Facultad de Ciencias Biológicas

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Participación de los mediadores proinflamatorios producidos por las células de Kupffer en el daño de hepatocitos en ratas sometidas a shock por torniquete.
(Universidad de Concepción., 2000) Vega Vargas, Virginia Loreto
El síndrome de shock se caracteriza por la generación de un estado hipotensivo severo que resulta en el desarrollo de la falla orgánica múltiple (FOM). Con el fin de estudiar los mecanismos involucrados en el desencadenamiento de la FOM hemos estandarizado un modelo de shock en ratas que consiste en la generación de isquemia/reperfusión en las extremidades posteriores, lo que resulta en la aparición de un daño local que se hace extensivo hacia otros órganos. Resultados previos de nuestro laboratorio han mostrado la existencia de un estrés oxidativo hepático agudo en ratas sometidas a shock por torniquete. El objetivo de este trabajo fue evaluar la participación de las células de Küpffer en el desarrollo del daño hepático. Ratas hembras Sprague-Dawley fueron sometidas a shock por torniquete con o sin pretratamiento con cloruro de gadolinio (GdCl3), sustancia que inactiva y/o destruye a las células de Küpffer. Nuestros resultados muestran que como consecuencia de la reperfusión de las extremidades posteriores se produce la activación de las células de Küpffer lo que resulta en un incremento en el clearance de carbón coloidal y en la síntesis y secreción de citoquinas proinflamatorias (TNF-, IL-1 e IL-6) hacia la circulación. Conjuntamente, observamos que la activación de las células de Küpffer desencadena un estrés oxidativo hepático caracterizado por la disminución en los niveles de GSH y SOD tisular y por un aumento en los productos derivados de la peroxidación lipídica (TBARS) y por la liberación de las transaminasas a la circulación. Además, los resultados señalan que la infiltración leucocitaria del hígado así como las alteraciones hematológicas reportadas en este modelo de shock son consecuencia de la activación de los macrófagos hepáticos. Es importante destacar que el pretratamiento de los animales con GdCl3 previene todas las alteraciones señaladas e incrementa la sobrevida de los animales sometidos a shock por torniquete. Por otra parte, demostramos que la liberación de la xantino oxidasa (XO) desde las extremidades reperfundidas hacia la circulación resulta en un incremento en los niveles de XO circulante y en la activación de las 9 9 células de Küpffer, lo que sugiere que esta enzima sería uno de los mediadores endógenos responsables de la propagación del daño asociado a la isquemia/reperfusión de las extremidades posteriores. Del mismo modo, los estudios in vitro señalan que la XO induce la secreción de mediadores proinflamatorios (TNF-, IL-1 e IL-6) y óxido nítrico en las células de Küpffer provenientes de animales controles. Además, se observó que el cultivo de hepatocitos provenientes de animales controles con medio de cultivo condicionado proveniente de estas células y con XO resulta en alteraciones oxidativas similares a las observadas en los cultivos de hepatocitos provenientes de animales sometidos a shock por torniquete. Estos resultados nos permiten concluir que: a) el daño oxidativo hepático depende de la activación de las células de Küpffer y b) la XO es uno de los mediadores endógenos involucrados en la activación de estas células.
Prevalencia de integrones en Bacilos Gram negativos heterotróficos aeróbicos aislados del río Biobío y su relación con el fenotipo de resistencia a antibióticos.
(Universidad de Concepción., 2000) Sossa Fernández, Katherine Elizabeth; González Rocha, Gerardo Enrique
Los bacilos Gram negativos han adquirido importancia como microorganismos patógenos oportunistas debido a su multiresistencia a los agentes antibacterianos, la cual puede estar codificada en ADN cromosomal o extracromosomal (plásmidos, transposones o integrones). Diversos estudios se han orientado a dilucidar el rol de plásmidos y transposones en la diseminación de genes de resistencia en ambientes naturales, pero existe poca información acerca de la participación de los integrones en este fenómeno biológico. El objetivo de este trabajo fue evaluar la frecuencia de integrones en bacilos Gram negativos heterotróficos aerobios aislados del sedimento del río Biobío y la relación de estos elementos genéticos con la resistencia a antibióticos. Se aislaron cepas de bacilos Gram negativos desde muestras de sedimento del río Biobío en Queuco, Coigüe, Chiguay y Puente SS. Juan Pablo II y se investigó la contaminación fecal en muestras de cada estación. Se realizó hibridación en colonia con 1029 cepas bacterianas, empleando oligonucleótidos específicos para el gen de la integrasa de los integrones clase 1 y clase 2. Además, se estudió la actividad de algunos agentes antibacterianos sobre las cepas que dieron señal positiva. También, se incluyó un grupo de cepas con señal negativa. Los recuentos de bacilos Gram negativos oscilaron entre 105 y 107 UFC/g de sedimento seco. Se seleccionaron aproximadamente 250 cepas de cada estación para el ensayo de hibridación. Las frecuencias porcentuales de cepas que poseen ambas o cualquiera de las dos integrasas fueron 22,3 %, 44,0 %, 45,6 % y 54,8 % en bacterias de las estaciones de Queuco, Coigüe, Chiguay y Puente SS. Juan Pablo II, respectivamente. Los valores siempre aumentaron río abajo, en relación directa con la magnitud de la contaminación fecal, que aumentó desde 3,1 x 103a 1,4 x 106 NMP/100 g de sedimento seco. Los integrones clase 1 fueron significativamente más frecuentes (%) en todas las estaciones. No se encontraron diferencias significativas entre los valores del Índice de Resistencia Antibiótica (IRA) entre cepas con y sin integrones, pero se observó que en las bacterias con integrones es mayor el número de cepas resistentes a antibióticos aminoglucósidos como estreptomicina y tobramicina. Estos resultados demuestran la presencia de integrones en bacterias Gram negativas del sedimento del río Biobío y las elevadas frecuencias encontradas sugieren que estos elementos genéticos pueden estar participando en la diseminación de algunos genes de importancia ambiental.
Caracterización molecular de una adenilil ciclasa de oocito de Xenpus laevis, estudio de estructura-función.
(Universidad de Concepción., 2000) Torrejón Quezada, Marcela Eliana; Olate Aravena, Juan
El objetivo general de este trabajo de tesis fue caracterizar a nivel molecular una adenilil ciclasa (A.C.) de oocito de Xenopus laevis y su interacción con otros componentes que participan en el sistema de transducción de señal. Para ello utilizamos sistemas de expresión en células en cultivo (sistema heterólogo), el cual nos permitió realizar estudios de actividad de A.C. en respuesta a GppNHp, forskolina, AlF4- y Ca2+/CaM. Posteriormente, los estudios realizados a través de la técnica de doble híbrido, nos permitieron analizar la interacción entre las regiones citosólicas C1 y C2 de la A.C. de X. laevis y las subunidades Gs silvestres, mutantes y quimeras. Se obtuvo el gen completo que codifica para una adenilil ciclasa (A.C.) de oocito de X. laevis. El cDNA posee un tamaño de 4.372 pares de bases y contiene un marco de lectura abierto para una proteína de 1.355 aminoácidos. La comparación de la secuencia de aminoácidos deducida con secuencias de A.C. de mamífero, mostró un bajo índice de identidad (19,7%-24,2%), excepto con la A.C. de tipo IX de ratón (70%). A través de análisis de transcripción reversa y PCR se detectó expresión del mRNA durante la oogénesis, pero no durante estados tempranos de la embriogénesis (mórula y blástula), indicando probablemente su participación en el proceso de maduración. La expresión de la A.C. de X. laevis en células en cultivo COS-7 y HEK293 resultó en un aumento de la actividad basal, la cual fue estimulada notoriamente por Gpp(NH)p y NaF, pobremente por forskolina e insensible a calcio-calmodulina. Este tipo de regulación es similar al mostrado por la A.C. de tipo IX de ratón, por lo que ambas A.C. representarían una nueva isoforma de A.C. Utilizando el sistema de doble híbrido en levadura se analizó la interacción física entre los dominios C1 y C2 de la A.C. y la proteína Gs. Se encontró interacción entre C2 y entre C1 y C2, pero no entre C1, lo que está de acuerdo con las estructuras cristalinas previamente descritas para este tipo de complejos. También se observó interacción solamente entre el dominio C2 y la especie activa de Gs (G-GTP), lo que concuerda plenamente con estudios previos de tipo cristalográficos y bioquímicos. Todos estos resultados indican que la A.C. de X. laevis pertenece a un nuevo isotipo de enzima dentro de esta gran familia de proteínas que es regulada positivamente por la especie activa de la proteína Gs a través de su dominio citosólico C2.
Efecto de la concentración de sustrato en la degradación aeróbica de fenantreno por cepas bacterianas ambientales.
(Universidad de Concepción., 2000) Cerda Leal, Fabiola; Urrutia Briones, Homero
Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) son compuestos hidrofóbicos conformados por dos o más anillos aromáticos, con potencial cancerígeno y mutagénico y cuya persistencia en los ecosistemas se debe principalmente a su baja solubilidad en agua, lo que aumenta su adsorción a la materia orgánica y disminuye su biodegradación. Este tipo de contaminantes ambientales es degradado principalmente por vía biológica, aunque en ocasiones los procesos de degradación son incompletos, dado que los HAP no se encuentran solubles en el medio y generalmente, este estado es considerado un pre requisito para su biodegradación.El presente estudio se desarrolló con el propósito de conocer el efecto de la concentración de HAP sobre su tasa de degradación por cepas bacterianas de origen ambiental aisladas de la Bahía de San Vicente Chile y la interrelación entre diferentes concentraciones de fenantreno en la fase acuosa sobre la cinética de crecimiento bacteriano y la cinética de degradación de éstos compuestos. Se tomaron muestras de aguas superficiales de la Bahía de San Vicente y se implementaron cultivos de enriquecimiento en petróleo crudo y fenantreno como fuentes únicas de carbono y energía. Se seleccionaron e identificaron tres cepas bacterianas con capacidad degradativa sobre estos sustratos: Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mendocina y Bacillus sp. Las cepas se cultivaron en presencia de 0,5; 1,0; 2,0 y 50 mg/l de fenantreno y se determinaron las cinéticas de crecimiento y degradación del sustrato. La velocidad de crecimiento (, h-1) varío entre 0,123 (+0,04) y 0,365 (+0,035) 2h-1 en las concentraciones de 0,5 y 50,0 mg/l de fenantreno respectivamente. A su vez, la mayor degradación de sustrato después de 48 h de cultivo se obtuvo con la concentración 50 mg/l de fenantreno (5,15 mg/l). Algunos de los parámetros de la cinética de crecimiento bacteriano determinados en este estudio presentaron valores máximos en la concentración 1 mg/l de sustrato en la fase acuosa. Las velocidades de crecimiento mostraron diferencias estadísticamente significativas entre 0,5 y 1,0 mg/l. Por otro lado, en las diferentes concentraciones ensayadas los parámetros de la cinética degradativa (Ks= 0,48 y Vmáx= 0,245 ) indican que ésta estaría limitada por la concentración de sustrato en la fase acuosa. Por lo tanto, se comprueba la hipótesis
Resolución de la estructura terciaria de R-ficoeritrina de Gracilaria chilensis.
(Universidad de Concepción., 2000) Contreras Martel, Carlos; Bunster Balocchi, Marta Cecilia
El conocimiento de la estructura tridimensional de las proteínas ha sido una importante herramienta, tanto en el pasado como en el presente, para la comprensión de muchos fenómenos biológicos y juega un papel crucial en la biología molecular actual. La determinación de la estructura de proteínas por difracción de rayos-X constituye una poderosa técnica para su análisis estructural a nivel atómico, lo que permite correlacionar la estructura con la función. El presente trabajo se enfocó a la determinación de la estructura terciaria de R-ficoeritrina de Gracilaria chilensis, proteína encargada de captar y transferir la energía luminosa en el ficobilisoma. El análisis de la estructura permite plantear un modelo de conducción de luz para esta proteína. R-ficoeritrina está constituida por dos tipos de cadenas: y , y por cadenas de unión que forman el agregado 6. La estructura tridimensional de este hexámero se logró mediante cristalografía y difracción de rayos-X. Se obtuvieron datos a 2,7 y 2,2 Å de resolución para sendos cristales. En ambos casos se obtuvieron los mismos parámetros de celda unidad (a=b=187 Å, c=59 Å; ==90º, =120º) y el grupo espacial R3. Los datos de la mayor resolución presentaron el fenómeno de macla. El problema de la fase se resolvió por reemplazo molecular empleando la estructura de R-PE de Polysiphonia urceolata. La solución de la estructura para el cristal maclado se realizó mediante el programa SHELX-97. Los factores R y Rfree obtenido al finalizar el refinamiento fueron 0,16 y 0,25 respectivamente. Cada uno de los residuos aminoacídicos de las cadenas y fueron correctamente asignados, siendo posteriormente confirmado por secuenciación química parcial de ambas Resolución de la estructura terciaria de R-ficoeritrina de Gracilaria chilensis. Resumen XV cadenas. Se reconocieron claramente en los mapas de densidad electrónica dos cromóforos en la cadena (82 y 139), tres en la (82, 158 y 50/61) y una metilación sobre 72N. Además, se logró asignar una región helicoidal de seis residuos de la cadena de unión . En base al análisis estructural de los cromóforos se plantean posibles rutas de transferencia de energía en R-ficoeritrina de Gracilaria chilensis, considerando la ubicación y las distancias intercromóforos. Las coordenadas de R-PE de Gracilaria chilensis fueron depositadas en el Protein Data Bank (1eyx.pdb), constituyendo la primera estructura tridimensional de una proteína resuelta en Chile.
Obtención de cepas mutantes de Mycobacterium sp. con actividad biotransformadora de fitoesteroles.
(Universidad de Concepción., 2001) Vidal Oyarce, Maricel de Lourdes; Silva Osorio, Mario; Mondaca Jara, María Angélica
Las transformaciones microbiológicas de compuestos orgánicos han sido estudiadas desde hace varias décadas, siendo uno de los mayores aportes en la industria farmacéutica, para la obtención de antibióticos y esteroides. El consumo de esteroides y sus derivados han tenido un aumento continuo a nivel mundial, por otro lado, las fuentes de obtención, a partir de productos naturales mediante hemisíntesis química, han sufrido una disminución paulatina, debido a un agotamiento de la principal materia prima, las plantas del género Dioscorea. La ruta microbiológica, en la obtención de esteroides, nace como una alternativa de bajo costo y de menos etapas, en donde se han utilizado una variedad de cepas de hongos, bacterias y microalgas. En este trabajo, se seleccionaron cepas mutantes de Mycobacterium sp. MB-3683 y Mycobacterium fortuitum B-11045 con capacidad biotransformadora de fitoesteroles. Sobre estas cepas, se ejerció una presión selectiva mediante el uso de altas concentraciones de sustrato. Para esto, se cultivaron ambas cepas de Mycobacterium en un medio enriquecido con -sitosterol (14 gr/l) como única fuente de carbono. Durante este proceso, se realizaron siete traspasos sucesivos de los cultivos bacterianos en un período de dos meses. La extracción de productos de biotransformación se realizó con metanol y acetato de etilo y posteriormente los análisis cualitativo y cuantitativo se llevaron a cabo mediante cromatografía en capa fina, cromatografía gas-líquido (GLC) y GLC-masa. Bajo estas condiciones, se observó que después de los siete traspasos, las cepas Mycobacterium sp. MB-3683 y M. fortuitum B-11045, aumentaron su porcentaje de biotransformación desde un 20% a un 64% y desde un 34% a un 55%, respectivamente. Los productos de biotransformación obtenidos, en mayor proporción, para cada 2 experiencia fueron la androstenediona (AD) y androstadienediona (ADD). Además, se aisló a partir del quinto traspaso, un producto derivado del AD que posee un grupo hidroxilo en posición 9, que es una excelente alternativa para la obtención de un grupo de hormonas esteroidales, del tipo corticoides. Los resultados sugieren que, una elevada concentración de sustrato es un buen mecanismo selectivo de cepas más eficientes en la biotransformación de ß-sitosterol a bases esteroidales, y que, además, la biotransformación puede dirigirse hacia la obtención de productos definidos como el 9-OH-AD.
Análisis del mecanismo de remodelamiento nucleosomal asociado con la expresión temporal de genes de histonas alfa durante la embriogénesis temprana del erizo de mar tetrapygus niger.
(Universidad de Concepción., 2001) Medina Díaz, Ricardo Felipe; Montecino Leonard, Martín Alejandro
La regulación transcripcional en eucariontes ocurre en el contexto de la cromatina y está fuertemente influenciada por las barreras impuestas por la estructura nucleosomal. Entonces, una pregunta fundamental en biología es saber ¿cómo el genoma eucariótico es manipulado en el ambiente cromatínico?. In vivo, existe una asociación directa entre la remodelación de la estructura de la cromatina y la expresión regulada de genes eucarióticos. En la presente Tesis Doctoral se estudiaron los cambios que sufre la estructura cromatínica y las interacciones de factores de transcripción como consecuencia de la expresión de los genes de histonas tempranas en erizo de mar. Este modelo presenta grandes ventajas ya que en él es posible el estudio de los mecanismos involucrados en la regulación temporal de la expresión génica durante el desarrollo embrionario. En este sistema, luego de la fecundación, se expresan secuencialmente a distintos tiempos del desarrollo embrionario los genes de las histonas CS, histonas tempranas e histonas tardías. Durante este trabajo se clonó y secuenció el gen de la histona temprana H3 del erizo de mar Tetrapygus niger y se determinó su patrón de expresión, el cual se inicia al estado de 16 células, alcanza un máximo al estado de 128 células y luego declina al estado de larva Pluteus. Se encontró además un sitio hipersensible a DNasa I localizado en la posición –90 de la región promotora de este gen, el cual sólo se detectó cuando se observaron los máximos niveles del mRNA de la histona temprana H3. Se identificó el elemento regulador TnH3CCAAT (nt –94/–77), que incluye al sitio hipersensible a DNasa I, como el responsable de unir un complejo proteico presente al estado de 128 células y cuyo componente de unión al DNA es el factor de transcripción homeodominio CDP/cut. Se estableció un protocolo de purificación de complejos remodeladores de cromatina que pudieran tener un rol en la activación transcripcional temporal. Además, se identificó un complejo de características bioquímicas similares que incluye a CDP/cut como componente de unión al DNA, en un estado del desarrollo embrionario en el cual no se observa expresión del gen de la histona temprana H3 de T. niger. En base a estos resultados se postula un modelo que pretende explicar este cambio en el patrón de expresión de este gen en términos de complejos proteicos que contienen a CDP/cut como componente de unión al DNA y de estructura cromatínica durante el desarrollo embrionario de erizo de mar. Se estudió también el posible rol del remodelamiento de la estructura de la cromatina espermática inmediatamente después de producida la fecundación. Este proceso requiere un remodelamiento de la estructura de la cromatina espermática y el reemplazo de las proteínas histónicas espermáticas por histonas CS de origen materno. En este período tan particular del desarrollo embrionario es necesaria una fuerte decondensación del pronúcleo masculino altamente compactado, con el fin de reestablecer la diploidía del genoma del embrión. En el presente trabajo también se describe por primera vez la presencia de una actividad remodeladora de cromatina dependiente de energía en citoplasma, pero no en núcleo, de óvulos sin fecundar. Esta actividad remodeladora de cromatina contendría como componente catalítico una subunidad relacionada a ISWI. No se detectaron proteínas relacionadas a SWI2/SNF2 tanto en citoplasma como en núcleo de óvulos sin fecundar. Estos resultados nos llevan a postular un modelo en el cual se incluye a esta actividad remodeladora de cromatina, conjuntamente con otras actividades enzimáticas y que explicarían el fenómeno de decondensación del pronúcleo masculino posfecundación.
Genotipificación de cepas de Helicobacter pylori aisladas de pacientes con patología digestiva alta en base a los genes cagA y vacA.
(Universidad de Concepción., 2001) Martínez Torres, Alejandra; González Correa, Carlos
Helicobacter pylori es agente etiopatogénico de gastritis crónica antral y de enfermedad péptica ulcerosa. Su distribución es mundial y la prevalencia de la infección por esta bacteria en Chile oscila entre 60 a 75%, dependiendo de la población estudiada. La evolución de la infección depende tanto de factores del huésped como del microorganismo; entre estos últimos, la presencia del gen cagA y el genotipo de vacA son dos importantes factores. Por ello, el objetivo de esta Tesis fue genotipificar, en base a los genes cagA y vacA, cepas de H. pylori obtenidas de pacientes con sintomatología digestiva alta y determinar si existen diferencias en la evolución de la infección, desde el punto de vista de las manifestaciones clínicas e histopatológicas, dependiendo del genotipo de la cepa infectante.Se estudiaron las cepas de H. pylori obtenidas de 50 pacientes, 17 con enfermedad péptica ulcerosa (EPU) y 33 con dispepsia no ulcerosa (DNU). De cada paciente se tomaron biopsias de mucosa antropilórica para prueba de ureasa directa, cultivo e histopatología. El cultivo se realizó en agar Columbia suplementado con sangre e inhibidor Dent. El análisis histopatológico se realizó de acuerdo al sistema Sydney actualizado. La detección de cagA y la genotificación de vacA se realizó mediante PCR. El gen cagA se detectó en 19 (38%) de las muestras analizadas. La prevalencia de infección con cepas cagA+ fue mayor en hombres, 11/23 (47.8%), que en mujeres, 8/27 (29.6%) (p=NS). Con respecto a vacA, la secuencia señal fue del tipo s1 en 16 (32%) de las muestras; s2, en 16 (32%); hubo amplificación simultánea de s1 y s2, en 9 (18%) y no fue tipificable en 9 (18%). En las muestras de mujeres y hombres, se detectó infección con el tipo s1, en 10 (37%) y en 15 (65.2%); con el s2, en 16 (59.3%) y en 9 (39.1%), respectivamente. La prevalencia de infección con cepas s1 fue mayor en los pacientes con EPU, 12/17 (70.6%), que en los con DNU, 13/33 (39.4%) (p<0.05). La región media de vacA fue m1 en 9 (18%) muestras, m2 en 29 (58%) y hubo amplificación simultánea de m1 y m2 en 12 (24%). En las muestras de mujeres y hombres, se detectó infección con el tipo m1, en 7 (25.9%) y en 14 (60.9%); con el m2, en 25 (92.6%) y en 16 (69.6%) (p<0.05), respectivamente. La prevalencia de infección con el tipo m1 fue mayor en las muestras de pacientes con EPU, 10/17 (58.8%), que en las de pacientes con DNU, 11/33 (33.3%) (p<0.0001). El tipo de secuencia señal no mostró asociación con el tipo de gastritis crónica (GC), pero 24/28 (85.7%) de los pacientes con GC activa presentó infección con cepas del tipo m2 (p=NS). En 16 muestras (32%) se detectó presencia de más de un tipo de secuencia señal o de región media. En los pacientes en que sólo se detectó una cepa, el genotipo s2/m2 se detectó en 15 muestras; s1/m1, en 7; s1/m2, en 4; y s2/m1, en 1. La prevalencia de infección con más de una cepa fue mayor en pacientes con EPU, 9/17 (52.9%), que en pacientes con DNU, 7/33 (21.2%) (p<0.05). De los pacientes con reacción hiperproliferativa linfática (RLH), 6/8 (75%) tenían infección con cepas cagA- vacA m2 (p<0.05). Esta Tesis permite concluir que en los pacientes estudiados, (1) predomina la infección con cepas cagA-; (2) la prevalencia de infección con cepas s1 y s2 es similar; (3) el tipo de región media predominante es la m2; (4) EPU se asocia a infección múltiple, gen vacA con secuencia señal del tipo s1 y región media del tipo m1; (5) la RLH se asocia a infección con cepas cagA- vacA m2.
Estudio de la expresión y función de transportadores de hexosas y vitamina C en células ependimarias normales y tumorales.
(Universidad de Concepción., 2001) García Robles, María de los Angeles; Nualart Santander, Francisco
Los transportadores de glucosa (GLUTs) cumplen una importante función en la adquisición de glucosa a nivel cerebral. La isoforma GLUT1 está presente en las células endoteliales de la BBB y en la barrera de sangre-LCR presente en los plexos coroideos. En neuronas el principal transportador presente es GLUT3. Existe muy poca información de la expresión de GLUTs en las células ependimarias que revisten las paredes ventriculares. Entre las células ependimarias especializadas destacan los tanicitos, células que se localizan en los órganos circunventriculares como la eminencia media. Los tanicitos pueden ser clasificados en 1, 2, 1 y 2, sólo los tanicitos 2 se unen a través de “tight junctions” formando la barrera LCR-eminencia media. Se estudió la expresión y función de GLUTs en tanicitos hipotalámicos de ratón a través de inmunocitoquímica, hibridación in situ y la determinación de parámetros cinéticos. Encontramos una elevada expresión de GLUT1 en tanicitos  y 1, y en los tanicitos 2 una muy baja expresión. Además, detectamos la expresión de conexina 43 y del transportador de lactato MCT1. La expresión de GFAP (marcador de astrocitos) demostró que existe un bajo contenido de astrocitos en las áreas hipotalámicas en que se localizan los tanicitos  y 1. Implementamos cultivos primarios de tanicitos aislados desde hipotálamo de ratón y demostramos que sobrexpresan GLUT1, expresan MCT1 y liberan lactato en respuesta a neurotransmisores como nerepinefrina y glutamato. Por esta razón especulamos que los tanicitos pueden acoplarse metabolicamente con las neuronas de la región del hipotálamo. La microscopía confocal nos permitió determinar que los tanicitos  expresan GLUT2, isoforma que además transporta fructosa y que se expresa principalmente en tejidos que participan en el “sensing” de glucosa. A la fecha, la expresión de GLUT2 en el hipotálamo ha sido demostrada solo por hibridación in situ, no hay datos funcionales que demuestren que GLUT2 se exprese en neuronas o células gliales (tanicitos). Usamos inmunocitoquímica y análisis cinéticos de captación de hexosas para estudiar la expresión de GLUTs en tanicitos hipotalámicos. La microscopía confocal confirma la reacción positiva en el área próximal y distal de los tanicitos . Los tanicitos en cultivos presentaron reacción positiva con anti-GLUT1 y 2. Los ensayos de captación de 2-DOG demostraron que expresan dos sistemas transportadores con Kms de 3 y 40 mM, que corresponden a las descritas para GLUT1 y GLUT2, respectivamente. También logramos establecer que los tanicitos incorporan fructosa, confirmando la presencia de un transportador de fructosa en estas células. Nuestros resultados demuestran que los tanicitos expresan GLUT2. Debido a que los tanicitos están en contacto directo con neuronas, el LCR y vasos sanguíneos hipotalámicos, hipotetizamos que pueden tener la capacidad de detectar y responder a cambios en la concentración de glucosa extracelular y activar la liberación neuronal de factores específicos al fluido extracelular. En el sistema nervioso existe una elevada concentración de vitamina C. Análisis cinéticos de la captación de vitamina C han demostrado que células especializadas incorporan la forma reducida de la vitamina C, ácido ascórbico (AA), a través de un co-transportador de AA/Na+. Recientemente se han clonado dos isoformas de estos transportadores (SVCT1 y 2), estos transportadores incorporan AA con una alta afinidad, SVCT2 es una proteína que se ha detectado principalmente en ojo y cerebro. Varias de las isoformas de los GLUTs transportan eficientemente ácido deshidroascórbico (DHA), la forma oxidada de la vitamina C. Demostramos que SVCT2 es expresado en tanicitos in situ e in vitro. La incorporación de la forma reducida de la vitamina C, en tanicitos, es dependiente de sodio y presenta una Km de 20 M. Los tanicitos también transportan DHA, molécula que es neurotóxica para el sistema nervioso, de tal forma, que los tanicitos pueden realizar una función neuroprotectora reciclando la vitamina C oxidada. Los plexos coroideos están localizados en la región rostral de los ventrículos cerebrales, donde forman la barrera sangre-LCR. La glucosa es transportada por GLUT1 y la vitamina C por SVCT2. Nosotros analizamos la expresión y función de GLUTs y SVCTs en células de papiloma de plexos coroideos humanos. Los análisis inmunocitoquímicos y de hibridación in situ demostraron que estas células mantienen la expresión y la localización basolateral de GLUT1. Por otra parte, las células tumorales no presentaron la capacidad de transportar AA. Sin embargo, las células de los plexos coroideos incorporaron DHA a través de GLUT1. Dado que, en la sangre la vitamina C se encuentra principalmente en la forma reducida, nuestros resultados sugieren que la vitamina C es oxidada extracelularmente, en el tejido circundante por un efecto “bystander”, asociado a la presencia de células estromales y la producción de anión superóxido. Además, las células de los plexos coroideos expresan p47PHOX , una subunidad de la enzima NADPH oxidasa, lo que indica que ellas producen anión superóxido permitiendoles generar DHA.
Presencia de integrones y su relación con la resistencia a antibióticos B-lactámicos en cepas intrahospitalarias de acinetobacter baumannii resistentes a cefalosporinas de tercera generación.
(Universidad de Concepción., 2001) Ramírez González, César Alexis; González Rocha, Gerardo Enrique
Acinetobacter baumannii corresponde a un cocobacilo Gram negativo, no fermentador. Este patógeno oportunista es un importante agente etiológico de infecciones intrahospitalarias, incluyendo bacteremia, infecciones del tracto urinario, meningitis secundaria y, más frecuentemente, como agente de neumonía, particularmente asociada a pacientes confinados en unidades de cuidados intensivos. Estas infecciones son difíciles de tratar debido a que esta especie presenta una elevada y múltiple resistencia a los principales grupos de antibióticos usados en la terapia antinfecciosa, incluyéndose entre ellos a las cefalosporinas de tercera generación. Diversos mecanismos de resistencia a estos antibióticos han sido descritos, los que están mediados básicamente por la expresión de enzimas que hidrolizan el anillo -lactámico y, en menor proporción, por impermeabilidad de la membrana externa a este tipo de compuestos. Sin embargo, la mayor parte de la resistencia a antibióticos -lactámicos, en Gram negativos, está asociada con la producción de -lactamasas, incluyendo enzimas de las familias TEM, SHV, IMP, OXA y sus derivados. En Acinetobacter spp. se han descrito algunas de ellas, y recientemente se demostró la presencia de -lactamasas de espectro extendido (BLEE) que son capaces de hidrolizar cefalosporinas de tercera generación. La diseminación de genes de resistencia normalmente ocurre a través de plásmidos y transposones, sin embargo, nuevos elementos genéticos estarían participando en este fenómeno, los que son conocidos como integrones. Se ha informado de la existencia de cuatro clases de integrones, detectándose en Acinetobacter las clases 1 y 2, los que a su vez pueden contener uno o varios cassettes genéticos que codifican para la resistencia a diversos antibióticos. De esta forma, los cassettes genéticos representan una nueva clase de elementos genéticos que se movilizan mediante recombinación sitio-específica. En este sentido, plásmidos y transposones juegan un rol importante, debido a que la asociación de integrones con transposones o plásmidos, explicaría la presencia de cepas que son simultáneamente resistentes a diferentes antibióticos. De acuerdo a esto, es posible prever como la pesquisa de integrones y cassettes genéticos asociados a estos elementos será de gran importancia al momento de explicar no sólo la diseminación de estos elementos, sino también la multiresistencia que presentan algunas cepas bacterianas. En este trabajo se investigó el rol de los integrones en la resistencia a cefalosporinas de tercera generación en 100 cepas hospitalarias de A. baumannii, la mayoría resistentes a estos antibióticos. Se identificó, mediante hibridación en colonia y PCR, la presencia de integrones en 76 % de las cepas estudiadas distribuyéndose en 2 % con clase 1, 73 % con clase 2 y sólo 1 % de las cepas presentó simultáneamente integrón clase 1 y 2. Por otro lado, se detectaron los genes que codifican para las -lactamasas pertenecientes a la familia TEM en 73 % de las cepas y OXA en 1 %. La caracterización de los integrones en algunas cepas de A. baumannii, reveló la presencia de cassettes genéticos que codifican resistencia a antibióticos aminoglicósidos y trimetoprim. Sólo una cepa (97-53) presentó un cassette codificante de -lactamasa, correspondiendo a una enzima tipo OXA, asociada al integrón clase 1 y 2. Además, se detectaron cepas que siendo resistentes a este grupo de antibióticos no presentaban integrones, mientras que otras siendo susceptibles sí los poseían. Por lo tanto, no se encontró una relación directa entre la presencia de integrones y la resistencia a cefalosporinas de tercera generación en las cepas de A. baumannii estudiadas.
B-Lactamasas de espectro extendido en cepas de Klebsiella spp. y Eschericha coli resistentes a cefalosporinas de tercera generación.
(Universidad de Concepción., 2001) Zemelman Merino, Claudia Angélica; Domínguez Yévenes, Maríana
Las infecciones ocasionadas por bacterias Gram negativas, especialmente las intrahospitalarias, constituyen una de las indicaciones más frecuentes de uso de antibióticos bactericidas y de amplio espectro, entre ellos cefalosporinas de tercera generación. Escherichia coli y Klebsiella spp. participan en una proporción importante como agentes etiológicos de cuadros infecciosos graves y presentan grados variables de susceptibilidad a cefalosporinas de tercera generación. La resistencia a estos compuestos se encuentra determinada por ß-lactamasas, enzimas que son codificadas por genes cromosomales o extracromosomales. Epidemiológicamente son más importantes las últimas porque los genes codificantes pueden ser transferidos, favoreciéndose su diseminación en el medio hospitalario. Las ß-lactamasas de codificación cromosomal manifiestan especial actividad sobre cefalosporinas de primera a tercera generación y no son inhibidas por ácido clavulánico. Por el contrario, las enzimas extracromosomales son inhibidas por ácido clavulánico y pueden pertenecer a varias familias, como SHV y TEM en enterobacterias y, con menor frecuencia, a otros grupos (ej. CTX-M, PER, OXA, etc.). En los últimos años circulan, con relativa frecuencia, cepas de Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli que producen ß-lactamasas con actividad hidrolítica sobre cefalosporinas de tercera generación las que, por esta razón, se denominan ß-lactamasas de espectro extendido. Estas enzimas son inhibidas por ácido clavulánico, característica que permite la pesquisa de las cepas bacterianas que las producen en el laboratorio. En esta Tesis se determinó los patrones y niveles de resistencia de 171 cepas de Klebsiella spp. y 150 cepas de E. coli aisladas de procesos infecciosos en pacientes 15provenientes de diferentes hospitales. Las cepas bacterianas se purificaron e identificaron por los métodos bacteriológicos habituales y se investigó la presencia de ß-lactamasas de espectro extendido en estas bacterias por dos métodos microbiológicos basados en la sinergia que se produce entre cefalosporinas de tercera generación (cefotaxima y ceftazidima) y ácido clavulánico. La presencia de las enzimas fue corroborada mediante la determinación de las concentraciones mínimas inhibitorias (CMIs) de las cefalosporinas, en ausencia y en presencia de ácido clavulánico. Este compuesto inhibidor produce habitualmente una disminución de las CMIs equivalente, al menos, a ¼ de la CMI del antibiótico solo, siempre y cuando no existan otros mecanismos de resistencia adicionales. Posteriormente se determinó los puntos isoeléctricos de las ß-lactamasas de espectro extendido mediante isoelectroenfoque. Se investigó el grupo enzimático al cual pertenecían las enzimas por amplificación genética, mediante reacción de polimerasa en cadena (PCR), utilizando partidores con secuencias específicas para los grupos más importantes de ß-lactamasas de espectro extendido (TEM, SHV, OXA, PER y CTX-M). También se realizaron experiencias de conjugación bacteriana entre cepas de K. pneumoniae y E. coli, como bacterias dadoras, y una cepa de E. coli K-12, como receptora, para comprobar la ubicación extracromosomal de los genes que codifican las ß-lactamasas de espectro extendido. Los resultados obtenidos en las experiencias de sinergia entre cefalosporinas de tercera generación y ácido clavulánico permitieron detectar la presencia de 75 cepas de Klebsiella spp. y de 12 cepas de E. coli productoras de ß-lactamasas de espectro extendido. En todas las cepas seleccionadas se produjo una disminución de la resistencia a cefalosporinas de tercera generación en presencia de ácido clavulánico, indicando la presencia de ß-lactamasas de espectro extendido. Este efecto fue superior cuando se empleó cefotaxima o ceftazidima, pero inferior en el caso de cefepima. En las cepas de Klebsiella spp. se detectaron ß-lactamasas con puntos isoeléctricos 5.4, 6.4, 7.0, 7.6, 8.2, 8.6 y 8.4, siendo las enzimas más frecuentes aquéllas con pI 5.4 (72 cepas) y 7.6 (69 cepas). Con menor frecuencia se encontraron ß-lactamasas con pI 8.2 (42 cepas), 8.6 (12 cepas), 6.4 (3 cepas) y 8.4 (5 cepas). En cambio en E. coli la distribución de ß-lactamasas de acuerdo a sus respectivos pIs fue: 5.4 (11 cepas), 8.4 (5 cepas), 8.2 (3 cepas), 7.9 (2 cepas), 7.0 (1 cepa), > 8.5 (2 cepas). La mayor parte de las cepas estudiadas presentó varias ß-lactamasas, siendo esto más frecuente en cepas de Klebsiella spp. (75 cepas con más de una ß-lactamasa). En E. coli, en cambio, 5 de las 12 cepas presentaron una sola enzima, 3 cepas presentaron dos ß-lactamasas y 4 cepas presentaron tres enzimas, de acuerdo a los pIs encontrados. Se logró transferir la resistencia de una cepa de K. pneumoniae y de una cepa de E. coli a una cepa de E. coli K-12, comprobándose la presencia de un plásmido de peso molecular de 55kD en las cepas dadoras y en las transconjugantes.Los resultados permiten concluir que las ß-lactamasas de espectro extendido son frecuentes en cepas multiresistentes de Klebsiella spp. y de E. coli, aunque la frecuencia es más elevada en las primeras. Las frecuencias encontradas son relativamente más elevadas que las informadas por otros autores sudamericanos y europeos, aunque en otros países la frecuencia es relativamente similar. Los resultados indican la presencia de un complejo enzimático en las cepas deKlebsiella spp. y de E. coli, con amplia similitud en los tipos de ß-lactamasas. También existe similitud en el plásmido que parece codificar estas enzimas. Esto permite concluir acerca de una constante interacción genética intrahospitalaria entre ambos microorganismos.
Estudio de algunas propiedades biológicas de lipopolisacáridos extraídos de cepas de Helicobacter pylori aisladas de biopsias gástricas.
(Universidad de Concepción., 2001) Salgado Sánchez, Fernando; García Cancino, Apolinaria del Rosario
El bacilo Gram negativo Helicobacter pylori es el principal microorganismo involucrado en la gastritis del antro gástrico, donde produce una infección cuya cronicidad se asocia con la aparición de úlcera gástrica, cáncer gástrico y linfoma MALT. La identificación de los factores bacterianos que favorecen la patogenicidad de esta especie, así como el rol que cada uno de estos posee, es aún motivo de controversia. Sin embargo, se sabe que las proteínas CagA, VacA, la ureasa, los flagelos, las adhesinas y el LPS contribuyen al establecimiento de la patología gástrica y determinan variaciones en la presentación clínica de la infección. La participación del LPS como posible factor de virulencia se fundamenta en estudios biológicos y estructurales de la macromolécula, los cuales han demostrado la heterogeneidad y la antigenicidad de la misma. Por otra parte, los resultados de la evaluación de ciertos parámetros inmunológicos indica la participación del LPS como elemento involucrado en la respuesta inflamatoria asociada al microorganismo. En esta tesis se investigó la actividad biológica del LPS de H. pylori, extraído de cepas bacterianas aisladas de biopsias gástricas, obtenidas de pacientes con diversos diagnósticos histopatológicos y endoscópicos. El objetivo general fue conocer algunas propiedades inmunológicas del LPS que podrían contribuir a la virulencia y patogenicidad de este microrganismo. Los LPS se obtuvieron por extracción fenólica en caliente, se purificaron por tratamiento con ADN asa, ARNasa, lisozima y proteinasa K y se ensayaron para evaluar su actividad biológica utilizando el modelo murino. Se estudió la capacidad del LPS para estimular, in vitro, la mutagenicidad y la secreción de FNT en células esplénicas de ratón y se evaluó, in vivo, la actividad de los extractos para inducir esplenomegalia. Además, se determinó la endotoxicidad de las preparaciones de LPS mediante la prueba de Limulus. Todos los extractos de LPS estudiados se comportaron como inductores mitogénicos, estimularon la secreción de FNT in vitro y además, indujeron el crecimiento del bazo. Sin embargo, se observaron diferencias en la intensidad de la actividad biológica, la que fue mayor en aquellos extractos obtenidos de cepas aisladas de pacientes con gastritis crónica activa asociada a regeneración epitelial. El resto de los extractos de LPS obtenidos de cepas aisladas de pacientes con distintos diagnósticos histopatológicos evidenció una respuesta menor y bastante homogénea. Sorprendentemente, las cepas con LPS de mayor actividad biológica correspondieron a cepas con genotipos de baja virulencia para vacA. Los resultados presentados en esta tesis sugieren que el LPS de H. pylori podría tener una participación importante en la respuesta inmunológica que se desencadena en el epitelio gástrico, como consecuencia de la infección y posterior colonización del patógeno. Las propiedades estudiadas establecen que el LPS de H. pylori es capaz de iniciar respuestas biológicas in vitro e in vivo, por lo cual, constituye un factor de virulencia para algunas cepas de esta especie bacteriana.
Historia de la vegetación andina en los valles de Alto Biobío y Lonquimay, Chile centro-sur 38°-39°S), durante el Holoceno estudio paleoecológico basado en el análisis de polen.
(Universidad de Concepción, 2001) Rondanelli Reyes, Mauricio; Marticorena P., Clodomiro
Rol de integrones y cassettes genéticos en la resistencia de acinetobacter baumannii a antibióticos aminoglicósidos.
(Universidad de Concepción., 2002) González Rocha, Gerardo Enrique
Acinetobacter baumannii es un microorganismo que constituye un serio problema hospitalario, por ser agente causal de variadas infecciones nosocomiales, principalmente en pacientes inmunodeprimidos en las unidades de cuidados intensivos. El principal problema de esta bacteria es su elevada y amplia resistencia a los antibióticos comúnmente usados en terapia antiinfecciosa, incluyendo antibióticos -lactámicos, aminoglicósidos y quinolonas. Los antibióticos aminoglicósidos constituyen un grupo importante de compuestos bactericidas que, asociados a los antibióticos -lactámicos, logran efectos sinérgicos, especialmente sobre bacilos Gram negativos. Esta propiedad determina su amplio uso a nivel hospitalario, ejerciendo una fuerte presión selectiva que ha llevado a una rápida y creciente selección de bacterias resistentes. El principal mecanismo de resistencia a estos antibacterianos se basa en la síntesis de enzimas modificantes de aminoglicósidos (EMAs) que acetilan grupos amidógenos o fosforilan o adenilan ciertos grupos hidroxilos. Los genes de EMAs son variados y pueden localizarse en plásmidos, transposones o cassettes genéticos de resistencia insertos en integrones. Estos últimos, constituyen una familia de elementos genéticos potencialmente móviles capaces de integrar y expresar genes de resistencia a antibióticos. La multiresistencia que presentan las cepas de A. baumannii no ha podido ser totalmente fundamentada en la presencia de plásmidos de resistencia, ya que aquellos detectados en esta bacteria no siempre se relacionan con la resistencia a antibióticos. En esta Tesis se evaluó la actividad de amikacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, tobramicina, estreptomicina, trimetoprim, cloranfenicol, sulfametoxazol y tetraciclina sobre 486 cepas de A. baumannii aisladas en diversos hospitales de Chile entre 1990 y 1998. El perfil de EMAs de las cepas se dedujo a partir de su patrón de resistencia a antibióticos aminoglicósidos, pero también se intentó la identificación de los genes que codifican estas enzimas en algunas cepas. Se determinó la prevalencia de integrones de las clases 1, 2 y 3 en 254 cepas y se caracterizó la zona variable de integrones clase 1 y clase 2 en un grupo seleccionado de ellas. Los resultados indicaron que las cepas de A. baumannii aisladas en hospitales chilenos presentan elevada resistencia a los antibióticos aminoglicósidos, especialmente a gentamicina (> 85 %), estreptomicina (> 87 %) y neomicina (> 80 %), con amikacina como el antibiótico más activo, pero con frecuencia de resistencia elevada (> 50 %). La mayor frecuencia de cepas resistentes se encontró entre las cepas de 1994 (> 90 %). Frente a todos los aminoglicósidos el nivel de resistencia fue elevado, con valores de CMI50 que sobrepasan el límite de resistencia establecidos. Todas las cepas fueron resistentes a cloranfenicol y la resistencia a trimetoprim y sulfametoxazol fue elevada (> 85 %). Tetraciclina exhibió niveles de resistencia moderados, con valores de CMI50 que variaron entre 4 g/ml y 16 g/ml; sin embargo, la frecuencia de cepas resistentes fue elevada. La mayor frecuencia de resistencia a todos los antibióticos se encontró en las cepas del biotipo 9 ( 75 %). Experimentos de curación permitieron relacionar un plásmido de más de 30 kb con la resistencia a amikacina, neomicina y kanamicina, específicamente por la pérdida del gen aph(3’)VIa en las cepas curadas. La mayoría de las cepas posee integrones (68,1 %), siendo más prevalente la clase 2 (64,2 %), principalmente en las cepas del biotipo 9. La mayoría de los integrones caracterizados presentó una estructura similar a la encontrada en el transposón Tn7, ya que en ellos se detectaron los cassettes genéticos dfrA1 y ant(3”)Ia. En una cepa se comprobó, además, la integración del gen cat, que codifica resistencia a cloranfenicol, entre los genes intI2 y dfrA1. En otra cepa, no fue posible determinar los genes insertos en esta región. Sólo once cepas (4,3 %) del biotipo 6 presentaron un integrón clase 1. En todas ellas se encontró el cassette genético aac(6’)Ib inserto en la zona variable, justificando la resistencia a amikacina, tobramicina y netilmicina. No se detectaron integrones clase 3 en las cepas de A. baumannii estudiadas. La resistencia a amikacina, netilmicina y tobramicina, fue mayor en cepas con integrón que en aquellas que no los poseen, pero frente al resto de los antibióticos no hubo grandes diferencias entre ambos grupos de cepas. Los patrones de resistencia fueron más amplios en las cepas con integrón, incluyendo a siete o más antibióticos. En las cepas con integrón clase 2 los patrones de resistencia a los antibióticos aminoglicósidos permitió deducir una gran variedad de EMAs, siendo ANT(3”)-Ia y AAC(3) las prevalentes, con frecuencias de 98,8 % y 87,5 %, respectivamente. En menor frecuencia (68,8 %) se dedujo las enzimas APH(3’) y AAC(6’)Ib. En las cepas sin integrón las enzimas más frecuentes fueron ANT(3”)-I ó APH(3”)-I, AAC(3) y APH(3’) (96,3 %, 57,5 % y 43,8 %, respectivamente). La EMA APH(3’)-V, no descrita con anterioridad en Acinetobacter spp., fue inferida en once cepas intI2+ y en dos cepas sin integrón. Además, la EMA ANT(4’)-II, igualmente no informada anteriormente en esta bacteria, se dedujo en dos cepas intI2+. Los resultados de este estudio demuestran que la elevada resistencia de cepas de A. baumannii, aisladas en hospitales de Chile, se fundamenta en la síntesis de una variada gama de EMAs, cuyos genes no siempre están codificados en cassettes genéticos de resistencia insertos en un integrón.
Participación de mastocitos y componentes de sistemas proteolíticos en el desarrollo de neoplasias cérvico-uterinas.
(Universidad de Concepción., 2002) Cabanillas Sáez, Ana Mercedes
Aunque la presencia de mastocitos en zonas peritumorales es una observación bastante antigua, el papel que desempeñan estas células durante la progresión de tumores aún no ha sido totalmente esclarecido. En el último tiempo se ha reportado que algunos mediadores producidos por mastocitos son capaces de promover la angiogénesis. Sin embargo, no existe información acerca del efecto que podrían ejercer estas células sobre otros eventos involucrados en la progresión tumoral, como la migración e invasión de células malignas. Los procesos de migración e invasión celular requieren de la expresión y funcionamiento de diversos componentes de sistemas proteolíticos. Numerosas evidencias indican que moléculas tales como el activador del plasminógeno tipo uroquinasa (uPA), su receptor de superficie celular (uPAR), el inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1 (PAI-1) y las metaloproteasas 2 (MMP-2) y 9 (MMP-9), se encuentran íntimamente asociadas con la adhesión, migración e invasión de células neoplásicas. Asimismo, se ha demostrado que la presencia de estos componentes en diversos cánceres humanos frecuentemente se relaciona con un mal pronóstico para el paciente. Considerando la alta incidencia de carcinomas invasores del cuello uterino en nuestro país, el objetivo de la presente investigación consistió en estudiar una posible relación entre los mastocitos presentes en tejidos cérvico-uterinos y el desarrollo de estas neoplasias. Los resultados obtenidos indican que los mastocitos son constituyentes normales del tejido cérvico-uterino, pero su número aumenta significativamente en lesiones clasificadas como carcinomas in situ (CIS) y carcinoma invasores. Los mastocitos presentes en tejidos normales y neoplasias intraepiteliales grados 1 y 2 (CIN 1 y 2) presentan aproximadamente la misma proporción de MCTC (mastocitos que contienen las proteasas triptasa y quimasa) y de MCT (mastocitos que sólo expresan triptasa). Sin embargo, en carcinomas invasores se produce un marcado predominio del fenotipo MCT por sobre el MCTC. Además, en carcinomas invasores, un considerable número de mastocitos del fenotipo MCT rodean e infiltran los tumores. En estos casos, los MCT que infiltran el tumor frecuentemente evidencian signos de degranulación y se encuentran asociados con la formación de los vasos sanguíneos que irrigan el tumor. La expresión de uPA y PAI-1 detectada en el estroma y el epitelio de CIS y carcinomas invasores es significativamente mayor a la observada en tejidos normales y CIN grados 1 y 2. En cambio, una elevada expresión de uPAR sólo se detecta en las células epiteliales transformadas de los carcinomas invasores. De esta manera, la expresión de uPA y PAI-1 en lesiones preinvasivas del cuello uterino podría ser considerada como un marcador con valor diagnóstico para identificar pacientes que presentan un riesgo aumentado de desarrollar una neoplasia cervical invasiva. La citoquina proinflamatoria TNF-, producida por mastocitos, regula la expresión uPAR, PAI-1 y MMP-9 en la línea celular de carcinoma invasor de cuello uterino humano SW756, lo que puede inducir un aumento en el potencial migratorio e invasivo de estas células. Los medios condicionados por mastocitos purificados desde cuello uterino humano producen un efecto similar al producido por TNF- en las células SW756. Puesto que los mastocitos secretan cantidades significativas de esta citoquina, los efectos observados pueder ser atribuidos, al menos en parte, a TNF-. Los resultados obtenidos en tejidos de cuello uterino humano y con las células SW756, sugieren que los mastocitos, a través de mediadores tales como la proteasa triptasa y TNF-, podrían favorecer la progresión del tumor al promover la neovasculación del tumor y la migración y la invasión de las células tumorales.
Cambios en las propiedades del receptor de glicina durante el desarrollo de neuronas espinales en cultivo. Efectos celulares de la activación.
(Universidad de Concepción., 2002) Tapia Amaro, Juan Carlos; Tapia Amaro, Juan Carlos
Evidencia experimental sugiere que el neurotransmisor inhibitorio glicina puede regular el crecimiento neurítico de neuronas embrionarias. Para evaluar esta hipótesis se propuso: 1) determinar cómo la activación del receptor de glicina en neuronas inmaduras afecta el crecimiento neurítico y el Ca+2 intracelular; 2) estudiar el patrón de expresión temporal de las subunidades del Rglicina en las neuronas y 3) estudiar la permeabilidad relativa del receptor de glicina a diferentes aniones durante el desarrollo in vitro de estas neuronas. A través de técnicas inmunocitoquímicas, electrofisiológicas y fluorimétricas encontramos que: las neuronas de 5 DIV expresaron fundamentalmente Rglicina y R-GABAA pero no receptores del tipo NMDA y no-NMDA. La activación de Rglicina y R-GABAA fue responsable de la actividad sináptica y de los incrementos de Ca+2i presentes en estas neuronas. Interesantemente, la neurotransmisión glicinérgica reguló la excitabilidad de la GABAérgica a través de un mecanismo de corto circuito neuronal (disminución de la Rm). La incubación crónica con glicina (100 μM, 48 hr) promovió el crecimiento neurítico de las neuronas, el que fue resistente a estricnina. Registros electrofisiológicos mostraron que la desactivación ó la inhibición del Rglicina son responsables del efecto trófico. Coaplicación de TTX, nimodipino y bicuculina inhibieron este efecto mientras que APV y CNQX no tuvieron efecto. Por lo tanto, postulamos que la actividad sináptica GABAérgica, regulada por la glicinérgica, es responsable del crecimiento neurítico en neuronas espinales de 5 DIV. Por otro lado, por medio de RT-PCR en neuronas espinales en cultivo encontramos que las subunidades del Rglicina presentaron un patrón de expresión temporal. La subunidad 2 fue expresada principalmente en neuronas de 5-7 DIV y no en neuronas >10 DIV. La mayor expresión de la subunidad 1 fue encontrada en neuronas de >10 DIV. La subunidad  presentó un patrón similar al de la subunidad 1, mayor en neuronas de 10-14 y 18-21 DIV que en las de 5-7 DIV. En resumen, postulamos que el Rglicina en neuronas de 5-7 DIV está formado por subunidades  mientras que en neuronas 10-14 por las subunidades . Mostramos también en esta tesis que: 1) el Eglicina varió de acuerdo a la actividad del Cl- extracelular en todas las etapas del desarrollo in vitro; 2) la permeabilidad de Rglicina a HCO3- relativa a Cl- fue de 0.10 en todas las etapas del desarrollo 3) y el rango de permeabilidades relativas SCN->NO3->I->Br->Cl->propionato->acetato->HCO3- no fue afectado por el desarrollo in vitro; 4) furosemida, inhibidor de KCC2, aumentó el Eglicina (~+20 mV) en neuronas 14 DIV y 5) el recambio del HEPES por HCO3- no afectó el Eglicina en neuronas inmaduras. De acuerdo con los resultados, postulamos que KCC2, y no cambios en la permeabilidad a HCO3-, sería responsable de la depolarización inducida por Rglicina en neuronas espinales embrionarias. En conclusión, postulamos que la neurotransmisión glicinérgica, la primera en ser expresada en neuronas espinales en cultivo, regula la excitabilidad y el crecimiento neurítico en neuronas de 5 DIV.
Bases genéticas de la resistencia de alto nivel a trimetoprim en cepas hospitalarias de Acinetobacter baumannii.
(Universidad de Concepción., 2002) Muñoz Campos, Marlene Roxana; González Rocha, Gerardo Enrique
Acinetobacter baumannii es un cocobacilo Gram negativo de importancia en el ambiente hospitalario, como agente etiológico de infecciones severas que afectan principalmente a pacientes inmunodeprimidos. Actualmente, gran parte de las cepas son resistentes a la mayoría de los agentes antibacterianos, limitándose las alternativas terapéuticas disponibles para el tratamiento de infecciones producidas por este microorganismo. Por ello, existe interés por aumentar el conocimiento acerca de las bases genéticas de los mecanismos de resistencia de esta bacteria. Trimetoprim es un agente antibacteriano utilizado en infecciones respiratorias y urinarias. Los genes que codifican la resistencia más frecuente a este compuesto son extracromosomales. Se han descrito 19 tipos de dihidrofolato reductasas (DHFRs) insusceptibles a trimetoprim, codificadas extracromosomalmente, que otorgan diferentes niveles de resistencia a este compuesto antibacteriano.El objetivo de la presente tesis fue investigar acerca de las bases genéticas de la resistencia de alto nivel a trimetoprim en cepas hospitalarias de A. baumannii. Se evaluaron los niveles de resistencia a trimetoprim mediante la técnica de dilución seriada en agar, se investigó la presencia de genes que codifican para 8 enzimas DHFRs insusceptibles a trimetoprim descritas en bacterias Gram negativas de elevada resistencia a trimetoprim y la presencia de integrones clase 1 y clase 2 mediante la técnica de hibridación por colonia con oligonucleótidos específicos. Con el objetivo de corroborar los resultados obtenidos en las hibridaciones, se seleccionaron cepas al azar y mediante la 2 técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), se amplificó el gen dhfrIa y el de las integrasas clase 1 y clase 2 utilizando partidores específicos en cada caso. Para determinar si en las cepas que presentan ambos genes (dhfrIa e intI2) el gen dhfrIa se encontraba inserto en el integrón se seleccionaron 17 cepas al azar y se utilizó la técnica PCR con partidores IntI2F/dhfrAR. La mayoría de las cepas estudiadas (94 %) fue resistente a trimetoprim (CMI  32 µg/ml) y la mitad de ellas (56 %) presentó resistencia de alto nivel a este compuesto (1.024 µg/ml). En 64 cepas con resistencia de alto nivel a trimetoprim se investigó la presencia de 8 genes que codifican para enzimas DHFRs insusceptible a trimetoprim. Los genes detectados fueron dhfrIa, dhfrIb, dhfrIII, dhfrV, dhfrVI, dhfrVIII, dhfrX y dhfrXII. El 64,1 % (n=41) de las cepas estudiadas hibridó con la sonda para el gen dhfrIa, el 10,9 % hibridó con sondas para genes de otras DHFR y el 25 % de las cepas (n=16) no hibridó con ninguno de los oligonucleótidos. Las cepas estudiadas no hibridaron con las sondas para los genes dhfrIIIa, dhfrVIII y dhfrXII. De acuerdo a los resultados de los experimentos de hibridación con sondas específicas para integrón clase 1 y clase 2, 78,1 % de las cepas (n=64) presentó integron clase 2 y sólo 1,6 % (n=1) presentó integrón clase 1,en tanto, 20,3 % de las cepas no hibridó con ninguna de las sondas utilizadas en este trabajo para la detección de integrones. Un alto porcentaje (48, 4 %) presentó el gen para dhfrIa y el integrón clase 2; 20,3 % presentó sólo el gen dhfrIa y 28,1 % sólo el integron clase 2 y finalmente sólo 3,1 % de las cepas no presentó ninguno de los genes. El alto porcentaje de cepas que presentan el gen dhfrIa (64,1%) confirma que los altos niveles de resistencia a trimetoprim se debe, principalmente, a la síntesis de una dihidrofolato 3reductasa adicional insuceptible a trimetoprim, siendo éste uno de los mecanismos más frecuentemente descritos en otros bacilos Gram negativos. Por otra parte, en las cepaestudiadas mediante la técnica de PCR (con partidores IntI2F/dhfrAR), se encontró que en 90,9% (n=10) de ellas, el gen dhfrIa se encontraba inserto en el integrón clase 2, lo que sugiere que el gen dhfrIa podría encontrarse principalmente asociado a estructuras genéticas relacionadas al transposon Tn7, (integrón clase 2) integradas al cromosoma, y que de esta forma favorecen su diseminación. Finalmente, el conocimiento de los mecanismos de resistencia bacteriana y su diseminación es información fundamental, que permitirá conocer los factores que favorecen la aparición de cepas multiresistentes, problema que actualmente agrava e impide el tratamiento de las infecciones bacterianas, y el rol de estos microorganismos como un reservorio o vehículo de transmisión de genes de resistencia a agentes antibacterianos utilizados en el ambiente hospitalario.
Actividad antibacteriana del vino tinto (cepas pais y cabernet) y de extractos de escobajos y de frutos sobre Helicobacter pylori. efecto antibacteriano del trans-resveratrol.
(Universidad de Concepción., 2002) Daroch Mendoza, Fabiola Macarena; García Cancino, Apolinaria del Rosario
En los últimos años se han estudiado numerosos compuestos del vino tinto y de sus derivados, cómo es el caso de las uvas; involucrados en la quimio prevención de algunos tipos de cáncer. Esto es, debido a las innumerables propiedades antioxidantes que se le han otorgado a algunos compuestos fenólicos encontrados en el vino, especialmente a los denominados vinos “negros” o tintos. Si bien es cierto se conoce bastante sobre la acción antioxidante de los compuestos fenólicos del vino, y escasamente se han explorado otras propiedades beneficiosas para la salud, como es el caso de la actividad antibacteriana de estos compuestos. Este es el caso del resveratrol, un compuesto fenólico sintetizado por la vid, el cual es considerado un metabolito secundario cuya síntesis se ve incrementada cuando la planta se encuentra en condiciones de estrés; es por esa razón que se le considera una fitoalexina. Por lo tanto, considerando que Chile es un País con alto índice de enfermedades gastroduodenales (gastritis tipo B, úlceras y cáncer gástrico), provocadas en un alto porcentaje por Helicobacter pylori, y además por ser un País productor de vinos, es importante encontrar en esta fuente, una terapia alternativa contra la erradicación de H. pylori que disminuya los efectos secundarios de la terapia, evitando de esta manera el aumento de la resistencia frente a los antimicrobianos actualmente en uso. Para este propósito, se analizó la actividad antibacteriana de extractos activos de vinos tintos varietal Pais (nativo) y varietal Cabernet (introducido), y de sus uvas separadas en escobajo, hollejo y pulpa más semilla. Posteriormente se procedió a la identificación y cuantificación de trans-resveratrol mediante Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), con el fin de determinar si la concentración de este compuesto presente en los extractos, es determinante en la actividad anti H. pylori y, además, determinar en que varietal se encuentra la mayor concentración de trans-resveratrol. Por otra parte, se analizó el efecto de trans-resveratrol sobre H. pylori, mediante el estudio morfológico de la célula. Estos estudios fueron realizados por Microscopía de epifluorescencia y por Microscopía de barrido, a distintas concentraciones de trans resveratrol (2, 4, 10, 25 y 50g/ml) y a distintos tiempos (0, 24, 48, 72h).Los resultados presentados por la actividad anti H. pylori de los extractos activos de uvas y vinos varietal Pais y varietal Cabernet fueron diversos, encontrándose una mayor actividad antibacteriana en el varietal Pais que en el varietal Cabernet. Con relación a los resultados presentados por los extractos de uvas (escobajo, hollejo y pulpa más semilla); el escobajo y la pulpa más semilla de ambos varietales presentaron la mayor actividad anti H. pylori, viéndose incrementada esta actividad para el varietal Pais. Esta actividad también se vio incrementada en los extractos de vinos pertenecientes al varietal Pais, cuyos halos de inhibición fueron superiores a los encontrados por el varietal Cabernet (30/20mm de diámetro respectivamente). Los resultados de la actividad antibacteriana, concuerdan con el análisis de cuantificación de trans-resveratrol mediante HPLC, en la cual las concentraciones más altas del compuesto se presentaron en los extractos de vino del varietal Pais, con una concentración de 1,8mg/L para el varietal Pais y de 0,68mg/L para el varietal Cabernet. Por otra parte, el efecto del trans-resveratrol sobre las células de H. pylori, se relaciona estrechamente con la morfología de la bacteria, observándose cambios morfológicos a medida que se incrementan las concentraciones subinhibitorias, cercanas a la CMI. Los cultivos presentaron formas cocoides a concentraciones inferiores a 10g/ml y formas filamentosas a concentraciones superiores a ésta.Los ensayos realizados con el extracto activo del vino Pais, presentaron los mismos resultados mostrados por H. pylori cuando son incubados a 50g/ml del compuesto, observándose claramente la formación de filamentos, sugiriendo que el trans-resveratrol es uno de los principales compuestos activos del vino involucrado en la actividad anti H. pylori. Respecto a los resultados relacionados con la morfología de la bacteria, se observa que H. pylori incubado en un medio libre de transresveratrol, pero previamente expuesto a éste, presenta una reversibilidad morfológica a través del tiempo, volviendo a su morfología inicial. Por lo anterior, los extractos de vinos y uvas presentaron actividad anti H. pylori, la que estaría estrechamente relacionada con el trans-resveratrol y las concentraciones de éste en los extractos activos, aunque se supone que además existen otros compuestos en el vino que estarían incrementando la actividad anti H. pylori. En lo que respecta al efecto del trans-resveratrol como agente antibacteriano, queda de manifiesto que el compuesto en estudio afecta en forma reversible la morfología de la bacteria, sugiriendo que el transresveratrol pudiera estar afectando algún componente celular involucrado en la morfología de H. pylori
Inmovilización de archaeas metanogénicas sobre soportes inertes para favorecer la metanogénesis en ambientes sulfidogénicos.
(Universidad de Concepción., 2002) Vidal Alvarez, Roberto Mauricio; Urrutia Briones, Homero
En los procesos de digestión anaerobia dos comunidades, Archaeas y Bacterias, determinan el último paso en la digestión de nutrientes utilizables, las archaeas productoras de metano (APM) y las bacterias reductoras de sulfato (BRS). El grupo bacteriano más eficiente en la utilización de los sustratos presentes tendrá mayor influencia en el producto final del proceso anaeróbico de mineralización sea éste metano o sulfuros (HS-, S= ó H2S) (Visser et al., 1993a). El tratamiento de efluentes de la industria pesquera presenta dos grandes limitantes para el proceso metanogénico. La primera, está asociada a la elevada concentración de sulfato (1,2-2,1 g/l) de estos efluentes (Aspé et al., 1994), derivando el metabolismo celular hacia la formación de un ambiente sulfidogénico en el cual la actividad de archaeas metanogénicas se ve fuertemente disminuida (Visser et al., 1993b). La segunda es la competencia entre APM y BRS por hidrógeno y acetato, las últimas, con mayor afinidad metabólica por ambos sustratos (Lovley et al., 1982; Isa et al., 1986b; Lovley & Klug, 1983a; Harada et al., 1994). En este sentido, la utilización de soportes en reactores anaerobios de biomasa retenida, además de ser una modificación tecnológica destinada a reducir los tiempos de residencia hidráulicos y a proporcionar superficies para la inmovilización celular, evitando la pérdida de biomasa activa, privilegia indirectamente la mayor capacidad adherente descrita para archaeas metanogénicas. Esto, en estos nuevos biodigestores, se traduce en un lavado constante y selectivo de bacterias reductoras de sulfato (Isa et al.,1986a,b). Por lo anterior, resulta interesante caracterizar cinéticamente la formación de biopelículas por archaeas metanogénicas y bacterias reductoras de sulfato que utilizan sustratos comunes (hidrógeno y acetato), y determinar si la competencia entre APM y BRS en estos reactores es o no gobernada principalmente por las propiedades de adherencia y la cinética de crecimiento celular en biopelículas. Por otro lado, una ventaja natural que proporcionan los vertidos pesqueros para la metanogénesis, es su concentración de aminas metiladas. Se ha observado que estos compuestos pueden constituir sustratos exclusivos para archaeas metanogénicas que habitan sedimentos marinos y cuya conversión a metano no es afectada por la presencia o ausencia de iones sulfato (Oremland et al., 1982 a,b; Winfrey & Ward, 1983). De esta forma, el proceso metanogénico podría tener lugar en sedimentos marinos a partir del catabolismo de sustratos distintos a hidrógeno y acetato (Sowers & Ferry, 1983; Barret & Kwan, 1985; King, 1988). Por lo tanto, es importante analizar, dentro de la comunidad metanogénica, la capacidad adherente de grupos metilaminotróficos, que por la presencia de aminas metiladas en el efluente pesquero podría sustentar en gran medida la metanogénesis. Por último, existe la posibilidad de bioaumentar el inóculo de partida, es decir, suplementar externamente con archaeas metanógenas enriquecidas selectivamente, con el objeto de intensificar la actividad biológica residente, e incrementar así la tasa de metanogénesis con alteración mínima de las comunidades microbianas existentes, reduciendo el periodo de puesta en marcha de reactores de biomasa retenida. Con el desarrollo de esta investigación se pretende dar respuesta a las siguientes interrogantes: A. ¿ Favorece la incorporación de soportes, en reactores anaerobios que depuran efluentes pesqueros, la inmovilización de archaeas metanogénicas por sobre bacterias reductoras de sulfato? B. ¿ Existen soportes que favorecen la mayor retención celular? C. ¿ Afectan las variaciones de pH, salinidad y DQO del sustrato, la cinética de adherencia de grupos tróficos metanogénicos y reductores de sulfato inmovilizados sobre los soportes? D. ¿ Se puede reducir el tiempo requerido en la puesta en marcha de un reactor anaerobio de biomasa retenida al bioaumentar lodos anaerobios con comunidades bacterianas, incluídos metanógenos adherentes y resistentes a fluctuaciones fisico-químicas del vertido pesquero?.
The importance of glycine receptor clustering in the functional maturation of spinal synapses.
(Universidad de Concepción., 2002) Zundert, Brigitte van; Aguayo Hernández, Luis Gerardo
Considerando abundantes estudios bioquímicos e inmunocitoquímicos se ha generado un modelo que describe la estructura de la sinápsis glicinérgica en neuronas espinales. Así, se postula que el citoesqueleto, a través la proteína periférica geferina, ancla el receptor de glicina (R-Gli) a sitios específicos de la membrana post-sináptica. Al mismo tiempo que el R-Gli forma estas agrupaciones, la transmisión sináptica inhibitoria espontánea (mIPSC) aumenta. Además, varias de las propiedades fisiológicas de la corriente activada por glicina (Iglicina) son modificadas, incluyendo su sensibilidad a glicina y su regulación por proteína G. A través de la técnica ´whole-cell patch-clamp´ y mediante análisis de microscopía confocal, hemos estudiado sí el agrupamiento de los R-Gli en la membrana postsináptica por geferina y el citoesqueleto regula los cambios fisiológicos del receptor durante el desarrollo de la médula espinal. Uno de los principales resultados de este tesis es que los microtúbulos regulan la función y estructura de las agrupaciones sinápticas del R-Gli en una forma dependiente del estado del desarrollo. Así, se encontró que la aplicación aguda de colchicina disminuía significativamente la amplitud de mIPSC glicinérgicas (30%) en neuronas inmaduras (5-7 DIV), mientras que no tenía efectos sobre neuronas maduras (15-17 DIV). Análisis cinéticos y el bloqueo de mIPSC glicinérgicas con picrotoxina, reveló la presencia de la forma 2 neonatal (eventos lentos) y 1 adulta (eventos rápidos) del R-Gli. La depolimerización de microtúbulos afectó preferencialmente a receptores 2 sinápticos. Luego de la maduración sináptica se encontró que principalmente la forma adulta del R-Gli permanecía en la membrana postsináptica y que el tratamiento con colchicina no fue efectivo en este estado. En forma similar a lo observado para microtúbulos, encontramos que citocalasina-D producía alteraciones en las propiedades fisiológicas de la transmisión glicinérgica, que dependía del grado de maduración de las neuronas espinales, modificando los R-Gli postsinápticos sólo en células inmaduras. La aplicación intracélular de citocalasina-D y latrunculina-A en neuronas inmaduras, aumentó significativamente (190%) la frecuencia de las mIPSC glicinérgicas, sin variar la amplitud de los eventos. Aunque ambas drogas son membrana permeable, la aplicación extracélular de citocalasina-D y latrunculina-A resultó en una importante reducción de la transmisión sináptica total y glicinérgica. Estos resultados indican que los filamentos pre y postsinápticos están involucrados en el mantenimiento de la transmisión glicinérgica en neuronas espinales inmaduras Con el objetivo de bloquear la formación de agrupaciones de R-Gli sin alterar el citoesqueleto, cultivos de neuronas espinales fueron tratados con un oligonucleótido antisentido para geferina. Este tratamiento resultó en la pérdida de las agrupaciones de R-Gli sinápticas lo cual se correlacionó con una reducción casi completa en la transmisión glicinérgica. Sin embargo, el tratamiento tanto con el oligonucleótido antisentido, como con las drogas depolimerizantes del citoesqueleto (utilizados en forma aguda y crónica), fueron incapaces de alterar el ´´rundown´´ de las corrientes evocadas por glicina o la sensibilidad de la Iglicina a glicina, estricnina o picrotoxina. Al cuantificar el conjunto de los resultados obtenidos, nos permite estimar que gran parte (~65%) de la Iglicina se debe a la activación de los receptores extrasinápticos y por lo tanto concluimos que la farmacología y la estabilidad funcional de los R-Gli extrasinápticos no dependen de una interacción con geferina y el citoesqueleto. Finalmente, analizamos si existía un ´´cross-talk´´ entre el R-Gli y proteínas G en la membrana postsináptica. Fue así como encontramos que en células tratados con el oligonucleótido antisentido para geferina, la aplicación de GTP--S a través de la pipeta de patch no fue capaz de potenciar a Iglicina. Por otro lado, estudios de transmisión glicinérgica revelaron que GTP--S producía un aumento de dos veces en la constante de decaimiento de los eventos rápidos (1), pero no de los eventos lentos (2). En conjunto, estos resultados sugieren que existiría un cross-talk entre un receptor asociados a proteínas G (GPCR) y el R-Gli 1 postsináptico, interacción que se ve favorecida durante desarrollo. En conclusión, los resultados presentados en esta tesis indican que dependiendo del estado de maduración de las neuronas y de la expresión de las diferentes subunidades de R-Gli, la organización de los microtúbulos y microfilamentos regula la transmisión glicinérgica en neuronas de médula espinal. Además, nuestros estudios nos permiten postular que la interacción del R-Gli con geferina y el citoesqueleto no sólo facilita el anclaje de los receptores frente a los terminales presinápticos, sino que también posibilita la formación de microdominios con otras moléculas involucradas en la transducción de señales, incluyendo receptores metabotrópicos.

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