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Efecto de la concentración de sustrato en la degradación aeróbica de fenantreno por cepas bacterianas ambientales.
(Universidad de Concepción., 2000) Cerda Leal, Fabiola; Urrutia Briones, Homero
Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) son compuestos hidrofóbicos conformados por dos o más anillos aromáticos, con potencial cancerígeno y mutagénico y cuya persistencia en los ecosistemas se debe principalmente a su baja solubilidad en agua, lo que aumenta su adsorción a la materia orgánica y disminuye su biodegradación. Este tipo de contaminantes ambientales es degradado principalmente por vía biológica, aunque en ocasiones los procesos de degradación son incompletos, dado que los HAP no se encuentran solubles en el medio y generalmente, este estado es considerado un pre requisito para su biodegradación.El presente estudio se desarrolló con el propósito de conocer el efecto de la concentración de HAP sobre su tasa de degradación por cepas bacterianas de origen ambiental aisladas de la Bahía de San Vicente Chile y la interrelación entre diferentes concentraciones de fenantreno en la fase acuosa sobre la cinética de crecimiento bacteriano y la cinética de degradación de éstos compuestos. Se tomaron muestras de aguas superficiales de la Bahía de San Vicente y se implementaron cultivos de enriquecimiento en petróleo crudo y fenantreno como fuentes únicas de carbono y energía. Se seleccionaron e identificaron tres cepas bacterianas con capacidad degradativa sobre estos sustratos: Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mendocina y Bacillus sp. Las cepas se cultivaron en presencia de 0,5; 1,0; 2,0 y 50 mg/l de fenantreno y se determinaron las cinéticas de crecimiento y degradación del sustrato. La velocidad de crecimiento (, h-1) varío entre 0,123 (+0,04) y 0,365 (+0,035) 2h-1 en las concentraciones de 0,5 y 50,0 mg/l de fenantreno respectivamente. A su vez, la mayor degradación de sustrato después de 48 h de cultivo se obtuvo con la concentración 50 mg/l de fenantreno (5,15 mg/l). Algunos de los parámetros de la cinética de crecimiento bacteriano determinados en este estudio presentaron valores máximos en la concentración 1 mg/l de sustrato en la fase acuosa. Las velocidades de crecimiento mostraron diferencias estadísticamente significativas entre 0,5 y 1,0 mg/l. Por otro lado, en las diferentes concentraciones ensayadas los parámetros de la cinética degradativa (Ks= 0,48 y Vmáx= 0,245 ) indican que ésta estaría limitada por la concentración de sustrato en la fase acuosa. Por lo tanto, se comprueba la hipótesis
Prevalencia de integrones en Bacilos Gram negativos heterotróficos aeróbicos aislados del río Biobío y su relación con el fenotipo de resistencia a antibióticos.
(Universidad de Concepción., 2000) Sossa Fernández, Katherine Elizabeth; González Rocha, Gerardo Enrique
Los bacilos Gram negativos han adquirido importancia como microorganismos patógenos oportunistas debido a su multiresistencia a los agentes antibacterianos, la cual puede estar codificada en ADN cromosomal o extracromosomal (plásmidos, transposones o integrones). Diversos estudios se han orientado a dilucidar el rol de plásmidos y transposones en la diseminación de genes de resistencia en ambientes naturales, pero existe poca información acerca de la participación de los integrones en este fenómeno biológico. El objetivo de este trabajo fue evaluar la frecuencia de integrones en bacilos Gram negativos heterotróficos aerobios aislados del sedimento del río Biobío y la relación de estos elementos genéticos con la resistencia a antibióticos. Se aislaron cepas de bacilos Gram negativos desde muestras de sedimento del río Biobío en Queuco, Coigüe, Chiguay y Puente SS. Juan Pablo II y se investigó la contaminación fecal en muestras de cada estación. Se realizó hibridación en colonia con 1029 cepas bacterianas, empleando oligonucleótidos específicos para el gen de la integrasa de los integrones clase 1 y clase 2. Además, se estudió la actividad de algunos agentes antibacterianos sobre las cepas que dieron señal positiva. También, se incluyó un grupo de cepas con señal negativa. Los recuentos de bacilos Gram negativos oscilaron entre 105 y 107 UFC/g de sedimento seco. Se seleccionaron aproximadamente 250 cepas de cada estación para el ensayo de hibridación. Las frecuencias porcentuales de cepas que poseen ambas o cualquiera de las dos integrasas fueron 22,3 %, 44,0 %, 45,6 % y 54,8 % en bacterias de las estaciones de Queuco, Coigüe, Chiguay y Puente SS. Juan Pablo II, respectivamente. Los valores siempre aumentaron río abajo, en relación directa con la magnitud de la contaminación fecal, que aumentó desde 3,1 x 103a 1,4 x 106 NMP/100 g de sedimento seco. Los integrones clase 1 fueron significativamente más frecuentes (%) en todas las estaciones. No se encontraron diferencias significativas entre los valores del Índice de Resistencia Antibiótica (IRA) entre cepas con y sin integrones, pero se observó que en las bacterias con integrones es mayor el número de cepas resistentes a antibióticos aminoglucósidos como estreptomicina y tobramicina. Estos resultados demuestran la presencia de integrones en bacterias Gram negativas del sedimento del río Biobío y las elevadas frecuencias encontradas sugieren que estos elementos genéticos pueden estar participando en la diseminación de algunos genes de importancia ambiental.
B-Lactamasas de espectro extendido en cepas de Klebsiella spp. y Eschericha coli resistentes a cefalosporinas de tercera generación.
(Universidad de Concepción., 2001) Zemelman Merino, Claudia Angélica; Domínguez Yévenes, Maríana
Las infecciones ocasionadas por bacterias Gram negativas, especialmente las intrahospitalarias, constituyen una de las indicaciones más frecuentes de uso de antibióticos bactericidas y de amplio espectro, entre ellos cefalosporinas de tercera generación. Escherichia coli y Klebsiella spp. participan en una proporción importante como agentes etiológicos de cuadros infecciosos graves y presentan grados variables de susceptibilidad a cefalosporinas de tercera generación. La resistencia a estos compuestos se encuentra determinada por ß-lactamasas, enzimas que son codificadas por genes cromosomales o extracromosomales. Epidemiológicamente son más importantes las últimas porque los genes codificantes pueden ser transferidos, favoreciéndose su diseminación en el medio hospitalario. Las ß-lactamasas de codificación cromosomal manifiestan especial actividad sobre cefalosporinas de primera a tercera generación y no son inhibidas por ácido clavulánico. Por el contrario, las enzimas extracromosomales son inhibidas por ácido clavulánico y pueden pertenecer a varias familias, como SHV y TEM en enterobacterias y, con menor frecuencia, a otros grupos (ej. CTX-M, PER, OXA, etc.). En los últimos años circulan, con relativa frecuencia, cepas de Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli que producen ß-lactamasas con actividad hidrolítica sobre cefalosporinas de tercera generación las que, por esta razón, se denominan ß-lactamasas de espectro extendido. Estas enzimas son inhibidas por ácido clavulánico, característica que permite la pesquisa de las cepas bacterianas que las producen en el laboratorio. En esta Tesis se determinó los patrones y niveles de resistencia de 171 cepas de Klebsiella spp. y 150 cepas de E. coli aisladas de procesos infecciosos en pacientes 15provenientes de diferentes hospitales. Las cepas bacterianas se purificaron e identificaron por los métodos bacteriológicos habituales y se investigó la presencia de ß-lactamasas de espectro extendido en estas bacterias por dos métodos microbiológicos basados en la sinergia que se produce entre cefalosporinas de tercera generación (cefotaxima y ceftazidima) y ácido clavulánico. La presencia de las enzimas fue corroborada mediante la determinación de las concentraciones mínimas inhibitorias (CMIs) de las cefalosporinas, en ausencia y en presencia de ácido clavulánico. Este compuesto inhibidor produce habitualmente una disminución de las CMIs equivalente, al menos, a ¼ de la CMI del antibiótico solo, siempre y cuando no existan otros mecanismos de resistencia adicionales. Posteriormente se determinó los puntos isoeléctricos de las ß-lactamasas de espectro extendido mediante isoelectroenfoque. Se investigó el grupo enzimático al cual pertenecían las enzimas por amplificación genética, mediante reacción de polimerasa en cadena (PCR), utilizando partidores con secuencias específicas para los grupos más importantes de ß-lactamasas de espectro extendido (TEM, SHV, OXA, PER y CTX-M). También se realizaron experiencias de conjugación bacteriana entre cepas de K. pneumoniae y E. coli, como bacterias dadoras, y una cepa de E. coli K-12, como receptora, para comprobar la ubicación extracromosomal de los genes que codifican las ß-lactamasas de espectro extendido. Los resultados obtenidos en las experiencias de sinergia entre cefalosporinas de tercera generación y ácido clavulánico permitieron detectar la presencia de 75 cepas de Klebsiella spp. y de 12 cepas de E. coli productoras de ß-lactamasas de espectro extendido. En todas las cepas seleccionadas se produjo una disminución de la resistencia a cefalosporinas de tercera generación en presencia de ácido clavulánico, indicando la presencia de ß-lactamasas de espectro extendido. Este efecto fue superior cuando se empleó cefotaxima o ceftazidima, pero inferior en el caso de cefepima. En las cepas de Klebsiella spp. se detectaron ß-lactamasas con puntos isoeléctricos 5.4, 6.4, 7.0, 7.6, 8.2, 8.6 y 8.4, siendo las enzimas más frecuentes aquéllas con pI 5.4 (72 cepas) y 7.6 (69 cepas). Con menor frecuencia se encontraron ß-lactamasas con pI 8.2 (42 cepas), 8.6 (12 cepas), 6.4 (3 cepas) y 8.4 (5 cepas). En cambio en E. coli la distribución de ß-lactamasas de acuerdo a sus respectivos pIs fue: 5.4 (11 cepas), 8.4 (5 cepas), 8.2 (3 cepas), 7.9 (2 cepas), 7.0 (1 cepa), > 8.5 (2 cepas). La mayor parte de las cepas estudiadas presentó varias ß-lactamasas, siendo esto más frecuente en cepas de Klebsiella spp. (75 cepas con más de una ß-lactamasa). En E. coli, en cambio, 5 de las 12 cepas presentaron una sola enzima, 3 cepas presentaron dos ß-lactamasas y 4 cepas presentaron tres enzimas, de acuerdo a los pIs encontrados. Se logró transferir la resistencia de una cepa de K. pneumoniae y de una cepa de E. coli a una cepa de E. coli K-12, comprobándose la presencia de un plásmido de peso molecular de 55kD en las cepas dadoras y en las transconjugantes.Los resultados permiten concluir que las ß-lactamasas de espectro extendido son frecuentes en cepas multiresistentes de Klebsiella spp. y de E. coli, aunque la frecuencia es más elevada en las primeras. Las frecuencias encontradas son relativamente más elevadas que las informadas por otros autores sudamericanos y europeos, aunque en otros países la frecuencia es relativamente similar. Los resultados indican la presencia de un complejo enzimático en las cepas deKlebsiella spp. y de E. coli, con amplia similitud en los tipos de ß-lactamasas. También existe similitud en el plásmido que parece codificar estas enzimas. Esto permite concluir acerca de una constante interacción genética intrahospitalaria entre ambos microorganismos.
Genotipificación de cepas de Helicobacter pylori aisladas de pacientes con patología digestiva alta en base a los genes cagA y vacA.
(Universidad de Concepción., 2001) Martínez Torres, Alejandra; González Correa, Carlos
Helicobacter pylori es agente etiopatogénico de gastritis crónica antral y de enfermedad péptica ulcerosa. Su distribución es mundial y la prevalencia de la infección por esta bacteria en Chile oscila entre 60 a 75%, dependiendo de la población estudiada. La evolución de la infección depende tanto de factores del huésped como del microorganismo; entre estos últimos, la presencia del gen cagA y el genotipo de vacA son dos importantes factores. Por ello, el objetivo de esta Tesis fue genotipificar, en base a los genes cagA y vacA, cepas de H. pylori obtenidas de pacientes con sintomatología digestiva alta y determinar si existen diferencias en la evolución de la infección, desde el punto de vista de las manifestaciones clínicas e histopatológicas, dependiendo del genotipo de la cepa infectante.Se estudiaron las cepas de H. pylori obtenidas de 50 pacientes, 17 con enfermedad péptica ulcerosa (EPU) y 33 con dispepsia no ulcerosa (DNU). De cada paciente se tomaron biopsias de mucosa antropilórica para prueba de ureasa directa, cultivo e histopatología. El cultivo se realizó en agar Columbia suplementado con sangre e inhibidor Dent. El análisis histopatológico se realizó de acuerdo al sistema Sydney actualizado. La detección de cagA y la genotificación de vacA se realizó mediante PCR. El gen cagA se detectó en 19 (38%) de las muestras analizadas. La prevalencia de infección con cepas cagA+ fue mayor en hombres, 11/23 (47.8%), que en mujeres, 8/27 (29.6%) (p=NS). Con respecto a vacA, la secuencia señal fue del tipo s1 en 16 (32%) de las muestras; s2, en 16 (32%); hubo amplificación simultánea de s1 y s2, en 9 (18%) y no fue tipificable en 9 (18%). En las muestras de mujeres y hombres, se detectó infección con el tipo s1, en 10 (37%) y en 15 (65.2%); con el s2, en 16 (59.3%) y en 9 (39.1%), respectivamente. La prevalencia de infección con cepas s1 fue mayor en los pacientes con EPU, 12/17 (70.6%), que en los con DNU, 13/33 (39.4%) (p<0.05). La región media de vacA fue m1 en 9 (18%) muestras, m2 en 29 (58%) y hubo amplificación simultánea de m1 y m2 en 12 (24%). En las muestras de mujeres y hombres, se detectó infección con el tipo m1, en 7 (25.9%) y en 14 (60.9%); con el m2, en 25 (92.6%) y en 16 (69.6%) (p<0.05), respectivamente. La prevalencia de infección con el tipo m1 fue mayor en las muestras de pacientes con EPU, 10/17 (58.8%), que en las de pacientes con DNU, 11/33 (33.3%) (p<0.0001). El tipo de secuencia señal no mostró asociación con el tipo de gastritis crónica (GC), pero 24/28 (85.7%) de los pacientes con GC activa presentó infección con cepas del tipo m2 (p=NS). En 16 muestras (32%) se detectó presencia de más de un tipo de secuencia señal o de región media. En los pacientes en que sólo se detectó una cepa, el genotipo s2/m2 se detectó en 15 muestras; s1/m1, en 7; s1/m2, en 4; y s2/m1, en 1. La prevalencia de infección con más de una cepa fue mayor en pacientes con EPU, 9/17 (52.9%), que en pacientes con DNU, 7/33 (21.2%) (p<0.05). De los pacientes con reacción hiperproliferativa linfática (RLH), 6/8 (75%) tenían infección con cepas cagA- vacA m2 (p<0.05). Esta Tesis permite concluir que en los pacientes estudiados, (1) predomina la infección con cepas cagA-; (2) la prevalencia de infección con cepas s1 y s2 es similar; (3) el tipo de región media predominante es la m2; (4) EPU se asocia a infección múltiple, gen vacA con secuencia señal del tipo s1 y región media del tipo m1; (5) la RLH se asocia a infección con cepas cagA- vacA m2.
Obtención de cepas mutantes de Mycobacterium sp. con actividad biotransformadora de fitoesteroles.
(Universidad de Concepción., 2001) Vidal Oyarce, Maricel de Lourdes; Silva Osorio, Mario; Mondaca Jara, María Angélica
Las transformaciones microbiológicas de compuestos orgánicos han sido estudiadas desde hace varias décadas, siendo uno de los mayores aportes en la industria farmacéutica, para la obtención de antibióticos y esteroides. El consumo de esteroides y sus derivados han tenido un aumento continuo a nivel mundial, por otro lado, las fuentes de obtención, a partir de productos naturales mediante hemisíntesis química, han sufrido una disminución paulatina, debido a un agotamiento de la principal materia prima, las plantas del género Dioscorea. La ruta microbiológica, en la obtención de esteroides, nace como una alternativa de bajo costo y de menos etapas, en donde se han utilizado una variedad de cepas de hongos, bacterias y microalgas. En este trabajo, se seleccionaron cepas mutantes de Mycobacterium sp. MB-3683 y Mycobacterium fortuitum B-11045 con capacidad biotransformadora de fitoesteroles. Sobre estas cepas, se ejerció una presión selectiva mediante el uso de altas concentraciones de sustrato. Para esto, se cultivaron ambas cepas de Mycobacterium en un medio enriquecido con -sitosterol (14 gr/l) como única fuente de carbono. Durante este proceso, se realizaron siete traspasos sucesivos de los cultivos bacterianos en un período de dos meses. La extracción de productos de biotransformación se realizó con metanol y acetato de etilo y posteriormente los análisis cualitativo y cuantitativo se llevaron a cabo mediante cromatografía en capa fina, cromatografía gas-líquido (GLC) y GLC-masa. Bajo estas condiciones, se observó que después de los siete traspasos, las cepas Mycobacterium sp. MB-3683 y M. fortuitum B-11045, aumentaron su porcentaje de biotransformación desde un 20% a un 64% y desde un 34% a un 55%, respectivamente. Los productos de biotransformación obtenidos, en mayor proporción, para cada 2 experiencia fueron la androstenediona (AD) y androstadienediona (ADD). Además, se aisló a partir del quinto traspaso, un producto derivado del AD que posee un grupo hidroxilo en posición 9, que es una excelente alternativa para la obtención de un grupo de hormonas esteroidales, del tipo corticoides. Los resultados sugieren que, una elevada concentración de sustrato es un buen mecanismo selectivo de cepas más eficientes en la biotransformación de ß-sitosterol a bases esteroidales, y que, además, la biotransformación puede dirigirse hacia la obtención de productos definidos como el 9-OH-AD.
Estudio de algunas propiedades biológicas de lipopolisacáridos extraídos de cepas de Helicobacter pylori aisladas de biopsias gástricas.
(Universidad de Concepción., 2001) Salgado Sánchez, Fernando; García Cancino, Apolinaria del Rosario
El bacilo Gram negativo Helicobacter pylori es el principal microorganismo involucrado en la gastritis del antro gástrico, donde produce una infección cuya cronicidad se asocia con la aparición de úlcera gástrica, cáncer gástrico y linfoma MALT. La identificación de los factores bacterianos que favorecen la patogenicidad de esta especie, así como el rol que cada uno de estos posee, es aún motivo de controversia. Sin embargo, se sabe que las proteínas CagA, VacA, la ureasa, los flagelos, las adhesinas y el LPS contribuyen al establecimiento de la patología gástrica y determinan variaciones en la presentación clínica de la infección. La participación del LPS como posible factor de virulencia se fundamenta en estudios biológicos y estructurales de la macromolécula, los cuales han demostrado la heterogeneidad y la antigenicidad de la misma. Por otra parte, los resultados de la evaluación de ciertos parámetros inmunológicos indica la participación del LPS como elemento involucrado en la respuesta inflamatoria asociada al microorganismo. En esta tesis se investigó la actividad biológica del LPS de H. pylori, extraído de cepas bacterianas aisladas de biopsias gástricas, obtenidas de pacientes con diversos diagnósticos histopatológicos y endoscópicos. El objetivo general fue conocer algunas propiedades inmunológicas del LPS que podrían contribuir a la virulencia y patogenicidad de este microrganismo. Los LPS se obtuvieron por extracción fenólica en caliente, se purificaron por tratamiento con ADN asa, ARNasa, lisozima y proteinasa K y se ensayaron para evaluar su actividad biológica utilizando el modelo murino. Se estudió la capacidad del LPS para estimular, in vitro, la mutagenicidad y la secreción de FNT en células esplénicas de ratón y se evaluó, in vivo, la actividad de los extractos para inducir esplenomegalia. Además, se determinó la endotoxicidad de las preparaciones de LPS mediante la prueba de Limulus. Todos los extractos de LPS estudiados se comportaron como inductores mitogénicos, estimularon la secreción de FNT in vitro y además, indujeron el crecimiento del bazo. Sin embargo, se observaron diferencias en la intensidad de la actividad biológica, la que fue mayor en aquellos extractos obtenidos de cepas aisladas de pacientes con gastritis crónica activa asociada a regeneración epitelial. El resto de los extractos de LPS obtenidos de cepas aisladas de pacientes con distintos diagnósticos histopatológicos evidenció una respuesta menor y bastante homogénea. Sorprendentemente, las cepas con LPS de mayor actividad biológica correspondieron a cepas con genotipos de baja virulencia para vacA. Los resultados presentados en esta tesis sugieren que el LPS de H. pylori podría tener una participación importante en la respuesta inmunológica que se desencadena en el epitelio gástrico, como consecuencia de la infección y posterior colonización del patógeno. Las propiedades estudiadas establecen que el LPS de H. pylori es capaz de iniciar respuestas biológicas in vitro e in vivo, por lo cual, constituye un factor de virulencia para algunas cepas de esta especie bacteriana.
Presencia de integrones y su relación con la resistencia a antibióticos B-lactámicos en cepas intrahospitalarias de acinetobacter baumannii resistentes a cefalosporinas de tercera generación.
(Universidad de Concepción., 2001) Ramírez González, César Alexis; González Rocha, Gerardo Enrique
Acinetobacter baumannii corresponde a un cocobacilo Gram negativo, no fermentador. Este patógeno oportunista es un importante agente etiológico de infecciones intrahospitalarias, incluyendo bacteremia, infecciones del tracto urinario, meningitis secundaria y, más frecuentemente, como agente de neumonía, particularmente asociada a pacientes confinados en unidades de cuidados intensivos. Estas infecciones son difíciles de tratar debido a que esta especie presenta una elevada y múltiple resistencia a los principales grupos de antibióticos usados en la terapia antinfecciosa, incluyéndose entre ellos a las cefalosporinas de tercera generación. Diversos mecanismos de resistencia a estos antibióticos han sido descritos, los que están mediados básicamente por la expresión de enzimas que hidrolizan el anillo -lactámico y, en menor proporción, por impermeabilidad de la membrana externa a este tipo de compuestos. Sin embargo, la mayor parte de la resistencia a antibióticos -lactámicos, en Gram negativos, está asociada con la producción de -lactamasas, incluyendo enzimas de las familias TEM, SHV, IMP, OXA y sus derivados. En Acinetobacter spp. se han descrito algunas de ellas, y recientemente se demostró la presencia de -lactamasas de espectro extendido (BLEE) que son capaces de hidrolizar cefalosporinas de tercera generación. La diseminación de genes de resistencia normalmente ocurre a través de plásmidos y transposones, sin embargo, nuevos elementos genéticos estarían participando en este fenómeno, los que son conocidos como integrones. Se ha informado de la existencia de cuatro clases de integrones, detectándose en Acinetobacter las clases 1 y 2, los que a su vez pueden contener uno o varios cassettes genéticos que codifican para la resistencia a diversos antibióticos. De esta forma, los cassettes genéticos representan una nueva clase de elementos genéticos que se movilizan mediante recombinación sitio-específica. En este sentido, plásmidos y transposones juegan un rol importante, debido a que la asociación de integrones con transposones o plásmidos, explicaría la presencia de cepas que son simultáneamente resistentes a diferentes antibióticos. De acuerdo a esto, es posible prever como la pesquisa de integrones y cassettes genéticos asociados a estos elementos será de gran importancia al momento de explicar no sólo la diseminación de estos elementos, sino también la multiresistencia que presentan algunas cepas bacterianas. En este trabajo se investigó el rol de los integrones en la resistencia a cefalosporinas de tercera generación en 100 cepas hospitalarias de A. baumannii, la mayoría resistentes a estos antibióticos. Se identificó, mediante hibridación en colonia y PCR, la presencia de integrones en 76 % de las cepas estudiadas distribuyéndose en 2 % con clase 1, 73 % con clase 2 y sólo 1 % de las cepas presentó simultáneamente integrón clase 1 y 2. Por otro lado, se detectaron los genes que codifican para las -lactamasas pertenecientes a la familia TEM en 73 % de las cepas y OXA en 1 %. La caracterización de los integrones en algunas cepas de A. baumannii, reveló la presencia de cassettes genéticos que codifican resistencia a antibióticos aminoglicósidos y trimetoprim. Sólo una cepa (97-53) presentó un cassette codificante de -lactamasa, correspondiendo a una enzima tipo OXA, asociada al integrón clase 1 y 2. Además, se detectaron cepas que siendo resistentes a este grupo de antibióticos no presentaban integrones, mientras que otras siendo susceptibles sí los poseían. Por lo tanto, no se encontró una relación directa entre la presencia de integrones y la resistencia a cefalosporinas de tercera generación en las cepas de A. baumannii estudiadas.
Especies de enterococcus spp. en infecciones hospitalarias de la región del Bío-Bío y su comportamiento frente a los agentes antibacterianos.
(2002) Sepúlveda Araneda, Marcela Alejandra; Bello Toledo, Helia Magaly
En el último tiempo, las bacterias Gram negativas y Gram positivas, de origen hospitalario, han desarrollado un dramático aumento en su resistencia a diversos agentes antibacterianos. Estas bacterias resistentes se han constituido en los principales agentes etiológicos de importantes infecciones intrahospitalarias. Entre las bacterias Gram positivas con carácter emergente en los hospitales se encuentra el género Enterococcus que incluye diferentes especies, siendo Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium las de mayor importancia en patologías humanas. Enterococcus spp., en las últimas décadas se ha constituido en uno de los agentes más comunes que causa infecciones adquiridas en los hospitales, debido en gran parte a que son bacterias con un amplio fenotipo de resistencia, natural o adquirida y que incluye a varios grupos de antibióticos comúnmente utilizados en clínica. Los agentes antibacterianos con actividad sobre estas bacterias sólo manifiestan un efecto bacteriostático, lo que impide la erradicación de estas bacterias del paciente. Por lo tanto, las infecciones producidas por Enterococcus spp., comúnmente son tratadas con una combinación potencialmente sinérgica de un antibiótico aminoglicósido con un antibiótico -lactámico, a fin de obtener muerte bacteriana. La detección de altos niveles de resistencia a antibióticos aminoglicósidos en enterococos, principalmente provocada por la presencia de enzimas modificantes de aminoglicósidos (EMA's), y la detección de resistencia de alto nivel a los agentes -lactámicos es clínicamente relevante porque predice la pérdida de efectividad de la combinación aminoglicósidos--lactámicos.En este trabajo se investigó el comportamiento de 305 cepas de Enterococcus spp. aisladas de diferentes hospitales de la región del Bío-Bío frente a los agentes antibacterianos de uso habitual. La identificación se realizó de acuerdo a un esquema tradicional y uno molecular y la actividad antibacteriana se determinó por el método de difusión en agar y dilución seriada en agar (NCCLS, 1998). La identificación de las EMA’s que participan en la resistencia a estos antibacterianos se realizó por hibridación y algunos resultados fueron confirmados por PCR. El 89.2% de las cepas fue identificada como Enterococcus faecalis, seguido de Enterococcus faecium (8.5%) y 2.3% de otras especies. Ninguna cepa presentó resistencia a vancomicina y teicoplanina. El 5.3% de las cepas fue resistente a ampicilina, pero ninguna de ellas era productora de -lactamasa. El 15.1% de las cepas presentó resistencia de elevado nivel a gentamicina y el 32.4% a estreptomicina. Los mayores porcentajes de altos niveles de resistencia a aminoglicósidos fueron para estreptomicina (32.4%), seguido por kanamicina (28.2%), neomicina (25.9%) gentamicina (15.1%), tobramicina (14.8%) y amikacina (11.1%). Se comprobó que los altos niveles de resistencia a antibióticos aminoglicósidos se deben a la presencia de la enzima modificante de aminoglicósidos bifuncional AAC(6’)-APH(2’’), sola o asociada a otra enzima, cuando se trata de resistencia a gentamicina y, a la enzima ANT(6’) sola o asociada, para la resistencia a estreptomicina.De acuerdo a los resultados obtenidos en este trabajo se concluye, que E. faecalis es la especie que se aísla con mayor frecuencia en los hospitales de la VIII región y, que la combinación ampicilina/gentamicina sigue siendo de utilidad clínica; en tanto los antibióticos glicopeptídicos constituyen una buena alternativa terapéutica para infecciones graves causadas por estos microorganismos.
Actividad antibacteriana del vino tinto (cepas pais y cabernet) y de extractos de escobajos y de frutos sobre Helicobacter pylori. efecto antibacteriano del trans-resveratrol.
(Universidad de Concepción., 2002) Daroch Mendoza, Fabiola Macarena; García Cancino, Apolinaria del Rosario
En los últimos años se han estudiado numerosos compuestos del vino tinto y de sus derivados, cómo es el caso de las uvas; involucrados en la quimio prevención de algunos tipos de cáncer. Esto es, debido a las innumerables propiedades antioxidantes que se le han otorgado a algunos compuestos fenólicos encontrados en el vino, especialmente a los denominados vinos “negros” o tintos. Si bien es cierto se conoce bastante sobre la acción antioxidante de los compuestos fenólicos del vino, y escasamente se han explorado otras propiedades beneficiosas para la salud, como es el caso de la actividad antibacteriana de estos compuestos. Este es el caso del resveratrol, un compuesto fenólico sintetizado por la vid, el cual es considerado un metabolito secundario cuya síntesis se ve incrementada cuando la planta se encuentra en condiciones de estrés; es por esa razón que se le considera una fitoalexina. Por lo tanto, considerando que Chile es un País con alto índice de enfermedades gastroduodenales (gastritis tipo B, úlceras y cáncer gástrico), provocadas en un alto porcentaje por Helicobacter pylori, y además por ser un País productor de vinos, es importante encontrar en esta fuente, una terapia alternativa contra la erradicación de H. pylori que disminuya los efectos secundarios de la terapia, evitando de esta manera el aumento de la resistencia frente a los antimicrobianos actualmente en uso. Para este propósito, se analizó la actividad antibacteriana de extractos activos de vinos tintos varietal Pais (nativo) y varietal Cabernet (introducido), y de sus uvas separadas en escobajo, hollejo y pulpa más semilla. Posteriormente se procedió a la identificación y cuantificación de trans-resveratrol mediante Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), con el fin de determinar si la concentración de este compuesto presente en los extractos, es determinante en la actividad anti H. pylori y, además, determinar en que varietal se encuentra la mayor concentración de trans-resveratrol. Por otra parte, se analizó el efecto de trans-resveratrol sobre H. pylori, mediante el estudio morfológico de la célula. Estos estudios fueron realizados por Microscopía de epifluorescencia y por Microscopía de barrido, a distintas concentraciones de trans resveratrol (2, 4, 10, 25 y 50g/ml) y a distintos tiempos (0, 24, 48, 72h).Los resultados presentados por la actividad anti H. pylori de los extractos activos de uvas y vinos varietal Pais y varietal Cabernet fueron diversos, encontrándose una mayor actividad antibacteriana en el varietal Pais que en el varietal Cabernet. Con relación a los resultados presentados por los extractos de uvas (escobajo, hollejo y pulpa más semilla); el escobajo y la pulpa más semilla de ambos varietales presentaron la mayor actividad anti H. pylori, viéndose incrementada esta actividad para el varietal Pais. Esta actividad también se vio incrementada en los extractos de vinos pertenecientes al varietal Pais, cuyos halos de inhibición fueron superiores a los encontrados por el varietal Cabernet (30/20mm de diámetro respectivamente). Los resultados de la actividad antibacteriana, concuerdan con el análisis de cuantificación de trans-resveratrol mediante HPLC, en la cual las concentraciones más altas del compuesto se presentaron en los extractos de vino del varietal Pais, con una concentración de 1,8mg/L para el varietal Pais y de 0,68mg/L para el varietal Cabernet. Por otra parte, el efecto del trans-resveratrol sobre las células de H. pylori, se relaciona estrechamente con la morfología de la bacteria, observándose cambios morfológicos a medida que se incrementan las concentraciones subinhibitorias, cercanas a la CMI. Los cultivos presentaron formas cocoides a concentraciones inferiores a 10g/ml y formas filamentosas a concentraciones superiores a ésta.Los ensayos realizados con el extracto activo del vino Pais, presentaron los mismos resultados mostrados por H. pylori cuando son incubados a 50g/ml del compuesto, observándose claramente la formación de filamentos, sugiriendo que el trans-resveratrol es uno de los principales compuestos activos del vino involucrado en la actividad anti H. pylori. Respecto a los resultados relacionados con la morfología de la bacteria, se observa que H. pylori incubado en un medio libre de transresveratrol, pero previamente expuesto a éste, presenta una reversibilidad morfológica a través del tiempo, volviendo a su morfología inicial. Por lo anterior, los extractos de vinos y uvas presentaron actividad anti H. pylori, la que estaría estrechamente relacionada con el trans-resveratrol y las concentraciones de éste en los extractos activos, aunque se supone que además existen otros compuestos en el vino que estarían incrementando la actividad anti H. pylori. En lo que respecta al efecto del trans-resveratrol como agente antibacteriano, queda de manifiesto que el compuesto en estudio afecta en forma reversible la morfología de la bacteria, sugiriendo que el transresveratrol pudiera estar afectando algún componente celular involucrado en la morfología de H. pylori
Bases genéticas de la resistencia de alto nivel a trimetoprim en cepas hospitalarias de Acinetobacter baumannii.
(Universidad de Concepción., 2002) Muñoz Campos, Marlene Roxana; González Rocha, Gerardo Enrique
Acinetobacter baumannii es un cocobacilo Gram negativo de importancia en el ambiente hospitalario, como agente etiológico de infecciones severas que afectan principalmente a pacientes inmunodeprimidos. Actualmente, gran parte de las cepas son resistentes a la mayoría de los agentes antibacterianos, limitándose las alternativas terapéuticas disponibles para el tratamiento de infecciones producidas por este microorganismo. Por ello, existe interés por aumentar el conocimiento acerca de las bases genéticas de los mecanismos de resistencia de esta bacteria. Trimetoprim es un agente antibacteriano utilizado en infecciones respiratorias y urinarias. Los genes que codifican la resistencia más frecuente a este compuesto son extracromosomales. Se han descrito 19 tipos de dihidrofolato reductasas (DHFRs) insusceptibles a trimetoprim, codificadas extracromosomalmente, que otorgan diferentes niveles de resistencia a este compuesto antibacteriano.El objetivo de la presente tesis fue investigar acerca de las bases genéticas de la resistencia de alto nivel a trimetoprim en cepas hospitalarias de A. baumannii. Se evaluaron los niveles de resistencia a trimetoprim mediante la técnica de dilución seriada en agar, se investigó la presencia de genes que codifican para 8 enzimas DHFRs insusceptibles a trimetoprim descritas en bacterias Gram negativas de elevada resistencia a trimetoprim y la presencia de integrones clase 1 y clase 2 mediante la técnica de hibridación por colonia con oligonucleótidos específicos. Con el objetivo de corroborar los resultados obtenidos en las hibridaciones, se seleccionaron cepas al azar y mediante la 2 técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), se amplificó el gen dhfrIa y el de las integrasas clase 1 y clase 2 utilizando partidores específicos en cada caso. Para determinar si en las cepas que presentan ambos genes (dhfrIa e intI2) el gen dhfrIa se encontraba inserto en el integrón se seleccionaron 17 cepas al azar y se utilizó la técnica PCR con partidores IntI2F/dhfrAR. La mayoría de las cepas estudiadas (94 %) fue resistente a trimetoprim (CMI  32 µg/ml) y la mitad de ellas (56 %) presentó resistencia de alto nivel a este compuesto (1.024 µg/ml). En 64 cepas con resistencia de alto nivel a trimetoprim se investigó la presencia de 8 genes que codifican para enzimas DHFRs insusceptible a trimetoprim. Los genes detectados fueron dhfrIa, dhfrIb, dhfrIII, dhfrV, dhfrVI, dhfrVIII, dhfrX y dhfrXII. El 64,1 % (n=41) de las cepas estudiadas hibridó con la sonda para el gen dhfrIa, el 10,9 % hibridó con sondas para genes de otras DHFR y el 25 % de las cepas (n=16) no hibridó con ninguno de los oligonucleótidos. Las cepas estudiadas no hibridaron con las sondas para los genes dhfrIIIa, dhfrVIII y dhfrXII. De acuerdo a los resultados de los experimentos de hibridación con sondas específicas para integrón clase 1 y clase 2, 78,1 % de las cepas (n=64) presentó integron clase 2 y sólo 1,6 % (n=1) presentó integrón clase 1,en tanto, 20,3 % de las cepas no hibridó con ninguna de las sondas utilizadas en este trabajo para la detección de integrones. Un alto porcentaje (48, 4 %) presentó el gen para dhfrIa y el integrón clase 2; 20,3 % presentó sólo el gen dhfrIa y 28,1 % sólo el integron clase 2 y finalmente sólo 3,1 % de las cepas no presentó ninguno de los genes. El alto porcentaje de cepas que presentan el gen dhfrIa (64,1%) confirma que los altos niveles de resistencia a trimetoprim se debe, principalmente, a la síntesis de una dihidrofolato 3reductasa adicional insuceptible a trimetoprim, siendo éste uno de los mecanismos más frecuentemente descritos en otros bacilos Gram negativos. Por otra parte, en las cepaestudiadas mediante la técnica de PCR (con partidores IntI2F/dhfrAR), se encontró que en 90,9% (n=10) de ellas, el gen dhfrIa se encontraba inserto en el integrón clase 2, lo que sugiere que el gen dhfrIa podría encontrarse principalmente asociado a estructuras genéticas relacionadas al transposon Tn7, (integrón clase 2) integradas al cromosoma, y que de esta forma favorecen su diseminación. Finalmente, el conocimiento de los mecanismos de resistencia bacteriana y su diseminación es información fundamental, que permitirá conocer los factores que favorecen la aparición de cepas multiresistentes, problema que actualmente agrava e impide el tratamiento de las infecciones bacterianas, y el rol de estos microorganismos como un reservorio o vehículo de transmisión de genes de resistencia a agentes antibacterianos utilizados en el ambiente hospitalario.
Efecto de la proporción de metanogénicos y reductores de sulfato en la actividad de biopelículas que depuran efluentes proteicos ricos en sulfato.
(Universidad de Concepción., 2002) Alarcón Vivero, Manuel Rubén; Urrutia Briones, Homero
Debido a que las bacterias reductoras de sulfato (BRS) no pueden utilizar sustratos metilados, la utilización de biopelículas enriquecidas con Archaeas metanogénicas metilaminotróficas (APMm) se ha propuesto como estrategia para desplazar competitivamente a las BRS, que son particularmente activos en biopelículas que depuran efluentes ricos en sulfato (ej: Pesqueros). De allí que el estudio de la colonización de soportes por APMm es de relevancia para desarrollar biopelículas metanogénicas en condiciones reductoras de sulfato. Este trabajo está dirigido a conocer el efecto de la proporción de APMm versus bacterias reductoras de sulfato acetotróficas (BRSa), sobre la eficiencia degradativa de materia orgánica y la producción de metano de una biopelícula experimental. Para lo cual, se aislaron APMm y BRSa, desde lodos estabilizados en reactores semicontinuos, alimentados con vertidos pesqueros. Mediante análisis de rRNA 16S se verificó la pureza de cada cultivo. En anaerobiosis usando viales ámbar de 50 ml, se prepararon mezclas de APMm y BRSa en las siguientes proporciones de APMm/BRSa: 104/100; 103/100; 10/100; 10/100; 100/100; 100/101; 100/102; 100/103; 100/104, utilizando como fuente de carbono metilamina y acetato (0.6 % p/v final para ambos casos) en un medio de cultivo que emula un efluente pesquero. Se preparó la biopelícula incluyendo cerámica encada vial (10% del volumen final), e incubando por 10 días a 37º C en agitación constante de 150rpm. Posteriormente, se extrajo las células suspendidas dejando el sistema experimental solamente con la biopelícula sobre cerámica y medio de cultivo estéril. La proporción real APMm versus BRSa en las biopelículas experimentales obtenidas se determinó mediante los recuentos de APMm y BRSa adheridas por la técnica estándar del NMP. Al cabo de 10 días de incubación se determinó, para cada sistema experimental, la producción de metano y H2S, mediante cromatografía de gas. La concentración de materia orgánica se evaluó mediante la determinación del carbono orgánico total y la concentración de acetato, mediante cromatografía líquido-gas. Los resultados obtenido muestran que se obtuvo un consorcio APMm (morfotipos afines aMethanosarcina y a Methanotrix) y una cepa BRSa (morfotipo afín a Desulfobacter), la proporción en la biopelícula de 105 APMm : 100 BRSa presentó la mejor actividad degradativa (cercano al 40% del TOC inicial) y la mejor producción de metano (cercana al 80 % del biogas), sin registrar producción de H2S como sulfuro disuelto. La biopelícula formada por APMm : BRSa = 106: 1 alcanzó una mayor producción de metano (90% del biogas) y una mayor degradación de materia orgánica (80% TOC inicial), aunque presentó producción de sulfuro disuelto (0.7 ppm). En conclusión se define una relación APMm y BRSa en el rango entre 103- 104:100 para la inoculación en la formación de biopelículas como optimas para una mayor producción de metano, mayor actividad degradativa y menor actividad reductora sulfato en ambientes reductores de sulfato
Caracterización de la actividad histaminogénica de especies bacterianas provenientes de jurel (Trachurus symmetricus).
(Universidad de Concepción., 2003) Bermejo Pérez, Alina; Mondaca Jara, María Angélica; Martí, María Cristina
La histamina del pescado, denominada también escombrotoxina, es la causante de la mayoría de las intoxicaciones alimenticias por consumo de pescado en descomposición. Esta toxina comienza a formarse en el pescado debido a la acción de bacterias que degradan la histidina, presente en forma libre o formando parte de las proteínas musculares del pescado. El objetivo general del presente estudio fue determinar la actividad de histaminogénesis y caracterizar la flora bacteriana histaminogénica de jurel, Trachurus symmetricus, almacenado a tres temperaturas diferentes, 25, 15 y 5º C. Se realizaron cultivos de homogenizado de jurel con TSB-H (20 g/L de caldo tripticasa de soya, 2% de histidina) a 25, 15 y 5º C, donde se determinó la velocidad de crecimiento de la comunidad bacteriana midiendo densidad óptica a 620nm, y simultáneamente se determinó la concentración de histamina por HPLC. La velocidad de crecimiento máximo fue de 0.304, 0.2952 y 0.047 h-1 , a 25, 15 y 5º C, respectivamente. La producción de histamina de 3.61, 2.65 y 3.05 g/L a 25, 15 y 5º C, respectivamente. Paralelamente se determinó recuento de bacterias heterótrofas totales en agar tripticasa de soya suplementado con 2 % de histidina (AT-H), bacterias proteolíticas en medio caseinato de calcio y bacterias histaminogénicas en medio Niven a 25, 15 y 5º C, respectivamente. El grupo de las bacterias heterótrofas totales presentó recuentos máximos de 5.0x109 , 6.5x109 y 7.3x109 ufc/ mL a 25, 15 y 5º C, respectivamente. La comunidad bacteriana con propiedades proteolíticas alcanzaron recuentos y porcentaje con respecto a las heterótrofas de 5.5x106 (0.11 %), 2.8x107 (0.43 %) y 5.6x106 ufc/ mL (0.07 %), a 25, 15 y 5º C, respectivamente. Las bacterias histaminogénicas alcanzaron recuentos de 1.5x104 (0.0003 %), 8.3x106 (0.13 %) y 7.4x103 ufc/mL (0.0001 %) a 25, 15 y 5º C, respectivamente. Se seleccionaron para su identificación colonias proteolíticas e histaminogénicas aisladas de cada una de las temperaturas de ensayo utilizando el sistema API; además, se determinó la producción de histamina en cada una de las cepas bacterianas. A 25º C la especie con mayor frecuencia de aislamiento, correspondió a Proteus vulgaris (47.6 %). Desde el medio mantenido a 15º C la mayor frecuencia de aislamiento correspondió a la especie Aeromonas hydrophila (53.3 %). En el ensayo a 5º C, la mayor frecuencia de aislamiento correspondió a P. vulgaris (37.5 %) y Pseudomonas putida (37.5 %). La cepa con mayor capacidad de formación de histamina en el tratamiento a 25º C, fue P. damselae (611.19 µg/ Log (ufc/mL)). A 15º C, la cepa bacteriana con mayor producción de histamina correspondió a A. hydrophila (829.49 y 656.82 µg/ Log (ufc/mL)). Desde el medio mantenido a 5º C, la mayor capacidad histaminogénica se detectó con P. vulgaris (754.97 µg/ Log (ufc/mL). Para los ensayos de actividad histaminogénica en músculo de jurel, se mantuvieron ejemplares de jurel a 25, 15 y 5º C. Periódicamente se extrajo una muestra de músculo, se determinó el recuento de bacterias heterótrofas totales cultivables, proteolíticas e histaminogénicas, de la misma manera que en medio líquido. Simultáneamente se determinó histamina en el músculo. La velocidad de crecimiento máximo fue de 0.3456, 0.3090 y 0.0683 h-1 y los recuentos máximos de heterótrofas fue de 6.5x108 , 6.0x107 , y 1.7x107 ufc/ 0.1 g pescado a 25, 15 y 5º C, respectivamente. Por otra parte, se alcanzaron niveles similares de histamina en el músculo a las tres temperaturas ensayadas, pero el tiempo para alcanzar estas concentraciones fue mayor a menor temperatura (51, 85 y 275 horas a 25, 15 y 5º C, respectivamente). Luego la concentración de histamina comenzó a disminuir hasta llegar casi a cero. La comunidad bacteriana, presente en músculo, con capacidad proteolítica, presentó recuentos 10 veces mayores comparadas con las bacterias proteolíticas en homogenizado, a excepción de los ensayos realizados a 15º C que presentaron valores similares, 8.7x106 (2.12 %), 1.4x105 (0.23 %) y 6.0x105 (0.35 %) ufc/ 0.1g a 25, 15 y 5º C, respectivamente. Los recuentos de bacterias histaminogénicas fueron 300 veces superiores al de heterótrofas en medio homogenizado, a excepción de 15º C, 4.3x105 (0.10 %), 9.2x104 (0.15 %) y 1.0x105 (0.59 %) ufc/ 0.1g a 25, 15 y 5º C, respectivamente. Por lo tanto, el medio de cultivo tuvo una cierta acción restrictiva para este tipo de bacterias. Posteriormente se aislaron las colonias proteolíticas e histaminogénicas provenientes de ensayos realizados a cada temperatura y se procedió al igual que los aislamientos en homogenizado. En los ejemplares mantenidos a 25º C la mayor frecuencia de aislamiento, correspondió a las especies P. vulgaris (64.3 %). Desde los ejemplares mantenidos a 15º C la mayor frecuencia de aislamiento correspondió a las especies Pseudomonas sp. (20 %) y Klebsiella oxytoca (20 %). En los ensayos a 5º C la mayor frecuencia correspondió a A. hydrophila (26.7 %). Cabe destacar que en todas las temperaturas ensayadas se encontró una mayor riqueza de especies en los ejemplares de jurel, comprobando que el caldo restringió el crecimiento de algunas especies. Las cepas con mayor capacidad para formar histamina en el tratamiento a 25º C, correspondieron, al igual que en los ensayos en caldo, a P. damselae (287.23 µg/ Log (ufc/mL)); sin embargo, mostraron una menor capacidad individual para producir histamina. En el tratamiento a 15º C, la cepa que presentó una mayor producción de histamina correspondió a la especie K. oxytoca (380.35 µg/ Log (ufc/mL)) que, comparada con las actividades individuales encontrada en las cepas aisladas de caldo, son mucho menores. Desde los ejemplares mantenidos a 5º C, la mayor capacidad histaminogénica correspondió a Burkholderia cepacia (448.10 µg/ Log (ufc/mL)) la cual, al igual que en los ensayos anteriores, presentó una producción de histamina mucho menor que las cepas aisladas en el caldo. Con los resultados obtenidos se puede concluir que existe una comunidad bacteriana distinta a cada una de las temperaturas de almacenaje de los ejemplares de jurel, con velocidad de crecimiento, composición de especies y capacidad histaminogénica característica. Por lo tanto, la formación de histamina no sólo depende de la temperatura a la que se mantiene el pescado, sino que también de la carga bacteriana, las especies que forman esta comunidad y su capacidad individual de histaminogénesis.
Caracterización de Lactobacillus spp. aislados desde flujos vaginales y asociación con la flora microbiana vaginal.
(Universidad de Concepción., 2004) Castro Inostroza, Erica Eliana; Domínguez Yévenes, Maríana
La vagina representa una biota compleja compuesta por epitelios,substratos,enzimas,secreciones y microflora susceptible a cambios hormonales, enfermedades sistémicas, administración de fármacos, antibiosis microbiana y actividad sexual. La calidad, cantidad, potencial patogénico y densidad poblacional de la microflora vaginal depende de las diversas interacciones fisicoquímicas con los macro y micronutrientes aportados a este ambiente, del potencial de óxido reducción y del aporte de peróxido de hidrógeno y bacteriocinas proporcionado, principalmente, por Lactobacillus spp. Las especies bacterianas predominantes en la vagina están determinadas por características demográficas y microbiológicas de las mujeres estudiadas, observándose algunas asociaciones entre los hábitos dehigiene y sexuales con la calidad de los lactobacilos que colonizan el ambiente vaginal. A su vez, la adquisición de patógenos, tanto virales como bacterianos, puede estar facilitada por la depleción de estas bacterias lácticas en la biota vaginal. En esta investigación se evaluó la colonización de Lactobacillus spp. vaginales en mujeres de un área urbana de nuestro medio y se estudiaron algunas propiedades fenotípicas y probióticas de las cepas encontradas, las que se relacionaron con la flora microbiana vaginal y cervical aislada. Se incluyeron 104 mujeres, aparentemente sanas, seleccionadas al azar y con consentimiento informado. En cada una de ellas se obtuvo muestras para diagnóstico de Gardnerella vaginalis, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Mobiluncus spp., Candida spp. Mycoplasma spp. vaginosis bacteriana, Trichomonas vaginalis y Lactobacillus spp. Se emplearon técnicas estandarizadas para la determinación de las propiedades probióticas de hemaglutinación, hidrofobicidad, producción de peróxido de hidrógeno y auto agregación. Se obtuvo una baja frecuencia de mujeres colonizadas con Lactobacillus spp. en el ambiente vaginal (35/104). Según la identificación de los microorganismos por pruebas bioquímicas, 38.9% de las cepas correspondieron a lactobacilos homofermentativos obligados (HOO) y una proporción prácticamente similar (47.2%), a heterofermentativos facultativos (HF). Las cepas HOO fueron aisladas con mayor frecuencia de flujos vaginales conestadío de Nugent normal (11/14) y las de HF, de flujos con vaginosis bacteriana (10/17). En las mujeres colonizadas con Lactobacillus spp. se obtuvo menor frecuencia de aislamiento de bacterias asociadas a vaginosis bacteriana y a endocervicitis. Las portadoras de vaginosis bacteriana estuvieron colonizadas con Lactobacillus spp. vaginales con escasas propiedades de producción de peróxido de hidrógeno, hemaglutinación y autoagregación. L. crispatus fue la especie dominante en los estadíos de Nugent normales y en estas cepas se encontraron propiedades probióticas significativamente mejores. L. rhamnosus se asoció a vaginosis bacteriana, su colonización estuvo favorecida por la promiscuidad sexual y clínicamente se asoció a la presencia de una reacción cervical inflamatoria. Las variables demográficas: empleo de anticoncepción, baja escolaridad de la mujer y el antecedente de parejas con actividades laborales no calificadas, se asociaron significativamente a la depleción de Lactobacillus spp. vaginales. El uso de metronidazol sistémico y/o vaginal, fue un antecedente de la historia clínica asociado a ausencia de Lactobacillus spp. vaginales. En mujeres que refirieron el antecedente de promiscuidad se obtuvo menor frecuencia de colonización por Lactobacillus spp. en la biota vaginal. La depleción de Lactobacillusspp. vaginales parece ser un fenómeno frecuente en las usuarias de los centros de salud de nuestro medio, lo que hace necesario la implementación de estrategias que favorezcan tanto la prevención de esta depleción, así como el repoblamiento de la flora indígena en las mujeres de las áreas geográficas investigadas, quienes estarían altamente expuestas a adquirir otras infecciones de transmisión sexual tanto microbianas como virales, así como de ser afectadas por importantes secuelas y repercusiones en su salud reproductiva
Caracterización de biosensores bacterianos para la detección de compuestos organoclorados en efluentes de pulpa kraft.
(Universidad de Concepción., 2004) Campos Araneda, Victor Leandro; Zaror Zaror, Claudio; Mondaca Jara, María Angélica
Existe un consenso de que los principales contaminantes, de mayor impacto ambiental, se generan en los procesos de blanqueo de pulpa kraft. La U.S. Environmental Protection Agency (EPA), publicó recientemente las proposiciones de normas para regularizar las emisiones de compuestos organoclorados. Debido a esto se hace necesario contar con técnicas que permitan detectar en forma eficiente compuestos contaminantes en los efluentes, debido a que los métodos químicos frecuentemente utilizados son muy complejos y de alto costo operacional. Los biosensores bacterianos surgen como una técnica potencial, por su simplicidad, rapidez y bajo costo, para la detección de contaminantes organoclorados. La capacidad de detectar compuestos fenólicos y derivados clorados por las cepas mutantes DmpR B9, B23 y B24 fue estudiada mediante ensayos líquidos de - galactosidasa. La actividad -galactosidasa es proporcional a la transcripción de la fusión Pdmp-lacZ de las cepas mutantes DmpR, en presencia de compuestos fenólicos y derivados clorados. Los ensayos fueron realizados testeando la lista de contaminantes fenólicos prioritarios descrito por la EPA (1998). Se demostró que los 9 compuestos fenólicos clorados ensayados fueron capaces de inducir respuesta por parte de los tres biosensores bacterianos. Las cepas mutantes DmpR presentan las más altas respuestas en presencia de fenol y de compuestos fenólicos mono-clorados, así observándose una baja inducción por parte de 3- cloro-4-metilfenol; 2,4-dimetilfenol; 2,4,6-triclorofenol y 2,4,5-triclorofenol. Entre los compuestos tóxicos prioritarios no detectados por las cepas mutantes DmpR se encuentra el 2-metil-4,6-dinitrofenol. A concentraciones sobre 75 M del 2,4,6- triclorofenol y 50 M de pentaclorofenol, producen lisis celular. Los ensayos realizados con 2,4-dinitrofenol demostraron una inducción variable de la fusión Pdmp-lacZ. Ensayos con tolueno, Xileno, Benceno, 2-nitrotolueno, 2,4-D y 2,4,6- TBF, no indujeron respuesta por parte de las cepas mutantes. La cinética de inducción de las cepas mutantes en presencia de mezclas de compuestos fenólicos sustituidos demostró una respuesta lineal hasta 75 M, no se observó inhibición en la respuesta cuando las cepas mutantes DmpR fueron ncubadas en mezclas de compuestos fenólicos y derivados clorados con tolueno, benceno y xileno, en cambio en presencia de 2,4,6-Tribromofenol y 2,4-D a concentraciones sobre 75 M se observan respuestas variables de las tres cepas mutantes. Los resultados demostraron que las cepas mutantes DmpR presentan un crecimiento estable en los efluentes de pulpa kraft estudiados; además fueron capaces de detectar la presencia de compuestos fenólicos sustituidos. Se detectó una mayor concentración de compuestos organoclorados en el efluente con índice kappa mayor. La caracterización de los efluentes por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) no arrojó resultados satisfactorios, esto se debe principalmente a la gran cantidad de compuestos que son generados durante el blanqueo de la pulpa kraft. Existen muchos reportes sobre la construcción de biosensores bacterianos, pero existen pocos los trabajos que demuestra la capacidad de detectar compuestos químicos en muestras ambientales. En este estudio se demostró la capacidad de tres cepas mutantes DmpR, B9, B23 y B24, basada en la activación de la fusión Pdmp-lacZ, para la detección de fenol y derivados clorados en efluentes de pulpa kraft. Los biosensores bacterianos presentan una alta sensibilidad y esto permite utilizarlos como una alternativa a los análisis químicos comúnmente empleados para compuestos orgánicos. Otro aspecto importante es destacar su bajo costo, rapidez y adaptabilidad a análisis de campo o para monitoreos “in situ”
ß-lactamasas de espectro extendido presentes en cepas hospitalarias y extrahospitalarias de Klebsiella pneumoniae.
(Universidad de Concepción., 2004) Trabal Fernández, Natalia; Bello Toledo, Helia Magaly
Actualmente, en la especie bacteriana Klebsiella pneumoniae, se reconocen tres subespecies íntimamente relacionadas: pneumoniae, ozanae y rhinoscleromatis, consideradas patógenos oportunistas de significación clínica, cuya incidencia como causantes de enfermedades infecciosas se ha incrementado en las últimas dos décadas. Este incremento se debe, principalmente, a la expresión de -lactamasas de espectro extendido (LEEs), enzimas que confieren a dicha bacteria la capacidad de resistir la acción de cefalosporinas de tercera generación (C3G), como cefotaxima y ceftazidima, además, de monobactámicos como el aztreonam. Actualmente se considera a K. pneumoniae como uno de los principales microorganismos productores de LEEs derivadas de las familias TEM, SHV, y enzimas emergentes como CTX-M, PER y OXA. Además, constituye uno de los principales reservorios de genes que codifican resistencia a un amplio rango de antibióticos como -lactámicos, aminoglicósidos, cloranfenicol y tetraciclina, que tienen la capacidad de ser transferidos a otros grupos bacterianos. La emergencia y diseminación de cepas productoras de este tipo de enzimas constituye un serio problema en el tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por este microorganismo, lo que, en gran medida, explica la alta incidencia de brotes epidémicos causados por cepas de K. pneumoniae a lo largo de todo el mundo, en los últimos diez años. Considerando la importancia de K. pneumoniae como causante de serias enfermedades infecciosas en Chile, la alta incidencia de aislamientos de cepas resistentes a C3G por producción de LEEs en el ambiente hospitalario y el desconocimiento que existe, a nivel mundial, de la frecuencia y tipo de -lactamasas en el ambiente extrahospitalario, el objetivo general de este trabajo fue determinar la presencia y tipo de LEEs en subespecies de K. pneumoniae de origen hospitalario y no hospitalario. Se identificaron 102 cepas hospitalarias y 51 extrahospitalarias aisladas en ciudades del centro y sur de Chile en los años 1998, 2002 y 2003. A estas cepas, se les determinó los patrones y niveles de resistencia a diferentes antibióticos -lactámicos (NCCLS, 2002). La presencia de LEEs se estudió mediante test screening y test confirmatorio siguiendo las recomendaciones del NCCLS (2002). La genotipificación de las cepas productoras de LEEs se realizó por ii electroforesis de campo pulsado y RFLP con XbaI. Los genes que codifican para las diferentes -lactamasas se detectaron a través de PCR. En las cepas hospitalarias y extrahospitalarias, un 92 % y 90 %, respectivamente, correspondió a la subespecie pneumoniae, las subespecies rhinoscleromatis y ozaenae fueron muy poco frecuentes. Las principales fuentes de aislamiento fueron orina, secreción bronquial y heridas. El 83 % de las cepas hospitalarias fue resistente a ampicilina; en cambio, la resistencia a cefalosporinas fue menor: 39,4 % a cefalotina, 27,7 % a cefuroxima y aproximadamente, un 23 % a cefpodoxima, cefotaxima y ceftazidima. No se aislaron cepas resistentes a imipenem. Los niveles más altos de resistencia fueron encontrados en las cepas de la subespecie pneumoniae. Las cepas hospitalarias de K. pneumoniae presentaron una frecuencia de síntesis de βLEEs del 24,5 %. La mayoría de esas cepas fueron resistentes al menos a una de las C3G. No obstante, se encontraron tres cepas que fueron susceptibles a dichos antibacterianos. Se encontraron 4 cepas de K. pneumoniae de origen extrahospitalario que sintetizan βLEEs. La mayoría de las cepas, tanto hospitalarias como extrahospitalarias, que presentaron βLEEs, pertenecen a aislamientos genéticamente diferentes. Mediante PCR e IEF, se detectaron βLEEs de los grupos: TEM, PER, SHV, CTX-M y GES en las cepas de origen nosocomial, mientras que los grupos: TEM y CTX-M, fueron detectados en las cepas de origen extrahospitalario. Las enzimas del tipo TEM y PER-2 fueron las encontradas con mayor frecuencia en las cepas hospitalarias de K. pneumoniae, las frecuencias fueron de 20/23 y 12/13, respectivamente. De las 23 cepas analizadas, 11 presentaron enzimas tipo SHV de espectro extendido y 7 presentaron β-lactamasas de la familia CTX-M. Una cepa hospitalaria de K. pneumoniae amplificó positivamente para el gen blaGES.. En las cepas de la comunidad, se encontraron enzimas del tipo TEM de espectro extendido, SHV-1 y CTX-M. Las cepas hospitalarias de K. pneumoniae presentan patrones enzimáticos compuestos al menos por dos βLEEs y algunas de ellas incluso, poseen patrones compuestos por 4 enzimas de este tipo. Se encontró, además, una cepa de origen hospitalario resistente a cefoxitina y que presenta el gen blaAmpC. En general, de los resultados obtenidos, se concluye que la subespecie pneumoniae fue predominante tanto en los hospitales como fuera de ellos. Por otra parte, las cepas de las tres subespecies de origen hospitalario presentan bajas frecuencias de resistencia frente a C3G, siendo las cepas de la comunidad mayoritariamente susceptibles. La producción de LEEs es una propiedad observada, principalmente, en las cepas hospitalarias, alcanzando frecuencias, claramente inferiores, a la informada para América del Sur. El hallazgo de cuatro cepas extrahospitalarias productoras de LEEs constituye un hecho importante, en la diseminación de este tipo de enzimas entre cepas aisladas de la comunidad. La resistencia presente en las cepas de K. pneumoniae intra y extra hospitalarias frente a las cefalosporinas de tercera generación y cuarta generación, está basada en la síntesis de un complejo enzimático constituido, generalmente, por más de un tipo de βLEEs. Los genes que codifican para LEEs en K. pneumoniae parecen ser diseminados horizontalmente, ya que las cepas constituyen aislamientos genéticamente diferentes.
Caracterización cinética de agmatinasa de escherichia coli y mutante N130DS137C de arginasa recombinante de hígado humano con actividad agmatinasa.
(Universidad de Concepción., 2005) Enríquez Vera, Paula Fabiola; Carvajal Baeza, Nelson
La arginasa (EC 3.5.3.1) y la agmatinasa (EC 3.5.3.11) catalizan reacciones de hidrólisis de un sustrato guanidínico y generar urea como uno de los productos. Aparte de las homologías estructurales entre sus sustratos (la agmatina resulta de la descarboxilación de la arginina por la arginina descarboxilasa), las secuencias aminoacídicas de estas enzimas presentan un alto grado de homología, lo que ha llevado a incluirlas en la llamada “familia de las arginasas”, considerándose que habrían divergido a partir de un origen evolutivo común para alcanzar cada una de ellas su particular especificidad de sustrato. Hasta el momento, se dispone de una gran cantidad de información en relación con la arginasa de distintos organismos y tejidos. Más aún, se dispone de la estructura tridimensional de las isoformas de arginasa de mamífero y de la enzima de Bacillus caldovelox. Por el contrario, la información referente a la agmatinasa es muy reducida y sólo en los últimos años se ha logrado demostrar el requerimiento de iones metálicos y se ha iniciado la identificación de residuos de su sitio activo. Además, se ha resuelto la estructura cristalina de la agmatinasa de Deinococcus radiodurans y, en nuestro laboratorio, hemos desarrollado un modelo estructural para la enzima de Escherichia coli. El análisis de las secuencias aminoacídicas revela la presencia de residuos altamente conservados en los miembros de la familia de las arginasas y sus estructuras muestran también un alto grado de homología. Entre los residuos conservados se destacan algunos que participarían en la interacción de estas enzimas con su respectivo sustrato y el ión metálico.
Transferencia de resistencia a antibióticos B-lactámicos desde cepas de klebsiella pneumoniae a otros bacilos gram negativos de origen hospitalario.
(Universidad de Concepción., 2005) Sánchez Urra, Magaly; Bello Toledo, Helia Magaly
Klebsiella pneumoniae ocupa el primer lugar entre los bacilos Gram negativos fermentadores multiresistentes aislados de infecciones hospitalarias en nuestro país. Ha sido, desde hace dos décadas, uno de los principales reservorios de genes que codifican -lactamasas derivadas de enzimas TEM y SHV, y en otros países de la región, de las enzimas CTX-M que, principalmente, le otorgan resistencia a cefalosporinas de tercera generación (C3G). Además, Klebsiella es un buen receptor de plásmidos de resistencia, por lo que este microorganismo parece contribuir a la diseminación de genes de resistencia. En esta tesis se evaluó la transferencia de resistencia a C3G y aztreonam mediante ensayos de conjugación, utilizando 30 cepas de K. pneumoniae de origen hospitalario como cepas dadoras y Escherichia coli K-12 (UC132) y 5 cepas de bacilos Gram negativos de familia Enterobacteriácea, aislados de muestras clínicas, como receptoras. Las cepas de bacilos Gram negativos empleados fueron: Citrobacter freundii (Cf1), Salmonella typhimurium (Sal21), Salmonella enteritidis (Sal53), Serratia marcescens (S25) y Escherichia coli (Ec151). Las 30 cepas de K. pneumoniae seleccionadas correspondieron a cepas aisladas entre los años 1997 y 2001 en distintos centros hospitalarios del país y desde diversas muestras clínicas. Un 50% de ellas provenía de muestras de tracto respiratorio (secreción bronquial y traqueal) y de orina. Además, presentaron la condición de resistencia a alguna C3G (cefotaxima, ceftazidima, cefoperazona, ceftriaxona) y aztreonam y ser productoras de -lactamasas de espectro extendido (BLEE). Para evaluar la trasferencia de resistencia a los antibióticos -lactámicos, en las cepas transconjugantes se determinó la concentración mínima inhibitoria (CMI) de C3G y aztreonam, la producción de BLEE y la presencia de genes que codifican para -lactamasas TEM, SHV y CTX-M.En los ensayos de transferencia de resistencia entre las cepas de K. pneumoniae y E. coli K-12, se obtuvo transferencia con 53.3% (16/30) de las cepas mediante conjugación en medio líquido. En las 14 cepas en que no se detectó transferencia se realizó conjugación en medio sólido y sólo en una cepa se detectó transferencia 2por este método. La mayor parte de las cepas transconjugantes adquirió resistencia a C3G y aztreonam, con un perfil de resistencia idéntico al de la correspondiente cepa dadora. Además, todas las transconjugantes fueron productoras de, al menos, una BLEE. En las 17 cepas de K. pneumoniae que conjugaron con E. coli K-12 se investigó la presencia de genes que codifican para enzimas de las familias TEM, SHV y CTX M, encontrándos simultáneamente los genes blaTEM y blaSHV en 76% (13/17) de las cepas y los genes blaTEM, blaSHV y blaCTX-M en 3 cepas. Los genes blaTEM y blaCTX-M fueron detectados en todas las transconjugantes al emplear E. coli K-12 como receptora, en cambio, en 5 de las transconjugantes no se detectó el gen blaSHV. Posteriormente, se seleccionó 5 de estas 17 cepas de K. pneumoniae para efectuar estudios de conjugación con cepas de bacilos Gram negativos aislados de muestras clínicas. Dos cepas portaban los genes blaTEM, blaSHV y blaCTX-M y 3 cepas los genes blaTEM y blaSHV. En todos los casos se detectó transferencia de resistencia a C3G y aztreonam y producción de BLEE en las cepastransconjugantes. Las cepas dadoras que portaban los 3 tipos de genes transfirieron sólo los genes blaTEM y blaCTX-M, en cambio las cepas dadoras que llevaban los genes blaTEM y blaSHV transfirieron ambos genes. Los resultados permiten confirmar la hipótesis de esta tesis, que plantea que cepas de K. pneumoniae de origen hospitalario productoras de -lactamasas codificadas por genes plasmídicos son capaces de transferir la resistencia a C3G y aztreonam a otros bacilos Gram negativos de origen hospitalario.
Bombas de eflujo de antibacterianos en cepas de bacilos Gram negativos aislados de hospitales y su relación con la resistencia a quinilonas.
(Universidad de Concepción., 2006) Ibáñez Cabrera, Daniel Mauricio; Domínguez Yévenes, Maríana
Las quinolonas son un grupo de agentes antibacterianos que ha sido utilizado en el tratamiento de infecciones, tanto hospitalarias como de la comunidad. Este grupo de agentes antibacterianos posee como blanco de acción dos enzimas involucradas en la replicación del ADN: ADN girasa y topoisomerasa IV. La interacción de las quinolonas con el complejo formado por el ADN y una de estas enzimas causa la inhibición de la síntesis del ADN bacteriano y, por tanto, la muerte bacteriana. El uso extensivo de estos agentes antibacterianos ha conducido a la selección de cepas bacterianas resistentes. El principal mecanismo de resistencia está dado por la mutación de los genes que codifican para ADN girasa y topoisomerasa IV, ocurriendo estas mutaciones en una zona llamada “quinolone resistance determining region” (QRDR). Otro mecanismo de resistencia es la disminución de la concentración intracelular del antibiótico debido a sistemas de bombas de eflujo los que expulsan el antibiótico al exterior de la célula. En bacilos Gram negativos se ha descrito distintas familias de bombas de eflujo, siendo la superfamilia RND la principal familia involucrada en la expulsión activa de los antibióticos. En esta familia dos sistemas han sido bien caracterizados: Mex en Pseudomonas aeruginosa y Acr en Escherichia coli y otras enterobacterias, los cuales no sólo proporcionan resistencia a quinolonas sino también a otros agentes antibacterianos, otorgando multiresistencia a la bacteria. En esta tesis se estudiaron 100 cepas de bacilos Gram negativos resistentes a quinolonas de primera, segunda o tercera generación y 50 cepas de bacilos Gram negativos susceptibles a quinolonas. Las cepas fueron aisladas, entre los años 1998-2004, de muestras clínicas en diversos hospitales de Chile. Se determinaron los patrones y niveles de resistencia mediante los métodos de difusión en agar y dilución seriada en agar, respectivamente. La participación de bombas de eflujo se detectó mediante la determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) en presencia y ausencia del inhibidor de bombas de eflujo MC 207,110. Los genes estructurales de algunas bombas de eflujo se detectaron empleando la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los resultados mostraron que la gran mayoría de las cepas (89%) presentó resistencia a todas las quinolonas ensayadas, además un alto porcentaje presentaba resistencia a antibióticos aminoglucósidos y β-lactámicos. Los mayores niveles de resistencia se manifestaron frente a ácido nalidíxico, aunque frente a ciprofloxacino los niveles de resistencia de las cepas de bacilos Gram negativos fermentadores y no fermentadores también fueron elevados, con CMI90 de 128 μg/ml y 256 μg/ml, respectivamente. Para levofloxacina y moxifloxacina se manifestaron niveles de resistencia inferiores con CMI90 de 64 y >64 μg/ml, respectivamente. En todos los casos, las CMI sobre los bacilos Gram negativos no fermentadores, fueron levemente mayores que las observadas sobre bacilos Gram negativos fermentadores. Al determinar la participación de las bombas de eflujo en la resistencia a quinolonas, se observó que en 83% y 95% de las cepas de Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae, respectivamente, las bombas expulsan quinolonas, siendo levofloxacina y moxifloxacina las principales fluoroquinolonas expulsadas. En las cepas de Pseudomonas aeruginosa se encontró que en 75% de las cepas las bombas expulsaron las fluoroquinolonas ensayadas, en cambio, en un bajo porcentaje (23%) de las cepas de Acinetobacter baumannii se evidenció expulsión de quinolonas. En cepas susceptibles, se observó la expulsión de todas las quinolonas ensayadas, sin embargo, la frecuencia de 3 cepas que expulsan quinolonas fue menor que el observado en las cepas resistentes. En un bajo porcentaje de las cepas de las distintas especies ensayadas se evidenció la participación de bombas de eflujo en la resistencia a los antibióticos aminoglucósidos y β lactámicos. Al investigar los genes que codifican proteínas estructurales de las bombas de eflujo se detectó la presencia del gen acrA en 89% de las cepas de K. pneumoniae resistentes a quinolonas y en 57% de las cepas susceptibles. En E. coli se detectó la presencia del gen acrB en 83% de las cepas resistentes y en 100% de las cepas susceptibles a quinolonas. En P. aeruginosa se detectó el gen mexA en 84% de las cepas resistentes y en 93% de las cepas susceptibles y, además, se encontró el gen mexX en 74% y 86% de las cepas resistentes y susceptibles, respectivamente. Por otra parte, en A. baumannii el gen adeB se detectó en todas las cepas ensayadas. Estos resultados nos indican que los sistemas de eflujo activo en bacilos Gram negativos tienen una importante participación en la resistencia a quinolonas. Además, también actuarían, aunque en menor frecuencia, en cepas susceptibles, ya que al ser inhibidos aumenta la susceptibilidad hacia estos agentes antibacterianos. Sin embargo, los sistemas de eflujo investigados no tienen una participación relevante en la resistencia a otros grupos de agentes antibacterianos, específicamente antibióticos β-lactámicos y aminoglucósidos, donde la modificación enzimática sería el principal mecanismo de resistencia para estos antibióticos. Sin embargo, la presencia, en forma conjunta, de distintos mecanismos de resistencia ayudaría a otorgar niveles de resistencia más elevados, contribuyendo al fenotipo de multiresistencia de las cepas bacterianas.
Incorporación heterotrófica de leucina por arquea en la columna de agua de la plataforma continental de Concepción.
(Universidad de Concepción., 2006) Levipán Colil, Héctor Armando; Quiñones Bergeret, Renato
Los últimos avances en el campo de la ecología microbiana han revelado que las arqueas planctónicas representan unos de los microorganismos unicelulares más abundantes de los océanos. Sin embargo, a pesar de la abundancia numérica de este grupo en los ecosistemas marinos su rol biogeoquímico continua siendo desconocido. La imposibilidad, a la fecha, de discriminar los procesos metabólicos de Arquea del resto de los microorganismos in situ dentro de una comunidad procarionte ha dificultado la estimación de procesos clave tales como la producción secundaria de Arquea (PSA). Por lo tanto, el objetivo central de esta Tesis fue estimar la importancia de las arqueas heterótrofas planctónicas en el ciclo del carbono frente a la zona centro-sur de Chile, con énfasis en la estimación empírica de la PSA y en el flujo potencial de carbono mediante la vía metanogénica. Muestras de agua de mar de diferentes profundidades fueron obtenidas directamente desde el área de estudio (i.e., 36º30’ S – 73º07’ W and 36º20’ S 73º44’ W) y destinadas a diferentes tipos de análisis: (1) caracterización de variables fisico químicas de la columna de agua, (2) cuantificación de la abundancia celular procarionte y análisis de la composición taxonómica en la columna de agua mediante hibridación por dot blot cuantitativo de ARNr, (3) determinación de la producción procarionte total (PPT) y la PSA en la zona de mínimo de oxígeno (ZMO, profundidad = 80 m) mediante el uso del inhibidor de la Hipusinación N1-guanil-1,7-diaminoheptano (GC7) e incorporación de leucina-C14, (4) determinación de los principales morfotipos y biovolúmenes celulares en la ZMO mediante Microscopía Electrónica de Barrido, y (5) evaluación del potencial metanogénico (método de desplazamiento de líquido) asociado a arqueas productoras de metano (APM) presentes en la columna de agua de la ZMO a 80 metros de profundidad. Se encontró que Arquea representó un grupo importante en la comunidad procarionte en la zona de estudio con aportes que oscilaron entre 6-86 % de la abundancia procarionte total. La abundancia de Arquea fue habitualmente mayor en la parte más profunda de la columna de agua y disminuyendo hacia la superficie, hasta valores normalmente comprendidos entre 10-40 % de la abundancia procarionte total. En la estación oceanográfica más costera y somera (E-18, 36º30’ S – 73º07’ O), se sugiere que los incrementos de este grupo hacia la superficie fueron principalmente debido a un efecto mecánico de transporte de estas desde el fondo y desde la capa de agua sub-óxica inmediatamente adyacente a este con origen en las AESS (i.e.,sedimento más ‘Benthic Boundary Layer’ [BBL]), haciendo menos probable un aumento de la población de arqueas in situ en la columna de agua superficial producto de la actividad metabólica. Este transporte ocurrió mediante surgencia o mezcla turbulenta; no obstante, no se observó una asociación estricta de estos eventos a una mayor presencia de arqueas en la columna de agua ni un patrón estacional. Crenarquea fue el grupo arqueano dominante en la columna de agua del área de estudio. Parte de la variabilidad de arqueas totales (19 %) y crenarqueas (~18 %) podrían estar asociadas con la concentración de amonio mediante una correlación positiva, mientras que la abundancia de Euriarquea no fue asociada a ninguna de las variables ambientales analizadas. No obstante, un 29 % y un 26% de la variabilidad en la abundancia de metanogénicos viiiplanctónicos fue asociada negativamente con la concentración nitrato y de temperatura, respectivamente. Por otra parte, en esta Tesis se propone un método rápido y sencillo para estimar la PSA usando el inhibidor de la hipusinación GC7. Este inhibe específicamente la síntesis de proteínas de arqueas de tal modo que la leucina incorporada por bacterias puede ser directamente determinada. De esta manera, la incorporación arqueana de leucina es calculada por la diferencia entre la incorporación total de leucina debida a la comunidad procarionte y la incorporación bacteriana de leucina. Previo a los experimentos en el terreno, el GC7 fue probado como inhibidor de dos comunidades naturales de APM: (i) una comunidad enriquecida desde la ZMO (a 80 m) y (ii) otra aislada desde sedimentos de la marisma Rocuant. En ambas comunidades, la respuesta frente al fármaco fue medida por su efecto sobre la producción de metano y el recuento DAPI. Se determinó que una concentración de 200 M de GC7 inhibió eficientemente la metanogénesis. Además, una fuerte correlación (r = 0.82, p = 0.0004) fue encontrada entre la concentración de ARNr arqueano y las medidas de PSA obtenidas por este método. El error estándar asociado al uso del GC7 como inhibidor fue de 8.8 %, y de acuerdo a lo esperado, este antibiótico no mostró efecto inhibitorio sobre el crecimiento o la incorporación de leucina en diferentes cepas bacterianas. De este modo, se encontró que la PSA fue parte importante de la producción secundaria mostrada por la comunidad procarionte en la ZMO llegando a representar, en determinados periodos, cerca del 97 % de la PPT. Sin embargo, la PSA osciló desde niveles no detectables hasta un máximo ~300 g C m-3h-1sin mostrar una clara tendencia estacional. Además, las arqueas mostraron tasas de crecimiento específico comúnmente inferiores a las tasas de crecimiento bacterianas (e.g. < a 0.3 d-1). Las medidas de PPT no estuvieron asociadas a las ixconcentraciones de ARNr determinadas para bacterias pero si para arqueas totales (r=0.84, p = 0.0001). No obstante, cuando la comunidad procarionte era eficiente en la utilización del sustrato radiomarcado, la PPT estuvo correlacionada sólo a la concentración de ARNr bacteriano (r = 0.79, p = 0.05). Además, correlaciones significativas fueron encontradas entre la concentración de ARNr bacteriano y (a) la temperatura o (b) la clorofila-a. En consecuencia, los datos siguieren que: (i) Arquea representa una importante fracción del bacterioplancton marino en términos de abundancia en el área centro-sur de Chile, sobre todo, en la zona de mínimo de oxígeno (i.e. ~86 %), y (ii) también un componente importante de la producción secundaria procarionte de la ZMO, presentando importantes incrementos de actividad aunque a nivel de pulsos temporales.También se reporta la distribución y abundancia de APM en la columna de agua, y su actividad potencial a 80 m de profundidad (ZMO). Los metanogénicos fueron detectados en el ambiente planctónico esencialmente durante periodo de surgencia activa (Primavera-verano) representando ~9 % del ARNr procarionte total en la ZMO. Se presenta evidencia de APM viables en pequeños volúmenes de agua de mar sin concentrar, y no asociados a grandes partículas de agregados orgánicos. Estas fueron capaces de producir metano utilizando sustratos no competitivos, i.e., metilamina y metanol. Además, a 12 o 30 °C, la producción de metano fue completamente inhibida por adición de GC7. La producción potencial de metano ocurriría esencialmente hacia fines de Invierno y principios de Primavera siendo la máxima producción a 12 °C igual a 0.1 pmoles CH4 cél.-1d-1. A 30 °C la producción potencial fue siempre mayor. Se encontró que la concentración de nitrato y la temperatura pueden ser importantes elementos reguladores de la abundancia de APM en el ambiente planctónico marino. Finalmente, los resultados sugieren que: (i) las APM en la columna de agua provendrían principalmente desde el sedimento, y (ii) una importante fracción de estas correspondería a variedades sicrofílicas no metilo tróficas aún no cultivables Palabras Claves: Ciclo del carbono • Producción secundaria • Eficiencia de crecimiento procarionte • Arquea planctónica • Hipusinación • Hipoxia • Metanogénesis • Surgencia • Sistema de Corrientes de Humboldt.
El receptor clásico de 1a,25(OH)2D3 es necesario para inducir la respuesta no genómica de aumento de calcio intracelular en células osteoblásticas.
(Universidad de Concepción., 2006) Bravo Muñoz, Soraya Andrea; Montecino Leonard, Martín Alejandro
Los efectos no genómicos de las hormonas esteroidales han sido recientemente establecidos, sin embargo, los mecanismos que desencadenan este tipo de respuesta no están claros. Se ha propuesto que los efectos rápidos no genómicos de 1α,25 dihidroxi vitamina D3 (1α,25 (OH)2D3) se inician en la membrana plasmática y tardan entre segundos y minutos en ocurrir. Estas acciones se caracterizan por su corta latencia, por ser insensibles a inhibidores de ARN y síntesis proteica y pueden ser mediadas por un receptor. Se ha propuesto la existencia de un receptor para 1α,25 (OH)2D3 distinto del receptor nuclear clásico. En células osteoblásticas, debido a la importancia que adquiere la regulación del flujo de calcio bajo la acción hormonal, se ha estudiado ampliamente esta respuesta no genómica, habiéndose establecido que este tipo celular es capaz de responder rápidamente a concentraciones fisiológicas de la hormona, aumentando la concentración intracelular de calcio. En el presente trabajo se demuestra que el receptor clásico nuclear de 1α,25 (OH)2D3 es necesario para producir un aumento en el nivel de calcio intracelular en células osteoblásticas.

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