Facultad de Farmacia

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https://repositorio.udec.cl/handle/11594/230

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Desarrollo de metodologías analíticas para la caracterización de compuestos de bajo peso molecular en Bio-Oil y su aplicación en la optimización del proceso de producción y fraccionamiento.
(Universidad de Concepción, 2011) Tessini Ortiz, Catherine Valeska; Baer von Lochow, Dietrich von
En la presente tesis se desarrollaron y evaluaron diferentes metodologías para la determinación de diversos componentes en el bio-oil. Para ello se emplearon distintas técnicas cromatográficas, con el objetivo de determinar ácidos orgánicos de cadena corta, compuestos volátiles, azúcares y aldehídos en bio-oil y sus fracciones. La caracterización y determinación de estos analitos además sirve de base para evaluar las condiciones óptimas de pirólisis de biomasa, para orientar el proceso hacia la obtención de productos químicos de interés industrial. Para la determinación de los aldehídos de bajo peso molecular, como formaldehído, acetaldehído y propionaldehído, se evaluó su determinación por HPLC-UV, previa derivatización con 2,4-DNPH. Las condiciones de esta derivatización pueden provocar reacciones no deseadas que afecten la estabilidad del bio-oil y de sus principales componentes. Por ello fue necesario desarrollar una metodología de mayor selectividad y en que la reacción de derivatización no se realice en condiciones que afecten la cuantificación. Este procedimiento está basado en la utilización de la microextracción en fase sólida en modo espacio de cabeza (head space), empleando la derivatización directamente en la fibra con PFBHA como agente derivatizante. Posteriormente la separación/detección es realizada en un sistema GC/MS. Esta metodología demostró ser sencilla y rápida. Además es posible su optimización, empleando herramientas quimiométricas. Alternativamente se desarrolló un método basado en la derivatización en la solución de la muestra, empleando el sistema de inyección en modo espacio de cabeza. Los aldehídos determinados por ambas metodologías fueron: formaldehído (~ 2 %), acetaldehído (~ 0.1 %) y propionaldehído (~ 0.05 %). Mediante cromatografía liquida de alta resolución, en la modalidad de fase inversa en serie con exclusión iónica y detección directa al UV a 210 nm, es posible la determinación por inyección directa de ácidos orgánicos (fórmico, acético y propiónico) en fracciones de bio-oil obtenidas por destilación. Ello no requiere un tratamiento previo de la muestra, sin embargo esta metodología no es aplicable a muestras de bio-oil crudo, por los interferentes que éste contiene. Los azúcares en bio-oil fueron determinados por HPTLC. Con esta técnica fue posible la cuantificación de los principales azúcares en el bio-oil. Para ello fue necesaria la implementación de un sistema de screening para descartar la presencia de glucosa en las muestras, ya que de estar presente en altas concentraciones, podría interferir en la cuantificación del celobiosano. Esta metodología puede aplicarse directamente a muestras de bio-oil crudo, fracciones de solventes orgánicos y fracciones acuosas e incluso a muestras de lignina pirolítica. Los principales azúcares que se determinaron fueron: levoglucosano (~ 1.5-3 %), celobiosano (~ 0.5-2.0 %), xilosa y arabinosa. Estos últimos en la mayoría de las muestras, si es que se detectaban, se encontraban bajo los límites de cuantificación del método. Además se desarrolló una metodología sencilla basada en la derivatización de analitos con BSTFA. Ello permite determinar ácidos orgánicos y azúcares, los cuales pueden ser derivatizados de forma simultánea y cuantificados en un solo cromatograma, empleando un estándar interno para cada grupo de compuestos. Los principales ácidos determinados mediante este método fueron ácido fórmico (~ 0.5-2 %), acético (~ 1.5-3.0 %), propiónico (~ 0.1-0.8 %), láctico (~ 0.1-0.6 %) y glicólico. A su vez, los principales azúcares determinados fueron levoglucosano (~ 1.5-2.8 %), celobiosano (~0.2-1.5 %), xilosa (~ 0.05 %) y arabinosa (~ 0.05 %). Dependiendo de la utilidad que tenga el bio-oil a nivel industrial, las metodologías desarrolladas pueden ser aplicadas de forma individual o complementada con el método general de caracterización de bio-oil mediante su inyección directa a GC/MS. De esta forma es posible contar con diferentes alternativas para la cuantificación de los compuestos en el bio-oil.
Desarrollo de una plataforma analítica para el estudio de compuestos (poli)fenólicos en frutos de uva, calafate y para metabolómica en plasma de animales de experimentación sometidos a la ingesta aguda de un extracto de fruto
(Universidad de Concepción, 2017) Bustamante Salazar, Luis Alejandro; Mardones Peña, Claudia; Baer von Lochow, Dietrich von; Pastene Navarrete, Edgar Rafael
Se desarrolló un conjunto de métodos de análisis con un enfoque metabolómico dirigido y no dirigido, junto a ensayos de capacidad antioxidante como plataforma analítica para estudios de intervención nutricional. De acuerdo a la estrategia analítica planteada, se caracterizaron frutos de uva de mesa (Vitis vinífera L.) Red Globe, Pink Globe y de calafate (Berberis microphylla), 3 frutos con elevadas concentraciones de polifenoles. Los resultados obtenidos por HPLC-DAD-ESI-MS/MS indican que el fruto de calafate contiene entre 60 a 400 veces más antocianos que en las uvas estudiadas, seguido por ácidos hidroxicinámicos y flavonoles (45 y 15 veces, respectivamente), por lo que se diseñó un ensayo de ingesta aguda usando calafate. Con el fin de elaborar un extracto liofilizado de Calafate enriquecido en polifenoles, se modificó la extracción usando etanol potable y ácido fórmico, produciendo un extracto seco de calafate que contiene 265.26 μmol de polifenoles por gramo. Una vez producido un lote homogéneo de extracto liofilizado, se administraron 300 mg/kg de éste a 5 grupos de gerbos (n=3). Transcurridas 1, 2, 4, 8 y 12 horas, se extrajo entre 600 y 1000 μL de sangre mediante punción del plexo retroorbital. Un grupo control (n=3) usado como tiempo 0 se incluyó en el diseño. Se logró obtener plasma sin hemólisis y los animales no fueron sacrificados. A partir de los plasmas obtenidos, se cuantificaron mediante un método GC-MS/MS validado más de 40 productos de metabolización de polifenoles presentes en calafate, análisis metabolómico no dirigido mediante UPLC-QTOF y ensayos de capacidad antioxidante en microplaca. Los resultados cuantitativos obtenidos por GC-MS/MS muestran aumentos de 9 compuestos asociados al consumo del extracto de calafate. Luego de 1 y 2 horas los compuestos 1,4-dihidroxibenceno, ácidos 3,4-dihidroxifenilacético, 4-hidroxicinámico, 3,5-dimetoxi-4-hidroxibenzoico y 3-metoxi-4-hidroxibenzoico muestran una tendencia al alza, mientras que se observó un aumento significativo de los ácidos 3-hidroxicinámico y 3-metoxi-4-hidroxifenilacético. Además, los ácidos 3-hidroxifenilacético y fenilacético muestran aumentos significativos luego de 4 y 8 horas de administrado el extracto. El análisis metabolómico no dirigido de las mismas muestras de plasma revela un cambio significativo de 20 compuestos durante los tiempos ensayados. De estos, uno se identificó como adenosina monofosfato y 6 como metabolitos derivados del consumo del extracto de calafate. Los compuestos cumaroil-quinolactona y derivados sulfatados de ácido (iso)vaníllico y un isómero de ácido cafeico aumentan significativamente luego de 1 y 2 horas de administrado el extracto de calafate. Los derivados sulfatados de un segundo isómero de ácido cafeico y ácido (iso)ferúlico aumentan significativamente solo luego de 1 hora y un metoxicatecol-sulfato aumenta luego de 2 horas. Además, el mismo ácido (iso)ferúlico aumenta nuevamente luego de 12 horas de administrado el extracto. El ensayo ORAC-FL revela un aumento significativo luego de 1 hora, mientras que el ensayo CUPRAC lo alcanza a las 4 horas de administrado el extracto de calafate. Los resultados de Fenoles totales exhiben un aumento significativo a las 1, 4 y 12 horas, relacionándose con los incrementos de los resultados anteriores
Desarrollo de una plataforma científica tecnológica para la identificación de compuestos bioactivos desde arrayán (luma apiculata) y evaluación del efecto de la nanoencapsulación sobre su bioaccesibilidad.
(Universidad de Concepción, 2020) Carrasco Sandoval, Jonathan; Baer von Lochow, Dietrich von; Aranda Bustos, Mario Antonio
Las Enfermedades Crónicas No Transmisibles (ECNT) son la principal causa de morbimortalidad del país y representan un problema nacional e internacional de salud pública. Como resultado, muchas especies nativas/autóctonas han sido estudiadas por su potencial fuente de compuestos fenólicos, los cuales pueden contribuir a la prevención y/o tr7atamiento de dichas enfermedades. Dentro de las especies nativas reconocidas por sus propiedades medicinales se encuentra el arrayán (Luma apiculata), cuyos compuestos bioactivos presentes en el fruto y la hoja podrían ser un aporte relevante para disminuir el riesgo de padecer ECNT. Sin embargo, los estudios reportados de esta especie son muy escasos. En consecuencia, el presente trabajo de investigación tuvo como objetivo principal desarrollar metodologías químico-analíticas para obtener datos científicos que sustenten la característica funcional del fruto y hoja del arrayán y preservar los compuestos bioactivos identificados mediante el empleo de la nanotecnología. Como paso previo al trabajo con arrayán, se desarrolló y optimizó un proceso de extracción asistida de ultrasonido de compuestos fenólicos desde semilla de quinoa. Basándose en este procedimiento, fue establecido y optimizado el proceso de extracción de dichos compuestos desde frutos y hojas de arrayán mediante extracción asistida por ultrasonido en baño ultrasónico. Esta optimización contempló un diseño factorial completo y un diseño central compuesto. Con las condiciones de extracción optimizadas, se evaluó la capacidad antioxidante de los extractos crudos y extractos ricos en compuestos fenólicos obtenidos por adsorción selectiva sobre la resina polimérica Amberlita XAD-7. La capacidad antioxidante se evaluó mediante dos metodologías: 2,2- Difenil-1- picrilhidrazilo (DPPH) y capacidad antioxidante reductor del hierro (FRAP). Además, se determinó el contenido de fenoles totales mediante la metodología de Folin-Ciocalteu (TPC). De acuerdo con los ensayos realizados, quedó en evidencia que los extractos de fruto y hoja de arrayán presentan una elevada concentración de compuestos fenólicos y una alta capacidad antioxidante, en especial, los extractos ricos en compuestos fenólicos. Para establecer el perfil fenólico de los extractos crudos, se implementó un método por cromatografía líquida de ultra-alta eficiencia (UHPLC) acoplada a espectrometría de masas (MS). El análisis cromatográfico, reveló la presencia de siete compuestos fenólicos en el extracto crudo de fruto de arrayán (quercetin 3-β-D glucósido, miricetina, quercetina, ácido p-cumárico, kaempferol glucósido, ácido gálico y kaempferol) y cinco compuestos fenólicos en el extracto crudo de hoja (quercetina 3-ß-D-glucósido, kaempferol 3-glucósido, miricetina, quercetina y ácido gálico). Considerando el perfil fenólico y el efecto antimicrobiano reportado para algunos de los compuestos fenólicos identificados, se determinó la actividad antiviral de extractos crudos (30% etanol) sobre el virus de la hepatitis A y norovirus murino, principales virus entéricos asociados a contaminación alimentaria. El extracto de hoja presentó un efecto antiviral significativo sobre ambos virus, mientras que el extracto de fruto tuvo un efecto moderado sobre el virus de la hepatitis A. Luego de establecer el perfil fenólico, estándares de los compuestos fenólicos puros fueron sometidos a un proceso de digestión gastrointestinal in vitro para estudiar la bioaccesibilidad de dichos compuestos. Paralelamente, se evaluó la potencialidad de tres sistemas nanoparticulados (nanopartículas de zeina, zeína recubierta de alginato y zeína recubierta de complejo alginato/quitosano), los cuales fueron obtenidos mediante los métodos de nanoprecipitación y deposición electrostática. La fracción bioaccesible de los compuestos bioactivos fue determinada mediante cromatografía líquida de alta eficiencia asociada a detección UV (HPLC/UV). Los compuestos fenólicos presentaron una limitada bioaccesibilidad, que varió entre un 3.4 y 16.1%, mientras que los tres sistemas nanoparticulados incrementaron significativamente la bioaccesibilidad de todos los compuestos fenólicos, en especial, las nanoparticulas de zeina recubiertas con complejo de alginato/quitosano, la cual varió entre un 65.8 y 84.0%. Finalmente, se implementó una plataforma científica-tecnológica por HPTLC/(bio)autografía/MS para detectar e identificar en los extractos crudos de fruto y hoja de arrayán compuestos con actividad antioxidante e inhibitoria sobre las enzimas α-glucosidasa y acetilcolinesterasa, consideradas como blancos terapéuticos para tratar la diabetes mellitus tipo 2 y enfermedades neurodegenerativas, respectivamente. El extracto de hoja sólo presentó bandas con actividad antioxidante, mientras que el extracto de fruto presentó un compuesto con marcada actividad antioxidante e inhibitoria sobre ambas enzimas, el cual fue identificado tentativamente mediante la interfaz TLC-MS como fraxetina (hidroxicumarina). Estos resultados permiten sustentar la característica funcional del fruto y hoja de arrayán, además de demostrar el potencial de la nanotecnología (sistemas nanoparticulados) en la preservación de los compuestos responsables de dicha funcionalidad.
Diferenciación varietal y evolución del perfil de flavonoides y actividad antioxidante del vino tinto durante el proceso de guarda.
(Universidad de Concepción, 2010) Vergara Rosales, Carola Andrea; Baer von Lochow, Dietrich von
El vino es un producto de lujo que está sujeto a las demandas del consumidor. El vino chileno es un producto de exportación que compite en mercados internacionales, por lo que debe cumplir con estándares de confianza como la autenticidad varietal y presentar características que lo hagan más atractivo para los consumidores, por el efecto beneficioso para la salud asociado a su consumo moderado. El objetivo de este trabajo fue el desarrollo e implementación de metodologías analíticas para la evaluación de parámetros de calidad, como es la autenticidad varietal en vinos de guarda, y el estudio de la evolución de compuestos antioxidantes del vino tinto durante dicho proceso. Una de las familias de compuestos usados para la diferenciación varietal de vinos tintos son los antocianos, que le confieren el color característico. La razón de antocianos acetilados y cumarilados (Rac/coum) determinados por HPLC en columnas de fase inversa que permite la diferenciación de ciertas variedades de vinos tintos, puede verse alterada por la formación de piranoantocianos durante el envejecimiento del vino. Estos pigmentos poliméricos interfieren en la determinación de antocianos cumarilados, por lo tanto, la resolución entre estos picos debe ser optimizada y rigurosamente controlada para cada columna para minimizar el riesgo de una clasificación errónea. Otra aproximación al problema, es evaluar columnas con una selectividad diferente a las columnas de fase inversa para la separación cromatográfica de antocianos y piranoantocianos. El vino Carménère es un producto emblema nacional, que tradicionalmente había sido confundido en Chile con la variedad Merlot. Como alternativa a la diferenciación varietal de vinos tintos por medio de perfiles de antocianos, se evaluó otro grupo de marcadores que permita mejorar su clasificación. Los perfiles de flavonoles permiten mejorar la separación entre vinos Carménère y Merlot, por medio de la concentración de quercetina total y miricetina total. Se encontró que la concentración de flavonoles promedio para vinos Carménère y Merlot es mayor que la concentración promedio de los vinos Cabernet Sauvignon. Los vinos estudiados presentaron concentraciones de flavonoles superiores a las reportadas en literatura. Por otro lado, una tendencia similar se encontró en pieles de uvas, en donde se encontró una concentración de flavonoles totales superior en la variedad Carménère. Los flavonoles, como compuesto de interés debido a sus propiedades antioxidantes, en vinos Carménère producidos completamente en barrica de roble presentaron la concentración de flavonoles totales más alta en comparación a vinos Carménère producidos en cubas de acero inoxidable. La variedad Carménère presenta los cambios mayores desde el inicio de la fermentación maloláctica que los vinos Cabernet Sauvignon, con respecto a la concentración de flavonoides, capacidad antioxidante y polifenoles totales, pero ambas variedades llegan a concentraciones similares al final del estudio. Se puede observar una mayor correlación entre la concentración de antocianos totales con la capacidad antioxidante, debido a la mayor proporción de éstos en el vino tinto. Debe considerarse además el sinergismo entre todos los polifenoles presentes en el vino sobre la capacidad antioxidante total de éste.
Estilbenoides y proantocianidinas en sarmientos de vides caracterización, incidencia de las condiciones de guarda post-poda, actividad antioxidante y antiproliferativa en células cancerosas.
(Universidad de Concepción, 2018) Sáez Pulgar, Vania Stephanie; Mardones Peña, Claudia; Baer von Lochow, Dietrich von
Los sarmientos de vides son residuos lignocelulósico que se producen anualmente en los viñedos durante la poda invernal. Debido a los altos niveles de (E)-resveratrol, se han propuesto a los sarmientos como una fuente de estilbenoides. Debido a la carencia de estándares de estilbenoides oligoméricos, éstos se purificaron a través de CPC y HPLCsemi. preparativa desde un extracto de sarmientos de Pinot Noir, obteniéndose 12 estilbenoides: (E)-ε-viniferina, (E)-resveratrol, (E)-piceatanol, ampelopsin A, vitisina B, (E)-δ-viniferina, (E)-ω-viniferina, pallidol, scirpusina A, isorapontigenina, (E)-trans-cismiyabenol C y un nuevo estilbenoide, denominado iso-scirpusina A. La identidad de los oligoestilbenoides se confirmó a través de HPLC-Q-Tof y mediante 1H- NMR, 13C-NMR, 1H-HCOSY, 1H-13C-HSQC. Los oligoestilbenoides aislados presentaron una mayor capacidad antioxidante in vitro a través de ORAC-FL que (E)-resveratrol. (E)-piceatannol exhibe efecto in vitro antiproliferativo a través del ensayo MTT sobre líneas celulares cancerosas humanas (SK-MES-1, AGS, J82), este efecto no es apreciable sobre la línea celular humana normal (MRC-5). Ampelopsina A muestra un efecto antiproliferativo mayor que (E)-resveratrol en la línea celular J82 de cáncer de vejiga. Sorprendentemente, el incremento de los estilbenoides en sarmientos es gatillado por la poda. La magnitud de dicho incremento en el sarmiento metabólicamente activo depende de las condiciones en la guarda post-poda. Para evaluar la evolución de los estilbenoides así como de las procianidinas, una familia de (poli)fenoles asociados con efectos beneficiosos para la salud, se desarrolló y aplicó en tres cultivares de vides un método HPLC-DAD-FL para la cuantificación rápida, selectiva y sensible, empleando tecnología de columna de núcleo sólido y un método HPLC-DAD-FL-MS/MS para la identificación. A 60 % de humedad relativa, se obtiene el doble de (E)-resveratrol para el mismo cultivar en comparación a los sarmientos que se almacenaron en 70 % de humedad relativa. (-)- epicatequina disminuye sus niveles durante el almacenamiento post-poda hasta un 75%. por lo que la humedad relativa es una variable importante a considerar en el almacenamiento post-poda de los sarmientos, además del tiempo de guarda, temperatura y longitud del trozo de sarmiento. Explorando nuevas opciones con mayor poder de separación, se desarrolló y optimizó un método cromatográfico bidimensional (HILIC x RP)-DAD-MS/MS, obteniéndose con una buena separación, capacidad de peak (842) y ortogonalidad (A0 = 78%). Se separaron 81 compuestos, entre los que destacan estilbenoides altamente polimerizados así como prodelfinidinas y procianidinas oligoméricas reportadas por primera vez en sarmientos de vides.

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