Evaluación de las propiedades funcionales y bioquímicas de los residuos KK385-386 del receptor de glicina α 1 en la modulación por etanol en el sistema nervioso central de ratones transgénicos.
Loading...
Date
2016
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Universidad de Concepción.
Abstract
Estudios previos en nuestro laboratorio han demostrado que la corriente de cloruro (Cl-) activada por glicina puede ser potenciada por concentraciones bajas y clínicamente relevantes de etanol. Además, se ha demostrado la modulación intracelular mediada por el dímero GβУ de la proteína G sobre el Receptor de Glicina (R-Gli) α1, mediante la interacción con los aminoácidos básicos (316-320 y 385/386) localizados en el loop intracelular TM3-TM4. R-Gli α1 mutado en los residuos 316-320 y 385-386, son resistentes a la modulación del dímero GβУ y también insensibles a los efectos de etanol. Además, datos recientes han demostrado que R-Gli sería importante en el sistema de recompensa del cerebro (Área Tegmental Ventral; VTA, Corteza prefrontal; PFC y núcleo accumbens; nAc). Es por ello, que se ha generado un ratón Knock-In (KI) para R-Gli α1, el cual posee mutaciones KK385-386AA, generándose un animal KI KK385/386AA. En esta tesis, evaluamos las propiedades de los receptores expresados in situ en neuronas de animales WT y KI de regiones involucradas con el sistema mesolímbico dopaminérgico (nAc, PFC y VTA). Primero, caracterizamos bioquímicamente (PCR, western blot e inmunocitoquímica) la presencia de mRNA y proteínas pre y post sinápticas importantes para el balance excitatorio-inhibitorio. Encontramos, que no existen grandes diferencias en la expresión de proteínas en regiones del sistema nervioso central (SNC) de WT y KI, sólo se muestra un incremento en las proteínas pre sinápticas GAD67 y vGLUT en el cerebelo del ratón KI, que están relacionadas con la síntesis de GABA y transporte de glutamato, respectivamente.
Luego, a través de estudios electrofisiológicos en neuronas disociadas de nAc, evaluamos y comparamos funcionalmente la modulación por etanol entre neuronas de ratones WT y KI en nAc. Encontramos que las neuronas accumbales KI son menos sensibles a los efectos de etanol mediados por GβУ . Además, utilizando el animal D1-GFP, comparamos la sensibilidad a etanol entre Medium Spiny Neurons (MSNs) D1+ y D1-, encontrando que las MSNs D1+, son sensibles a bajas concentraciones de etanol (1, 5 y 10 mM), mientras que las D1-, son sensibles a altas concentraciones (50, 100 mM). Posteriormente, utilizando rebanadas de nAc, determinamos la presencia de R-Gli no-sinápticos y sinápticos que median corrientes tónicas y fásicas, respectivamente. Encontramos, que MSNs poseen corrientes tónicas y fásicas, siendo sólo las primeras sensibles a bajas concentraciones de etanol, mientras que las segundas son insensibles. Sugiriendo que R-Gli no-sinápticos sensibles a etanol, estarían participando en el balance excitatorio-inhibitorio del nAc, debido a que etanol disminuyen los potenciales de acción (AP) sólo en MSNs WT, siendo este efecto bloqueado por estricnina (STN). Finalmente, con estudios de comportamiento, encontramos que ratones KI fueron similares a WT en condiciones controles, pero cuando se desarrolló la prueba de Perdida del reflejo de enderezarse (LORR), ratones KI mostraron un menor tiempo de sedación a concentraciones altas de etanol (3.5 g/kg). Además, animales KI mostraron mayor consumo y preferencia a etanol. En conclusión, esta tesis nos ayuda a entender el rol de R-Gli α1 en el sistema de recompensa, con el fin de analizar la acción fisiológica de etanol en el desarrollo patológico del abuso alcohólico y alcoholismo.
Description
Tesis para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas. Área Biología Celular y Molecular.
Keywords
Biología, Trastornos del Sistema Nervioso Inducidos por Alcohol, Etanol - Efectos Fisiológicos