas al efluente final del sistema de tratamiento. Se puede concluir que el sistema de tratamiento biológico es capaz de abatir la toxicidad de compuestos arsenicales orgánicos e inorgánicos presentes en los afluentes ensayados, utilizando el sistema de tratamiento aeróbico secuencial con biotecnología de oxidación de arsenito y coprecipitación de calcita-arsénico.
Actividad anti-Helicobacter pylori de Gunnera tinctoria (nalca).
(Universidad de Concepción., 2015) Hebel Gerber, Sonja; Pastene Navarrete, Edgar
Helicobacter pylori (H. pylori) es una bacteria Gram negativa bacilar y espiralada, ureasa y catalasa positiva. Es un microorganismo patógeno con un 50% en promedio de prevalencia mundial, siendo mayor en los países que están subdesarrollados y en vías de desarrollo y afectando mayoritariamente a población con nivel socioeconómico bajo y que viven en condiciones de hacinamiento. En Chile la prevalencia es de un 73%. H. pylori infecta al epitelio gástrico y su presencia está relacionada con patologías gástricas como gastritis, linfoma de MALT, úlcera péptica y cáncer gástrico, siendo la bacteria considerada como un carcinógeno definitivo de cáncer gástrico (tipo I) por la Organización Mundial de la Salud. El patógeno logra infectar y permanecer en el epitelio gástrico gracias a sus factores de virulencia, los cuales incluyen la enzima ureasa, la cual neutraliza el pH ácido del estómago y su flagelo, el cual le permite movilizarse hasta su sitio de infección. Hasta el momento no hay vacunas exitosas disponibles contra la bacteria y la terapia farmacológica tiene una tasa de fracaso del 20%, lo que ha generado resistencia antibiótica. Esta terapia es costosa y larga, durando en promedio entre 10 y 14 días y utilizándose entre 3 y 4 medicamentos al mismo tiempo, lo que muchas veces provoca el abandono de la terapia por los efectos adversos que genera. Hay evidencia de que productos naturales logran afectar a la bacteria. Uno de ellos es Gunnera tinctoria (nalca), la cual se observó en los Laboratorios de Patogenicidad Bacteriana y Farmacognosia que tenían acción contra H. pylori, lo que motivó la realización de esta investigación, la cual tuvo como objetivos obtener un extracto total desde pecíolos de nalca y fraccionarlo en forma bio-dirigida en base a un screening de su actividad contra H. pylori, identificar las principales moléculas bioactivas presentes en el extracto total y fracciones de la planta, determinar la actividad del extracto total y de las fracciones de G. tinctoria sobre el crecimiento, ureasa,movilidad y morfología de la bacteria, determinar si había una relación entre las moléculas identificadas en el extracto total y las fracciones de G. tinctoria y su efecto anti-H. pylori y establecer una relación entre la magnitud y el mecanismo mediante el cual extractos de nalca de elaboración propia afectaban de forma in vitro a H. pylori. Para llevar a cabo esta tesis se trabajó con peciolos de nalca, desde donde se obtuvo un extracto total, el cual fue fraccionado. Se determinó si el extracto total y las fracciones de G. tinctoria tenían acción sobre las cepas ATCC45504 y J99 de H. pylori por medio de ensayos como ensayo de difusión en agar, Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) en microdilución en caldo, Concentración Mínima Bactericida (CMB), curva de muerte, ensayo de la uresa, ensayo de movilidad y microscopía electrónica de transmisión, todos ellos dirigidos a determinar si la planta estaba afectando el crecimiento in vitro, movilidad, ureasa o ultraestructura bacteriana. Para determinar que moléculas podrían estar generando los efectos antibacterianos es que se utilizó cromatografía líquida de alta resolución acoplada a espectrometría de masas. Se determinó que el extracto total y las fracciones de nalca tienen una acción bactericida con la menor CMI y CMB de 32 μg/mL. Además en la curva de muerte la fracción 1 actúa más rápido que el antibiótico control. En el ensayo de ureasa se encontraron IC50 bajas, siendo la menor de 13,5 μg/mL. En cuanto a la movilidad solo una de las cepas bacterianas se vio afectada por dos de las fracciones. Resultados mucho más favorables se obtuvieron con microscopía electrónica, donde se determinó que el extracto total y fracciones de nalca estarían interactuando con la membrana del patógeno, desestabilizándola y lisando y matando finalmente a la bacteria. Los resultados encontrados en esta tesis indican que G. tinctoria ejerce un efecto anti-H. pylori y con estudios posteriores sobre líneas celulares, modelo animal y estudios clínicos, se podría pensar a largo plazo en comercializar los extractos de nalca.
Actividad antibacteriana del vino tinto (cepas pais y cabernet) y de extractos de escobajos y de frutos sobre Helicobacter pylori. efecto antibacteriano del trans-resveratrol.
(Universidad de Concepción., 2002) Daroch Mendoza, Fabiola Macarena; García Cancino, Apolinaria del Rosario
En los últimos años se han estudiado numerosos compuestos del vino tinto y de sus derivados, cómo es el caso de las uvas; involucrados en la quimio prevención de algunos tipos de cáncer. Esto es, debido a las innumerables propiedades antioxidantes que se le han otorgado a algunos compuestos fenólicos encontrados en el vino, especialmente a los denominados vinos “negros” o tintos. Si bien es cierto se conoce bastante sobre la acción antioxidante de los compuestos fenólicos del vino, y escasamente se han explorado otras propiedades beneficiosas para la salud, como es el caso de la actividad antibacteriana de estos compuestos. Este es el caso del resveratrol, un compuesto fenólico sintetizado por la vid, el cual es considerado un metabolito secundario cuya síntesis se ve incrementada cuando la planta se encuentra en condiciones de estrés; es por esa razón que se le considera una fitoalexina. Por lo tanto, considerando que Chile es un País con alto índice de enfermedades gastroduodenales (gastritis tipo B, úlceras y cáncer gástrico), provocadas en un alto porcentaje por Helicobacter pylori, y además por ser un País productor de vinos, es importante encontrar en esta fuente, una terapia alternativa contra la erradicación de H. pylori que disminuya los efectos secundarios de la terapia, evitando de esta manera el aumento de la resistencia frente a los antimicrobianos actualmente en uso. Para este propósito, se analizó la actividad antibacteriana de extractos activos de vinos tintos varietal Pais (nativo) y varietal Cabernet (introducido), y de sus uvas separadas en escobajo, hollejo y pulpa más semilla. Posteriormente se procedió a la identificación y cuantificación de trans-resveratrol mediante Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), con el fin de determinar si la concentración de este compuesto presente en los extractos, es determinante en la actividad anti H. pylori y, además, determinar en que varietal se encuentra la mayor concentración de trans-resveratrol. Por otra parte, se analizó el efecto de trans-resveratrol sobre H. pylori, mediante el estudio morfológico de la célula. Estos estudios fueron realizados por Microscopía de epifluorescencia y por Microscopía de barrido, a distintas concentraciones de trans resveratrol (2, 4, 10, 25 y 50g/ml) y a distintos tiempos (0, 24, 48, 72h).Los resultados presentados por la actividad anti H. pylori de los extractos activos de uvas y vinos varietal Pais y varietal Cabernet fueron diversos, encontrándose una mayor actividad antibacteriana en el varietal Pais que en el varietal Cabernet. Con relación a los resultados presentados por los extractos de uvas (escobajo, hollejo y pulpa más semilla); el escobajo y la pulpa más semilla de ambos varietales presentaron la mayor actividad anti H. pylori, viéndose incrementada esta actividad para el varietal Pais. Esta actividad también se vio incrementada en los extractos de vinos pertenecientes al varietal Pais, cuyos halos de inhibición fueron superiores a los encontrados por el varietal Cabernet (30/20mm de diámetro respectivamente). Los resultados de la actividad antibacteriana, concuerdan con el análisis de cuantificación de trans-resveratrol mediante HPLC, en la cual las concentraciones más altas del compuesto se presentaron en los extractos de vino del varietal Pais, con una concentración de 1,8mg/L para el varietal Pais y de 0,68mg/L para el varietal Cabernet. Por otra parte, el efecto del trans-resveratrol sobre las células de H. pylori, se relaciona estrechamente con la morfología de la bacteria, observándose cambios morfológicos a medida que se incrementan las concentraciones subinhibitorias, cercanas a la CMI. Los cultivos presentaron formas cocoides a concentraciones inferiores a 10g/ml y formas filamentosas a concentraciones superiores a ésta.Los ensayos realizados con el extracto activo del vino Pais, presentaron los mismos resultados mostrados por H. pylori cuando son incubados a 50g/ml del compuesto, observándose claramente la formación de filamentos, sugiriendo que el trans-resveratrol es uno de los principales compuestos activos del vino involucrado en la actividad anti H. pylori. Respecto a los resultados relacionados con la morfología de la bacteria, se observa que H. pylori incubado en un medio libre de transresveratrol, pero previamente expuesto a éste, presenta una reversibilidad morfológica a través del tiempo, volviendo a su morfología inicial. Por lo anterior, los extractos de vinos y uvas presentaron actividad anti H. pylori, la que estaría estrechamente relacionada con el trans-resveratrol y las concentraciones de éste en los extractos activos, aunque se supone que además existen otros compuestos en el vino que estarían incrementando la actividad anti H. pylori. En lo que respecta al efecto del trans-resveratrol como agente antibacteriano, queda de manifiesto que el compuesto en estudio afecta en forma reversible la morfología de la bacteria, sugiriendo que el transresveratrol pudiera estar afectando algún componente celular involucrado en la morfología de H. pylori
Actividad antibacteriana y biocompatibilidad de nanopartículas funcionalizadas como desinfección en neoterapias endodónticas.
(Universidad de Concepción, 2023) Jerez Olate, Christian Andrés; Sánchez Sanhueza, Gabriela
Introducción: En endodoncia, existen múltiples infecciones de origen bacteriano, que provocan una enfermedad común conocida como periodontitis apical. Por consiguiente, el objetivo principal de los tratamientos en endodoncia es tratar o prevenir el desarrollo de lesiones perirradiculares asociadas a esta enfermedad, mediante la erradicación del componente bacteriano durante la preparación quimio-mecánica. Sin embargo, la tasa de éxito de dientes con estas lesiones alcanza un 85%, disminuyendo a un 68% en los retratamientos. En consecuencia, existe una búsqueda constante de nuevos materiales que puedan contribuir a mejorar la tasa de éxito de la terapia endodóntica. Desde esta perspectiva, basándonos en las beneficiosas propiedades y características antibacterianas y de biocompatibilidad de las nanopartículas metálicas, estas pueden ser una alternativa o coadyuvante a los protocolos actuales como nuevas terapias de desinfección. Objetivo: El objetivo de este estudio fue evaluar la actividad antibacteriana y la biocompatibilidad de nanogeles nanoestructurados de cobre y plata combinados con una matriz polimérica de PVA/PVP. Metodología: En primer lugar, se realizó un screening de la actividad antibacteriana de los nanogeles mediante la determinación de la cinética de muerte por el test de contacto directo frente a Enterococcus faecalis, seleccionando los nanogeles con mayor actividad antibacteriana. En segundo lugar, utilizando un modelo de diente ex vivo con una biopelícula bacteriana multiespecie madura de 21 días, se cuantificó la viabilidad bacteriana postratamiento de los nanogeles por medio de microscopia confocal; además, mediante, el uso de células humanas del ligamento periodontal y de la plataforma de célula viva en tiempo real IncuCyte S3 fue posible evaluar la biocompatibilidad de los nanogeles. Resultados y Conclusión: Este es el primer reporte en el cual se evalúan nanopartículas de cobre y plata estabilizadas con matrices poliméricas de PVA/PVP (nanogeles) en biopelículas bacterianas endodónticas multiespecies y la citotoxicidad empleando la plataforma de célula viva en tiempo real IncuCyte S3. Dentro de los resultados obtenidos en este estudio con relación a la actividad antibacteriana y la citotoxicidad de los nanogeles testeados, evidenciaron que el tiempo de utilización óptimo de estos nanomateriales frente a una biopelícula bacteriana endodóntica multiespecie, es a las 168 h. Asimismo, a medida aumentan los tiempos de acción frente a las células humanas del ligamento periodontal disminuye la citotoxicidad de los nanogeles, proporcionando un material alternativo al hidróxido de calcio durante la medicación en los tratamientos de conductos.
Actividad antitumoral de pigmentos y metabolitos secundarios sintetizados por bacterias antárticas y patagónicas.
(Universidad de Concepción., 2017) Tapia Herrera, Cristian Ramón; Martínez Poblete, Miguel
Los ambientes antárticos y patagónicos chilenos son considerados extremos por sus bajas temperaturas, altos niveles de radiación ultravioleta y características oligotróficas. En la última década la atención en los ambientes extremos se ha incrementado debido a que microorganismos extremófilos son capaces de producir productos como enzimas, metabolitos secundarios y pigmentos con una potencial aplicación industrial y farmacológica. En este contexto, seis bacterias pigmentadas fueron aisladas desde ambientes patagónicos y antárticos, sus pigmentos fueron extraídos desde de la biomasa bacteriana, purificados y analizados por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). La actividad citotóxica de estos fue evaluada mediante ensayos MTT [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio] usando tres líneas celulares de cáncer (Neuro-2a, Saos-2 y MCF-7). Los pigmentos sintetizados por bacterias antárticas y patagónicas corresponden principalmente a Carotenoides y muestran actividad citotóxica a una concentración de 40 μg/ml.
Actividad in vitro de la combinación de colistín con diferentes antibióticos contra cepas de Acinetobacter baumannii resistentes a carbapenémicos y Klebsiella pneumoniae productoras de β-lactamasas de espectro extendido.
(Universidad de Concepción., 2013) Santos Herrera, René Guillermo; Domínguez Yévenes, Maríana
El aumento de cepas bacterianas patógenas resistentes a la mayoría de los antibióticos, incluyendo carbapenémicos, ha generado la necesidad de buscar alternativas de nuevos protocolos de tratamientos. Las bacterias Gram negativas multiresistentes representan un verdadero reto clínico, sobre todo en infecciones de origen intrahospitalario, debido a la alta mortalidad asociada. Entre estos microorganismos multiresistentes se encuentra Acinetobacter baumannii y Klebsiella pneumoniae, de difícil tratamiento por el grado de resistencia mostrado ante los diferentes protocolos terapéuticos establecidos, determinado por diversos mecanismos de resistencia. Debido al surgimiento de resistencia a carbapenémicos en estas bacterias quedan muy pocas opciones terapéuticas, por lo que se ha recurrido al uso de antibióticos antiguos, que mostraron eficacia contra estos patógenos, pero con limitaciones de actividad y toxicidad, descontinuados por la falta de evidencia clínica respecto a sus efectos secundarios y sólo recuperados nuevamente en la actualidad. Uno de estos antibióticos es colistín, un fármaco que surgió en los años cincuenta para ser utilizado contra bacterias Gram negativas y, actualmente, de uso restringido para infecciones intrahospitalarias multiresistentes. En la actualidad, se carece de estudios modernos sobre farmacocinética y farmacodinamia de este agente y la experiencia actual se basa, fundamentalmente, en experiencias clínicas con resultados poco concluyentes respecto a modo de uso, efectividad y toxicidad, lo que genera controversia respecto a la utilidad de la combinación con otros antibióticos para lograr mayor efectividad. Se plantea el objetivo de evaluar la actividad antibacteriana in vitro de colistín, para determinar si se produce o no efecto sinérgico entre las diferentes combinaciones ensayadas. Para esto se estudiaron 44 cepas de A. baumannii resistentes a carbapenémicos y 48 cepas de K. pneumoniae productoras de β-lactamasas de espectro extendido (BLEE), resistentes a diferentes antibióticos y no relacionadas genéticamente, provenientes de hospitales de Chile. Se determinó la concentración mínima inhibitoria (CMI) de colistín, ampicilina/sulbactam, vancomicina, tigeciclina, rifampicina e imipenem, por el método de microdilución; posteriormente, mediante el método de tablero de ajedrez, se estudió el efecto producido al asociar colistín con cada uno de estos antimicrobianos. Además, en cepas seleccionadas de acuerdo a su multiresistencia y sobre las que diferentes combinaciones actuaron en forma sinérgica, se estudió la cinética de muerte en el tiempo, empleando los correspondientes antibióticos combinados con colistín. Se encontraron cepas bacterianas con diferente grado de resistencia a los distintos antibióticos ensayados. Detectándose, mayormente, efecto sinérgico al asociar colistín con los distintos antibacterianos y, además, una muerte bacteriana en menor tiempo al utilizar la asociación. Sin embargo, tanto para K. pneumoniae como para A. baumannii las diferentes combinaciones presentaron recrecimiento a las 24 horas, salvo la combinación de tigeciclina con colistín en A. baumannii, que continuó sin crecimiento después de 24 horas, pero en este caso la cepa era susceptible a tigeciclina. Se concluye que la sinergia es el efecto más frecuente que se produce al combinar colistín con otros antibacterianos, especialmente en A. baumannii, y que lleva a muerte bacteriana antes de las 12 h con un posterior recrecimiento.
Actividad profiláctica in vitro anti-Helicobacter pylori de propóleos de la región del Bio-Bío.
(Universidad de Concepción., 2015) Freire Contreras, José Andrés; González Correa, Carlos
En la actualidad, se estima que más del 60% de la población mundial está infectada por Helicobacter pylori (H. pylori), convirtiéndose en una infección bacteriana crónica de los humanos. Actualmente el tratamiento de erradicación de H. pylori presenta fallas terapéuticas que oscilan entre 20- 60% de los casos y no se dispone de medidas profilácticas efectivas para prevenir la infección. Por lo tanto, se ha sugerido el empleo de compuestos de origen natural como profilácticos; entre ellos, el propóleos. El objetivo de esta tesis fue determinar la actividad in vitro anti-H. pylori de propóleos colectados de distintas áreas geomorfológicas de la región del Bio Bío, con el propósito de establecer si existen variaciones en su actividad. Se analizaron 10 muestras de propóleos, las que se disolvieron en n-hexano, terbutilmetileter, acetonitrilo y agua, seguida de análisis por cromatografía de partición centrífuga (CPC). La actividad anti-H. pylori se determinó por difusión en agar y por dilución seriada en agar usando como cepas indicadoras H. pylori ATCC 43504, J99 y G27. Además, para un extracto seleccionado se determinó su capacidad de inhibir la formación de biopelículas y la adherencia a células AGS. Los resultados mostraron que todos los extractos inhiben in vitro las cepas de H. pylori, no obstante, se observaron variaciones en la intensidad según la cepa empleada. Los propóleos obtenidos de las áreas geomorfológicas Cordillera de la Costa y Cordillera de los Andes demostraron cualitativamente actividad antibacteriana aumentada. Además, el extracto de propóleos seleccionado disminuyó la formación de biopelículas de la cepa de H. pyloriJ99 y disminuyó la adherencia de la cepa de H. pylori ATCC 43504 a células AGS. Todos los compuestos parcialmente purificados a partir del extracto total mostraron actividad anti-H. pylori variable. Los resultados presentados sugieren que la flora presente y el clima en determinadas zonas podrían influir en la composición y actividad antibacteriana de los propóleos. Además, sugieren que todos los compuestos presentes pueden ser utilizados como sustancias anti-H. pylori.
La administración del simbiótico Lactobacillus bulgaricus 6C3, inulina y fructooligosacárido reduce la progresión de la enfermedad renal crónica en el modelo murino.
(Universidad de Concepción., 2020) Jerez Morales, Alonso Leandro; García Cancino, Apolinaria del Rosario
La enfermedad renal crónica (ERC) corresponde a una patología de diversos orígenes que afecta la función renal. Una de las estrategias para evitar la progresión de la ERC es la disminución de las moléculas de retención urémica (MRUs) mediante probióticos, prebióticos y simbióticos. El objetivo de este trabajo fue evaluar si la administración de un simbióticos es capaz de disminuir la progresión de la ERC. Para esto, se evaluó la capacidad de disminuir IS y pCr in vitro por las cepas L. bulgaricus 6c3, L. acidophilus VIIIc2 y el cocultivo de ambas. Luego, se desarrolló un simbiótico el cual fue administrado en ratas Sprague-Dawley nefrectomizadas por 16 semana (Lac), en paralelo se trabajó con un grupo nefrectomizado sin tratamiento (Nef) y un grupo control (C). Se midieron las concentraciones de creatinina, IS y pCr en sangre mediante HPLCDAD al inicio y final del experimento, además, se extrajo el riñón para análisis histológicos. La cepa L. bulgaricus 6c3 fue la que obtuvo mayor capacidad de disminuir IS in vitro. La administración del simbiótico no afecto la concentración de creatinina sérica, por el contrario, el grupo Lac disminuyó un 0.8% los valores de IS séricos, en contraste, el grupo Nef aumento significativamente las concentraciones de IS (38.8%). Las concentraciones de pCr no lograron medirse. El análisis histológico del riñón demostró que el grupo Lac presentó un aumento menor del área fibrótica (12%) en comparación con el grupo Nef (25%). Los resultados obtenidos demuestran que el simbiótico es capaz de disminuir IS en modelo murino y disminuir la progresión de la ERC.
Aislamiento de un consorcio bacteriano anaeróbico, capaz de transformar roxarsona y producir biogás , utilizando estiércol de pollo broiler.
(Universidad de Concepción., 2015) Riquelme Espinoza, Rodrigo Andrés; Campos Araneda, Víctor Leandro
En la industria avícola es común la utilización de compuestos organoarsenicales para la producción de pollos Broiler. El Ácido 3-Nitro 4hidroxilfenilarsénico (roxarsona), es suministrado como suplemento alimenticio, fomentando el crecimiento, pigmentación de la carne y previniendo la aparición de parasitos intestinales (coccidiosis). La roxarsona al ser excretada provoca un aumento de arsénico en el ambiente, mediante la biotransformación de arsénico orgánico a especies de arsénico inorgánico (Arsenito y Arseniato). El objetivo del trabajo fue aislar e identificar un consorcio bacteriano proveniente de estiércol de pollo Broiler, capaz de biotransformar roxarsona bajo condiciones anaeróbicas y además producir biogás, como producto de la actividad metabólica. Las muestras fueron obtenidas de una industria avícola de la región del Bío-Bío y enriquecidas en un medio químicamente definido bajo condiciones anaeróbicas, con agitación constante. Se determinó la capacidad de biotransformar roxarsona bajo condiciones anaeróbicas mediante espectrofotometría y cromatografía de alta resolución. El consorcio fue caracterizado molecularmente mediante la amplificación del gen ADNr 16S, posterior análisis por DGGE, re amplificando los productos obtenidos y se alinearon con la base de datos de genbank. La determinación de biogás se analizó por cromatografía de gases. Los resultados obtenidos demostraron que el consorcio fue capaz de degradar el 95.6% de roxarsona presente en el medio, luego de 48 horas de incubación, bajo condiciones anaeróbicas. El análisis molecular demostró que el consorcio presenta heterogeneicidad y que la roxarsona provoca un cambio en la estructura de la comunidad bacteriana, evidenciando 13 grupos bacterianos diferentes, siendo el más predominante Firmicutes, las cuales son mayoritariamente anaeróbicas y fermentadores. Se determinó que la actividad metabólica del consorcio produce biogás lo que generaría una fuente de energía alternativa.
Aislamiento y caracterización del gen arsenito oxidasa de Pseudomonas sp.FN-41.
(Universidad de Concepción., 2009) Badilla Pino, Consuelo Pía; Mondaca Jara, María Angélica
El arsénico es un metaloide altamente tóxico especialmente en estado inorgánico como arsenito [As (III)] y arseniato [As (V)]. Se encuentra ampliamente distribuido en numerosos ambientes, en algunos de ellos puede alcanzar concentraciones peligrosas para los humanos, produciendo diversas afecciones a la salud como problemas vasculares en la piel hasta el desarrollo de cáncer. Numerosos estudios muestran que existen bacterias, que cumplen un rol fundamental en el ciclo biogeoquímico del metaloide, cambiando los estados de oxidación, como por ejemplo, transformándolo desde un estado tóxico de arsenito a un estado menos tóxico de arseniato. Dichos microorganismos, presentan diversos mecanismos de resistencia para contrarrestar la toxicidad del metaloide. Los principales mecanismos de resistencia bacteriana se encuentran asociados a determinantes genéticos, los que otorgan la capacidad de realizar dichas transformaciones del metaloide. La facultad para oxidar el arsénico se debe fundamentalmente a la presencia de una enzima, arsenito-oxidasa, la cual oxida As (III) a As (V). Se ha informado que en bacterias heterotróficas la enzima se ubica a nivel del periplasma bacteriano, y en bacterias quimiolitoautotróficas se encuentra en la membrana citoplasmática asociada a la cadena transportadora de electrones. Ésta enzima, es un heterodímero que consta de una subunidad catalítica mayor, que contiene un centro de molibdeno y un centro HiPIP [3Fe-4S] y una subunidad menor, formada por un centro Rieske [2Fe-2S]. Los genes que codifican para la subunidad menor y mayor de la enzima son los asoBA, aroBA y aoxAB, respectivamente. Estos genes se han detectado en una amplia gama de bacterias y Archae, no obstante, no se habian descrito genes involucrados en la oxidación de arsenito en el género Pseudomonas, pero recientemente dos Pseudomonas se informo la presencia del gen. El objetivo del presente trabajo fue caracterizar el gen de la enzima arsenitooxidasa de Pseudomonas FN-41, bacteria arsenito-oxidante, aislada de sedimentos del río Camarones, XV región Chile. Se estudió la ubicación celular de la enzima arsenito oxidasa, mediante la 2 formación de esferoplastos, ultracentrifugación y ruptura celular por prensa French. Se investigó la presencia del gen arsenito oxidasa de la cepa en estudio mediante PCR utilizando partidores degenerados (69F y 1374R). El producto de PCR obtenido fue clonado y secuenciado. Posteriormente se realizaron análisis comparativos con secuencias descritas para los genes asoA, aroA y aoxB mediante Blast y ClustalW, determinando la similitud de aminoácidos, análisis filogenéticos y análisis evolutivos. Los resultados muestran que la arsenito oxidasa de Pseudomonas FN-41 tiene ubicación periplasmática. Un 74.8 % de actividad enzimática respecto a la actividad total, fue encontrada en la fracción periplasmática (0.158 μmoles de DCIP/mgproteína/min). Mediante ultra-centrifugación, la región soluble correspondiente al contenido periplásmico, presentó una mayor actividad enzimática, alcanzando un 87.1% (0.203 μmoles de DCIP/mg proteína/min), respecto a la actividad total. Mediante PCR, se obtuvo un producto de 1200 pb aproximadamente, los que corresponden a la amplificación de la primera mitad de la subunidad mayor de la arsenito oxidasa. El alineamiento de las secuencia aminoacidica de la cepa en estudio con otras secuencias de arsenito oxidasas, permitió determinar los aminoácidos implicados en el sitio de unión del sustrato de la enzima, los cuales corresponden a los residuos H195 y E203. Se identificaron los residuos S98 y A199, que pertenecen a la subunidad catalítica de la enzima. También se identificó el motivo HNRPAYNSE que es altamente conservado en bacterias arsenito oxidante. Los análisis de similitud aminoacídica de la secuencia en estudio respecto al gen aoxB de Cenibacterium arsenoxidans reveló ser un 45.1%, con el gen asoA de Alcaligenes feacalis un 49.6% y con el gen aroA de Rhizobium sp. NT-26 un 45.1%. Estos resultados permiten concluir que en Pseudomonas. sp. FN-41 se encuentra una arsenito oxidasa que se ubica en el espacio periplásmico. Presenta el gen que codifica para la arsenito oxidasa y probablemente es distinto a los ya descritos.
Ambiente genético del gen bla CTX-M2 en cepas de klebsiella pneumoniae subsp. pneumonieae aisladas en hospitales chilenos.
(Universidad de Concepción., 2007) Díaz Quezada, Patricia María; Bello Toledo, Helia Magaly
Las enzimas del grupo CTX-M forman una familia de - β de espectro extendido (BLEE) de rápido crecimiento, distribuidas en diversas áreas geográficas y en un amplio rango de bacterias clínicas, en particular, miembros de la familia Enterobacteriaceae como Klebsiella pneumoniae. Estas enzimas hidrolizan preferentemente cefotaxima, y su prevalencia en Chile es de 40,2%, en cepas de K pneumoniae subsp pneumoniae productoras de BLEE. Según lo indicado por diversos estudios, en la movilización de genes blaCTX-M estarían involucrados elementos genéticos, como por ejemplo la secuencia ISCR1 e integrones de clase 1. Estos últimos elementos han sido los más estudiados y caracterizados, principalmente por su alta diseminación y, además, porque han sido encontrados en cepas aisladas en hospitales. La organización general de los integrones clase 1 consiste de un extremo 5’ conservado (5’CS), donde se encuentra el gen intI1, el que codifica para una proteína denominada integrasa y que corresponde a una recombinasa sitio específica. Además, posee un extremo 3’ conservado (3’CS) con los genes qacEΔ1, sul1 y orf5 que codifican resistencia a compuestos de amonio cuaternario, bromuro de etidio, sulfonamidas y a una proteína de función desconocida, respectivamente. Entre los extremos 5’CS y 3’CS se encuentra una zona variable con presencia o ausencia de cassettes genéticos de resistencia. Recientemente se informó la presencia de integrones clase 1 complejos(ejemplos, In35 e InS21, descritos en Argentina), los cuales presentan una duplicación parcial o completa del extremo 3’CS. En este caso los cassettes genéticos se ubican entre el 5’-CS y la primera copia del 3’CS, tal como en un integrón clase 1 tradicional. Entre el segundo 3’CS se halla una región conservada de 2.100 pb, que incluye la secuencia ISCR1 y una segunda región variable adyacente, donde se han encontrado insertos genes blaCTX-M. La secuencia ISCR1 contiene un únic marco de lectura, orf513, que codifica para una recombinasa putativa.vi Hasta el momento no existen publicaciones en Chile que asocien la presencia del gen blaCTX-M-2 a este tipo de estructuras genéticas, por lo cual, el Objetivo General de esta Tesis fue caracterizar el ambiente genético del gen blaCTX-M-2 presente en cepas de K. pneumoniae subsp. pneumoniae aisladas en hospitales chilenos. En este estudio se incluyeron 6 cepas de K. pneumoniae subsp. pneumoniae (K143, K283, K288, K291, K292, y K296) multirresistentes productoras de la BLEE CTX-M2, y también la cepa transconjugante K283tr. Se caracterizó, mediante PCR, la zona variable del integrón clase 1 presente en estas cepas, como también la duplicación del extremo 3’ CS del integrón clase 1 complejo, utilizando combinaciones de partidores específicos descritos en la literatura internacional, y se comparó los resultados con los obtenidos en la cepa control UC244 (In35+). De acuerdo a los resultados de los experimentos anteriores, y de un estudio de clonalidad de las cepas, se secuenció losproductos de amplificación del ambiente genético del gen blaCTX-M2 de la cepa K283. Para el ensamblaje y análisis comparativo de las secuencias nucleotídicas se utilizaron diversos programas computacionales.Los resultados revelaron que, en todas las cepas estudiadas, incluyendo la cepa K283tr , el gen blaCTX-M2 se encuentra inserto en un integrón clase 1 complejo, asociado a la presencia de la secuencia ISCR1. La arquitectura de este integrón es similar a los integrones clase 1 complejos detectados en Argentina y Uruguay. Se determinó que la zona variable del integrón clase 1 contiene el siguiente ordenamiento de cassettes genéticos: aac(6’)-Ib, blaOXA2 y orfD.Corriente abajo del primer extremo 3’CS, se encontró una zona de 2.985 pb que posee un 95% de identidad con los primeros integrones clase 1 complejos descritos, In6 e In7, e incluye la secuencia ISCR1. Al hacer el alineamiento múltiple de la secuencia codificante de orf513, se determinó que comparte 100% de identidad con aquella descritas para los integrones In35 e InK13, descritos en Argentina y Uruguay, respectivamente. Corriente abajo de esta secuencia, se vii encontró ubicado el gen blaCTX-M2, que comparte un 98% de identidad con blaKLUA-1 de Kluyvera ascorbata. La secuencia corriente abajo del gen blaCTX-M2 se puede dividir en dos partes: una región homóloga a blakluA-1, la secuencia ORF3 (88% homóloga con la de K. ascorbata) y el gen posee un qacEΔ1, el cual es el primer componente de la duplicación del extremo 3’ del integrón clase 1 complejo.Se concluye que el gen blaCTX-M2 presente en cepas hospitalarias de K. pneumoniae subsp. pneumoniae se encuentra en un integrón clase 1 complejo, denominado InK283, adyacente a la secuencia ISCR1, y de igual arquitectura que aquellos integrones descritos en Argentina y Uruguay. Este integrón clase 1 complejo se encuentra ubicado en un plásmido conjugativo, que podría estar movilizándose entre las cepas chilenas
Análisis de la formación de biopelículas de acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 53993 sobre soportes inorgánicos y orgánicos y evaluación de su potencial biotecnológico en el tratamiento de aguas contaminadas con arsénico inorgánico.
(Universidad de Concepción, 2024) Castro Piña, Matías Sebastián; Martínez Poblete, Miguel; Castro González, Matías
El arsénico (As) es un metaloide altamente tóxico para todas las formas de vida, el cual es liberado al ambiente por fuentes naturales y actividades antrópicas. El consumo de agua contaminada con As es un problema a nivel mundial, lo que representa un problema a la salud pública. Para remediar esta situación, existen tecnologías como la adsorción, método basado en la capacidad de retención de contaminantes en la superficie de adsorbentes. En la búsqueda de nuevos adsorbentes, los óxidos de hierro como Schwertmannita (Sch) y Jarosita (Jt), presentan buenas propiedades de adsorción de As, compuestos que pueden ser biomineralizados por bacterias acidófilas oxidantes de hierro como Acidithiobacillus ferrooxidans. La biomineralización de óxidos de hierro es un proceso mediado por factores como la formación de biopelículas y las interacciones del Fe(III) con diferentes estructuras de la matriz extracelular (ECM, del inglés extracelular matrix), por lo que es necesario caracterizar las biopelículas formadas por Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 53993, incluyendo componentes de su matriz extracelular, y evaluar su utilidad en el tratamiento de aguas contaminadas con As inorgánico mediante biomineralización de óxidos de hierro. Así, se evaluó la viabilidad de A. ferrooxidans ATCC 53993 a diferentes concentraciones de As inorgánico, mediante análisis espectrofotométricos midiendo la densidad óptica a 430 nm. Se analizó la formación de biopelículas sobre soportes inorgánicos y orgánicos mediante ensayos de adherencia evaluados por microscopia de epifluorescencia y con microscopia electrónica de barrido. La caracterización de las estructuras presentes en la ECM se realizó mediante análisis de distribución de tamaño, microscopia electrónica de transmisión y análisis proteómico. Además, se analizaron los óxidos de hierro biomineralizados por biopelículas de A. ferrooxidans ATCC 53993 sobre un soporte orgánico inerte, los cuales fueron caracterizados mediante microscopia electrónica de barrido asociado a espectroscopia de rayos X de energía dispersiva y difracción de rayos X, junto también con una evaluación de su capacidad de adsorción de As mediante Espectrometría de Masas con Plasma Acoplado Inductivamente. Los resultados indicaron que A. ferrooxidans ATCC 53993 fue capaz tolerar hasta 2 mM de As(III) y 32 mM de As(V). Además, de adherirse a sustratos inorgánicos (pirita y azufre elemental) y a un soporte orgánico inerte (bioball), formando biopelículas. En cuanto a la caracterización de su ECM, esta cepa es capaz de producir vesículas de membrana, las cuales presentan capacidad de adherencia a pirita y azufre elemental como también una capacidad oxidativa de hierro reducida con respecto a las células. Por último, las biopelículas de A. ferrooxidans ATCC 53993 son capaces de biomineralizar óxidos de hierro, principalmente Sch y Jt. Los cuales presentaron una capacidad para adsorber As(III) de 23.2 mg·g-1. Valores que sugieren la posibilidad de desarrollar un sistema de tratamiento de aguas contaminadas con As basado en la inmovilización de Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 53993 sobre bioballs y que permiten la biomineralización de óxidos de hierro y éstos pueden capturar el As inorgánico. Como proyecciones a este proyecto quedan estudiar el desarrollo de un sistema de tratamiento a mayor escala para evaluar los rendimientos de biomineralización de óxidos de hierro como de la adsorción de As. Por otra parte, surge la necesidad de esclarecer las funciones de las MVs dentro del contexto de la formación de biopelículas de esta bacteria, junto con la interacción con minerales que puede influir en la biomineralización de óxidos de hierro.
Análisis de la localización subcelular de XtRic-8A y de su participación en la polarización celular en embriones de X. tropicalis.
(Universidad de Concepción., 2012) Arriagada Momberg, Cecilia Lorena; Torrejón Quezada, Marcela Eliana
Inicialmente Ric-8 fue identificada promoviendo la vía de liberación de vesículas sinápticas en C.elegans y participando durante la división asimétrica en la embriogénesis de Drosophila. Por otro lado, en nuestro laboratorio hemos observado que ensayos de pérdida de función de Ric-8A en X. tropicalis, generan un fenotipo con células que presentan un retardo en la división celular y defectos en la pigmentación en las primeras etapas del desarrollo embrionario, un fenotipo que previamente fue descrito en embriones que presentan problemas en polarización celular. Por esta razón nos hemos planteado como hipótesis para este trabajo de tesis, que “XtRic-8A participa en polarización celular, etapa previa a procesos como la división asimétrica y migración celular, eventos importantes durante el desarrollo embrionario de un organismo.” Por lo tanto, con el objetivo de entender el rol que podría estar cumpliendo Ric-8 durante la división y polarización celular, en este trabajo de tesis se analizó la localización subcelular de XtRic-8A durante el ciclo celular en células HeLa y en cortes de embriones tempranos en X. tropicalis. Nuestros resultados indican que XtRic-8A se localiza en la membrana citoplasmática, en la región perinuclear, y en el citosol durante la interfase, mientras que en metafase se localiza alrededor de la placa metafásica. Por otra parte, ensayos de pérdida de función, utilizando un morfolino contra XtRic- 8A, muestran un cambio en la distribución de proteínas cuya localización se encuentra polarizada durante etapas tempranas de la embriogénesis. Este resultado sugiere que XtRic-8A podría ser requerido durante eventos de polarización celular, paso importante durante procesos como la división celular asimétrica y migración celular. Finalmente, este fenotipo pudo ser rescatado al sobreexpresar la subunidad XtGαi, proteína que participa en la división asimétrica, sugiriéndonos que ambas proteínas podrían estar participando juntas durante polarización celular. Por último, ensayos de co-inmunoprecipitación y docking demostraron que ambas proteínas son capaces de interaccionar, localizándose en la región basolateral de las células del animal cap del embrión de X. tropicalis.
Análisis de la región catalítica de agmatinase like protein (ALP).
(Universidad de Concepción., 2023) Reyes Cuevas, María Belén; Uribe, Elena Amparo; Martínez-Oyanedel, José
La agmatina es una amina que es hidrolizada por la enzima agmatinasa a putrescina y urea generando una vía alternativa de la síntesis de poliaminas. Esta amina posee propiedades de neurotransmisor y múltiples acciones farmacológicas. En el Laboratorio de Enzimología de la Universidad de Concepción se realizó el clonamiento de una proteína expresada en cerebro de rata con actividad agmatinasa in vitro, la cual fue denominada “agmatinase like protein” (ALP). Esta enzima contiene en su C-terminal un dominio LIM, el cual cumple un rol de regulación auto inhibitoria. ALP requiere manganeso para su actividad catalítica, al igual que las enzimas de la familia ureahidrolasas, sin embargo, posee un bajo grado de identidad con respecto a otras agmatinasas conocidas, por lo que, se desconoce la región y los residuos críticos en la secuencia que participan en la interacción con el cofactor metálico y en el proceso catalítico. En este trabajo a través de herramientas bioinformáticas, se generó un modelo comparativo estructural de ALP a partir del cual se han propuesto residuos putativos que estarían coordinando con los iones de Mn2+. Utilizando este modelo se generaron dos mutantes simples (E288A y D217A), una mutante doble (E288A/K290A) y una mutante triple (N213A/Q215A/D217A), ninguna de las cuales presentó actividad agmatinasa. Estos resultados apoyan nuestro modelo propuesto para los residuos que serían relevantes en la actividad catalítica de ALP y que se dan a conocer en el presente trabajo.
Análisis de transcriptoma en tejido reproductivo mediante secuenciación masiva : abalón rojo (Haliotis rufescens) como modelo de estudio.
(Universidad de Concepción., 2011) Valenzuela Muñoz, Valentina Marjorie; Gallardo Escárate, Cristian
En invertebrados marinos, los mecanismos genéticos involucrados en los procesos de determinación y diferenciación sexual han sido escasamente estudiados, debido a la variedad de estrategias reproductivas que presentan los diferentes taxa y la escasa cantidad de información genómica de estos. Las tecnologías de secuenciación de nueva generación (NGS) entregan nuevas posibilidades para el estudio de transcriptomas en especies no-modelo, al entregar gran cantidad de información sobre determinados procesos y funciones biológicas. El objetivo de este trabajo fue realizar una comparación del transcriptoma en tejido reproductivo de abalón rojo (H. rufescens) e identificar transcritos asociados a la determinación sexual mediante secuenciación masiva y análisis bioinformáticos. Para ello se realizó extracción de ARN desde tejido reproductivo de abalón rojo maduro, posterior a esto se realizó la síntesis de ADNc doble hebra y pirosecuenciación en la plataforma GS FLX (454 Roche). Se obtuvieron un total de 79.877 y 133.850 lecturas las que generaron un total de 11.374 y 42.529 secuencias EST para hembras y machos respectivamente. Las secuencias fueron anotadas a través de Gene Ontology, evidenciando un mayor porcentaje de transcritos en hembras asociados a procesos metabólicos, mientras que en machos se identificó mayor porcentaje de transcritos asociados a procesos de unión. También se identificó la fracción de transcrito diferencial entre machos y hembras utilizando un algoritmo programado en Matlab. Además del total de secuencias se identificaron un total de 4.538 marcadores moleculares tipo SNP y 5.969 EST-SRR. Del análisis de los datos se concluye que existe un 20% de transcritos únicos para cada sexo, de los cuales alrededor de un 50 % no se encuentran anotados.
Análisis del perfil metabolómico y de los micro ARN de nanovesículas extracelulares pequeñas derivadas de células madre/estromales mesenquimales tratadas con oligomicina.
(Universidad de Concepción, 2024) Lagos Aillon, Raul Alejandro; Elizondo Vega, Roberto; Pérez de Armas, Andy
La osteoartritis (OA), es un trastorno articular caracterizado por la pérdida de cartílago hialino, alteraciones óseas e inflamación sinovial (IS), lo que conduce a dolor crónico y discapacidad progresiva. Las terapias celulares basadas en células madre/estromales mesenquimales (MSC) destacan por su capacidad para promover la regeneración del cartílago y reducir la IS. Antecedentes de nuestro equipo de investigación han explorado el impacto de la inducción de un metabolismo glucolítico mediante oligomicina (OLG) en las MSC, y sobre las vesículas extracelulares pequeñas derivadas (sEV) de MSC, en sus propiedades inmunomoduladoras y regenerativas. Datos no publicados indican que sEV de MSC pre-tratadas con OLG promueven el desarrollo de nuevo cartílago y reducen la inflamación en modelos de OA murinos. Para profundizar en los posibles mecanismos asociados a los efectos funcionales de las sEV, hemos decidido determinar el contenido del metaboloma, lipidoma y miRNA de las sEV derivadas de MSC de cordón umbilical (MSC-UC), y analizar su asociación con propiedades condroprotectoras y anti-inflamatorias. Mediante un análisis de secuenciación dirigida, identificamos un aumento significativo en la expresión de 178 miRNA bajo el tratamiento con OLG en sEV derivadas de MSC-UC. Diversos genes blanco de estos miRNA se encuentran asociados a la vía de señalización de TGF-β, la vía de señalización de p53, así como a genes que potenciarían cambios metabólicos. Los análisis metabolómicos a través de espectrometría de masa revelaron la presencia de metabolitos polares como estreptomicina y apolares como prostaglandina D, ácidos grasos y ácido palmítico. Finalmente, un análisis detallado del contenido de estos miRNA, nos permiten establecer una asociación entre el uso de sEV derivados de MSC-UC glucolíticas con sus efectos regenerativos y anti-inflamatorios. Este estudio contribuye a la profundización de los mecanismos asociados a la funcionalidad de las terapias basadas en sEV en el tratamiento de la OA.
Análisis funcional de Ric-8A en la polaridad celular durante la migración de la cresta neural en Xenopus tropicalis
(Universidad de Concepción., 2018) Leal Henríquez, Juan Ignacio; Torrejón Quezada, Marcela Eliana
La cresta neural (CN) es una población celular embrionaria transitoria, pluripotencial y característica de vertebrados, que migra extensivamente durante el desarrollo embrionario. Se ha demostrado que Ric-8A, un factor intercambiador de nucleótidos de guanina (GEF) para diferentes subunidades Gα heterotriméricas, regula la migración celular de la CN craneal (CNC) en Xenopus mediante mecanismos que permanecen aún por dilucidar. Para migrar apropiadamente, las células de la CNC establecen un eje de polarización y se someten a cambios morfológicos para generar protrusiones en el borde director y retracción en la zona posterior. Este remodelamiento del citoesqueleto durante la migración es regulado por proteínas de la familia Rho GTPasas, las cuales requieren activación localizada y específica para regular la reorganización del citoesqueleto de actina y la contractibilidad de la actomiosina en las células que migran de forma direccionada. En esta tesis, nos propusimos estudiar el rol de Ric-8A en la polaridad durante la migración de las células de la CNC. Para ello, se evaluó el efecto de la pérdida y ganancia de función de Ric-8A sobre la localización espaciotemporal de Rac1 y RhoA activadas, y sobre la localización de las proteínas marcadoras de polaridad aPKC y Par3. Demostramos que las proteínas aPKC y Par3 pierden su localización con el silenciamiento de Ric-8A. Por otro lado, las proteínas Rac1 y RhoA activadas cambiaban su localización cuando se silencia o sobreexpresa Ric-8A. Por lo que los niveles de Ric-8A son críticos durante la migración y afectan la localización tanto de los marcadores de polaridad como de la localización subcelular de la actividad de las Rho GTPasas, sugiriendo que Ric-8A, probablemente a través de señalización mediada por proteína G heterotrimérica, regula la polaridad celular durante la migración de CNC.
Análisis funcional del dominio CH de LIMCH1.
(Universidad de Concepción., 2018) González San Martín, Arlette Denise; Uribe Pérez, Elena Amparo
Las agmatinasas catalizan la hidrólisis de agmatina en putrescina y urea, y requieren del ion Mn2+ para su actividad catalítica. Su sustrato agmatina, se genera por la descarboxilación de la arginina en una reacción mediada por la enzima arginina descarboxilasa (ADC). La agmatina es considerada un neurotransmisor/neuromodulador, y entre sus funciones se encuentran la modulación de la liberación de insulina y la regulación de la concentración de poliaminas intracelulares, a nivel farmacológico se ha encontrado que tiene efectos anticonvulsionantes, antidepresivos y anti ansiolíticos. Su producto putrescina, es un precursor de la síntesis de las poliaminas espermina y espermidina, indispensables para el ciclo celular, mantención del citoesqueleto y remodelación de la cromatina. En nuestro laboratorio se clonó, expresó y caracterizó una proteína de cerebro de rata, con actividad agmatinasa denominada LIMCH1. Esta proteína comparte la localización cerebral descrita para la agmatina y para la enzima ADC, por lo cual podría estar regulando las concentraciones de agmatina a nivel cerebral. Sin embargo, a pesar de presentar una significativa actividad agmatinasa, su secuencia es altamente divergente de las agmatinasas descritas. LIMCH1 posee un dominio LIM en su extremo C-terminal, el cual posee un rol regulatorio de su actividad enzimática, inhibiéndola, y posee un dominio de homología a calponina, CH, en su extremo N-terminal. Los dominios CH han sido descritos como dominios de interacción con proteínas del citoesqueleto y han sido clasificados en 3 grupos, donde los dominios CH1 y CH2, se X encuentran en tándem y forman un dominio de interacción a actina (ABD). Los dominios CH3 se encuentran en una sola repetición en proteínas de unión a citoesqueleto, scaffold y proteínas asociadas a transducción de señales. Análisis de secuencia indican que el dominio CH de LIMCH1 pertenece al tercer grupo. Es así que, considerando los antecedentes con respecto a los dominios CH tipo 3, y la importancia de las poliaminas en la estructura del citoesqueleto, planteamos como hipótesis que el dominio CH de LIMCH1 interacciona con las proteínas del citoesqueleto actina y tubulina. En esta tesis se analizó la interacción del dominio CH de LIMCH1 con G-actina y tubulina, utilizando un protocolo in vitro de coinmunoprecipitación (CoIP). Para estos experimentos, se generó la proteína de fusión SBP-CH (streptavidin binding protein-CH) y se utilizó un anticuerpo anti-SBP para realizar la CoIP in vitro. A continuación los inmunoprecipitados obtenidos, se revelaron con anticuerpos anti-SBP, anti-β actina y anti-α tubulina. Obteniendo resultados positivos con el anticuerpo anti-β actina. Por lo que se propone que ambas proteína, SBP-CH y β-actina, estarían formando parte de un complejo proteico. En conexión con estos resultados, se generó un modelo estructural del dominio CH de LIMCH1 el cual está formado por 2 α-hélices centrales rodeadas de α-hélices secundarias danto un total de 7 α-hélices. Sin embargo, no todos los residuos que lo conforman se encuentran en el nivel energético correcto, por lo que es necesario un análisis a profundidad del modelo y su refinamiento.
Análisis funcional y estructural de mutantes de dominio lim en agmatinasa de cerebro de rata.
(Universidad de Concepción., 2013) Montes Romero, Paola Andrea; Uribe Pérez, Elena Amparo; Martínez, José
La agmatinasa cataliza la hidrólisis de agmatina en putrescina y urea, la información relacionada con esta enzima en mamíferos es escasa por lo cual aún se desconocen múltiples aspectos de la misma. La agmatina ha sido ampliamente estudiada identificando su participación como poliamina en roles fisiológicos diversos, también posee propiedades de neurotransmisión y es candidata farmacológica para tratar diferentes patologías. Debido al escaso conocimiento que se tiene sobre agmatinasa en el Laboratorio de Enzimología de la Universidad de Concepción se realizó el clonamiento de una proteína expresada en cerebro de rata que posee actividad in vitro como agmatinasa, sin embargo esta proteína al ser comparada con la agmatinasa humana y de E.coli presenta un bajo porcentaje de identidad. La proteína obtenida fue denominada “agmatinase like protein” (ALP) y en su secuencia se encontró un dominio LIM. En trabajos anteriores se reconoció el papel de este dominio como de regulación auto inhibitoria en la ALP, ya que la deleción del mismo en la proteína aumenta su actividad. La principal característica del dominio LIM es tener un sistema de coordinación tipo dedos de zinc entre dos iones Zn2+ y residuos de cisteína e histidina principalmente. Por lo cual, el objetivo del trabajo fue determinar el efecto funcional y estructural del Zn2+ en la ALP, para lo cual se realizaron tres mutaciones sitio dirigidas en residuos reconocidos comoigandos que coordinan el zinc, reemplazándolos por alanina. Se evaluó la actividad enzimática de las especies mutantes, su contenido de metales y la fluorescencia emitida; encontrando que en la mutante C453A se produjo un aumento de 14 veces en la kcat y la Km se mantuvo, no posee zinc y se evidencian cambios significativos en la fluorescencia intrínseca de triptófanos a través de las gráficas de Stern-Volmer. Las dos mutantes restantes (H476A y C507A) no presentan cambios en la actividad enzimática, su contenido de zinc se reduce al 50% en comparación a la ALP silvestre y se pueden apreciar cambios menores en la fluorescencia emitida. También se realizó un modelo del dominio LIM para describir su estructura obteniendo un modelo que describe la unión entre el zinc los residuos de cisteína e histidina presentes en la ALP. En este sentido se concluye que la mutante C453A es fundamental para mantener la estabilidad estructural y función inhibitoria del dominio LIM en la ALP. Las otras mutantes no son residuos claves para la inhibición que ejerce este dominio. A partir de estos resultados se propone que los iones Zn2+ son claves en la acción autoinhibitoria del dominio LIM sobre ALP y la mutante C453A es fundamental en este efecto.
Análisis metagenómico de cianobacterias del género Prochlorococcus presentes en aguas con condiciones de baja luminosidad y escasez de oxígeno del Océano Pacífico Sur-Oriental.
(Universidad de Concepción., 2014) Astorga Eló, Marcia Carolina; Ulloa Quijada, Osvaldo
Las cianobacterias unicelulares del género Prochlorococcus son los organismos fotosintéticos más abundantes en los océanos y actores clave en el ciclo global del carbono. En la actualidad, se encuentran depositados en las bases de datos públicas trece genomas completos de Prochlorococcus secuenciados, cubriendo la gama de ecotipos descritos para este género, de acuerdo a su distribución en la columna de agua y la clasificación por medio de técnicas filogenéticas utilizando el gen 16S ARNr. Estos ecotipos se clasifican en “High Light (HL) y Low Light (LL) adapted”, vale decir adaptados a condiciones de alta y baja luminosidad. Una de las principales inquietudes respecto a la amplia distribución de Prochlorococcus, es si son capaces de prosperar en zonas del océano carentes de oxígeno, denominadas Zonas de Mínimo Oxígeno (OMZ). Estudios previos han demostrado la presencia de organismos de esta especie en las zonas subóxicas y anóxicas del océano. Sin embargo debido a la imposibilidad de cultivarlos en laboratorio, no ha sido posible llevar a cabo un estudio más detallado de las posibles características o adaptaciones que les permiten vivir en este ambiente. De 1.440.420 reads, obtenidos como producto de la secuenciación directa del metagenoma obtenido del centro anóxico de la OMZ del norte de Chile, mediante la técnica de pirosecuenciación, se pudo ensamblar y validar 305 contigs, de los cuales 150 fueron asignados positivamente a Prochlorococcus. En estos contigs fueron identificados ORFs correspondientes a aspC, aspartato aminotransferasa, melB, transportador de glucosa y narB, nitrato reductasa. Además se encontraron genes que estarían dando cuenta de la biosíntesis de clorofila con y sin utilización de oxígeno.12 Este repertorio genético indicó que Prochlorococcus es capaz, además de fijar CO2 mediante fotosíntesis, de incorporar glucosa a partir del ambiente y de asimilar nitrato, una característica que no se ha descrito previamente para estos organismos. Por otra parte, se estarían generando intermediarios metabólicos y equivalentes reductores por una variación del ciclo de TCA clásico. La capacidad de Prochlorococcus para fijar C y para adquirir C inorgánico desde el entorno a través de un transportador de glucosa permite señalar la capacidad heterotrófica de Prochlorococcus. Esta capacidades, no descritas previamente para ninguno de los ecotipos de Prochlorococcus secuenciados hasta la fecha, permiten sugerir que estas características podrían ser parte de las adaptaciones de esta cianobacteria a las condiciones anóxicas del entorno en el que habitan.