Facultad de Ciencias Biológicas

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Abatimiento de la toxicidad de compuestos arsenicales presentes en suelos agrícolas, a través de un sistema de tratamiento biológico aeróbico secuencial.
(Universidad de Concepción, 2018) Ravanal Pineda, Javiera Francisca; Campos Araneda, Víctor Leandro
Durante muchos años, compuestos orgánicos que contienen arsénico en su estructura (organoarsenicales) han sido utilizados como aditivos alimenticios en la industria avícola. Utilizar el estiércol de las aves como fertilizante en cultivos, es una práctica común que aumenta la concentración de arsénico en los suelos, ya que los organoarsenicales se liberan inalterados en las heces de los animales. En la agricultura, durante décadas se utilizaron pesticidas inorgánicos y orgánicos de arsénico en cultivos. El impacto generado en este período ha sido el aumento de la concentración de arsénico en los suelos. Actualmente aún se permite el uso de algunos pesticidas como el metanoarsenato monosódico y en países asiáticos aún se utilizan compuestos organoarsenicales en la industria avícola. En el suelo, los compuestos organoarsenicales sufren transformaciones mediadas por microorganismos produciendo arsénico inorgánico, principalmente arsenito (As(III)) y arseniato (As(V)), siendo el primero más tóxico, soluble y móvil. Debido a su naturaleza, estas especies de arsénico pueden lixiviar o movilizarse por escorrentía, llegando a fuentes hidrológicas de uso humano y generar problemas sanitarios, pues el arsénico es carcinogénico y se asocia a enfermedad cardiovascular, hiperqueratosis y déficit neurocognitivo. La transformación biológica de organoarsenicales mediada por microorganismos, es una alternativa para el abatimiento de estos compuestos desde el suelo y/o el agua. Sin embargo, se genera arsenito y arseniato como productos de estas transformaciones por lo que es necesario desarrollar alternativas que logren abatir tanto los compuestos organoarsenicales, como el arsénico inorgánico generado. La precipitación de carbonato de calcio mediada por microorganismos (MICP), específicamente por bacterias ureolíticas, es un proceso mediante el cual bacterias metabolizan la urea generando amonio y bicarbonato, provocando un aumento del pH en el medio extracelular. Si existen iones calcio en el medio, se desencadena la precipitación de carbonato de calcio o Calcita, que es un mineral con la capacidad de absorber y/o co-precipitar arsénico inorgánico, principalmente arseniato.El objetivo de esta investigación fue implementar un sistema de tratamiento biológico aeróbico secuencial para el abatimiento de la toxicidad de compuestos arsenicales. Para ello, se caracterizó la reducción de compuestos organoarsenicales a arsénico inorgánico, por un consorcio bacteriano utilizando los parámetros cinéticos obtenidos mediante curvas de crecimiento, y curvas de reducción de mediante la detección de arsénico inorgánico. Luego, se caracterizó la producción de calcita y la oxidación/co-precipitación de arsénico inorgánico por Pseudomonas arsenicoxydans en un medio de cultivo modificado para la MICP utilizando los parámetros cinéticos obtenidos mediante curvas de crecimiento en estado planctónico y sésil. Finalmente, se implementó un sistema de tratamiento biológico aeróbico secuencial a escala de laboratorio, para estudiar el abatimiento de la toxicidad de arsénico de un afluente artificial suplementado con arsénico orgánico. Este sistema de tratamiento se dividió en 2 etapas, la primera fue un sistema discontinuo dónde se cultivó el consorcio bacteriano aeróbico con el fin de reducir los compuestos organoarsenicales roxarsona, nitarsona y metanoarsenato monosódico, hasta arsénico inorgánico. En la segunda etapa, el efluente del primer sistema fue alimentado en un sistema semi-continuo en el que se cultivó P. arsenicoxydans en un medio modificado para la MICP, con el fin de abatir el arsénico presente en el efluente mediante la simultánea oxidación de arsenito y co-precipitación de arsénico en la calcita producida a través de MIPC. La toxicidad del efluente final fue evaluada a través de un ensayo de viabilidad con células HUVEC. Los resultados demuestran que a las 144 h de operación de la primera etapa del sistema de tratamiento se alcanzó un 96,70% de transformación de compuestos organoarsenicales a arsénico inorgánico con una velocidad máxima de aparición de arsénico inorgánico de 0,033 ± 0,001 mg·l-1 ·h -1 . El efluente de este reactor fue diluido al 12% v/v y usado para alimentar el biorreactor de la segunda etapa. A partir de las 72 h de operación de esta segunda etapa, la remoción de arsénico del medio líquido fue de 100% con una velocidad de remoción de 0,033 ± 8,750e-007 mg·l-1 ·h -1 . El 99,3 ± 0,51% de las células HUVEC fue viable al ser expuestas al efluente final del sistema de tratamiento. Se puede concluir que el sistema de tratamiento biológico es capaz de abatir la toxicidad de compuestos arsenicales orgánicos e inorgánicos presentes en los afluentes ensayados, utilizando el sistema de tratamiento aeróbico secuencial con biotecnología de oxidación de arsenito y coprecipitación de calcita-arsénico.
Acciones de alcaloides de Gelsemium en receptores inhibitorios y en la función sináptica.
(Universidad de Concepción, 2023) Marileo Córdova, Ana María; Yévenes Crisóstomo, Gonzalo Enrique
Los receptores ionotrópicos de GABA del tipo A (GABAARs) y de glicina (GlyRs) son fundamentales para la inhibición sináptica en el sistema nervioso central (SNC). En la sinapsis, los neurotransmisores GABA y glicina activan GlyRs y GABAARs postsinápticos, permitiendo el influjo de iones cloruro y la hiperpolarización del potencial de membrana, controlando así la excitabilidad neuronal. Alteraciones en la neurotransmisión GABAérgica o glicinérgica se han asociado con trastornos prevalentes del SNC tales como epilepsia, depresión, ansiedad, dolor crónico, entre otros. La relevancia de la función GABAérgica ha sido resaltada por la buena eficacia de varios fármacos de uso clínico que poseen como blanco principal a los GABAARs. Por el contrario, actualmente no hay fármacos que tengan como blanco especifico a los GlyRs. Con relación a la farmacología de estos receptores, es importante mencionar que se han identificado diversos moduladores de GlyRs y GABAARs a partir de plantas y hongos. En este contexto, los alcaloides de las plantas de Gelsemium han demostrado efectos beneficiosos en diversas patologías del SNC. Sin embargo, estos compuestos han mostrado una alta toxicidad intrínseca, con un perfil toxicológico que sugiere posibles efectos a nivel neuronal. Los blancos moleculares de estos alcaloides en el SNC aún no están definidos. No obstante, existen estudios que han sugerido la posible participación de GlyRs y GABAARs en sus acciones. Este trabajo de tesis logró definir y caracterizar la actividad de los cuatro principales alcaloides del Gelsemium (gelsemina, gelsevirina, koumina y humantenmina) en GABAARs y GlyRs, y en la función sináptica de neuronas corticales. Utilizando registros electrofisiológicos de GABAARs y GlyRs recombinantes, se demostró que gelsemina, koumina y gelsevirina inhibieron las corrientes glicinérgicas y GABAérgicas a concentraciones micromolares. El análisis de las concentraciones inhibitorias medias (IC50) y del porcentaje de máxima inhibición mostró que los GlyRs poseen una sensibilidad mayor a estos alcaloides que los GABAARs. Contrariamente, humantenmina no modificó significativamente la actividad de GABAARs y GlyRs. Utilizando receptores quiméricos y mutados en combinación con técnicas bioinformáticas, se logró determinar que dos mutaciones puntuales en el sitio ortostérico fueron suficientes para generar GlyRs insensibles a gelsemina, koumina y gelsevirina, lo que sugiere que las acciones de estos alcaloides dependen únicamente de su unión al sitio ortostérico. Por otra parte, en el contexto de la sinapsis, se logró establecer que gelsemina disminuyó la frecuencia de los eventos sinápticos GABAérgicos y glutamatérgicos en miniatura de neuronas corticales, sin modificar significativamente la amplitud. De modo interesante, se obtuvieron resultados similares utilizando el alcaloide humantenmina, demostrando que la inhibición directa de GlyRs o GABAARs no es necesaria para los efectos sinápticos. Finalmente, estudios de fluorometría de Ca2+ intracelular lograron demostrar que gelsemina disminuyó la frecuencia de las señales espontaneas de Ca2+, sugiriendo que gelsemina, y posiblemente otros alcaloides del Gelsemium, modulan la sinapsis a través de la interacción con blancos moleculares presinápticos. En conjunto, los resultados de esta tesis proporcionan información novedosa sobre las acciones funcionales y los sitios moleculares de los principales alcaloides del Gelsemium en GABAARs y GlyRs. El perfil de actividad de gelsemina, koumina y gelsevirina en estos canales iónicos sugiere que estas interacciones pudieran estar asociadas a su toxicidad. Por el contrario, los resultados encontrados para humantemina y gelsemina a nivel neuronal sugieren que su actividad biológica estaría relacionada con blancos moleculares presinápticos, diferentes a GABAARs y GlyRs. Estas acciones sinápticas proporcionan una hipótesis novedosa para explicar los diversos efectos beneficiosos de los alcaloides del Gelsemium. En resumen, los resultados de este trabajo contribuyen a dilucidar, al menos en parte, los mecanismos involucrados en las acciones beneficiosas y tóxicas de los alcaloides del Gelsemium a nivel del SNC de mamíferos.
Actividad anti-Helicobacter pylori de Gunnera tinctoria (nalca).
(Universidad de Concepción, 2015) Hebel Gerber, Sonja; Pastene Navarrete, Edgar Rafael
Helicobacter pylori (H. pylori) es una bacteria Gram negativa bacilar y espiralada, ureasa y catalasa positiva. Es un microorganismo patógeno con un 50% en promedio de prevalencia mundial, siendo mayor en los países que están subdesarrollados y en vías de desarrollo y afectando mayoritariamente a población con nivel socioeconómico bajo y que viven en condiciones de hacinamiento. En Chile la prevalencia es de un 73%. H. pylori infecta al epitelio gástrico y su presencia está relacionada con patologías gástricas como gastritis, linfoma de MALT, úlcera péptica y cáncer gástrico, siendo la bacteria considerada como un carcinógeno definitivo de cáncer gástrico (tipo I) por la Organización Mundial de la Salud. El patógeno logra infectar y permanecer en el epitelio gástrico gracias a sus factores de virulencia, los cuales incluyen la enzima ureasa, la cual neutraliza el pH ácido del estómago y su flagelo, el cual le permite movilizarse hasta su sitio de infección. Hasta el momento no hay vacunas exitosas disponibles contra la bacteria y la terapia farmacológica tiene una tasa de fracaso del 20%, lo que ha generado resistencia antibiótica. Esta terapia es costosa y larga, durando en promedio entre 10 y 14 días y utilizándose entre 3 y 4 medicamentos al mismo tiempo, lo que muchas veces provoca el abandono de la terapia por los efectos adversos que genera. Hay evidencia de que productos naturales logran afectar a la bacteria. Uno de ellos es Gunnera tinctoria (nalca), la cual se observó en los Laboratorios de Patogenicidad Bacteriana y Farmacognosia que tenían acción contra H. pylori, lo que motivó la realización de esta investigación, la cual tuvo como objetivos obtener un extracto total desde pecíolos de nalca y fraccionarlo en forma bio-dirigida en base a un screening de su actividad contra H. pylori, identificar las principales moléculas bioactivas presentes en el extracto total y fracciones de la planta, determinar la actividad del extracto total y de las fracciones de G. tinctoria sobre el crecimiento, ureasa,movilidad y morfología de la bacteria, determinar si había una relación entre las moléculas identificadas en el extracto total y las fracciones de G. tinctoria y su efecto anti-H. pylori y establecer una relación entre la magnitud y el mecanismo mediante el cual extractos de nalca de elaboración propia afectaban de forma in vitro a H. pylori. Para llevar a cabo esta tesis se trabajó con peciolos de nalca, desde donde se obtuvo un extracto total, el cual fue fraccionado. Se determinó si el extracto total y las fracciones de G. tinctoria tenían acción sobre las cepas ATCC45504 y J99 de H. pylori por medio de ensayos como ensayo de difusión en agar, Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) en microdilución en caldo, Concentración Mínima Bactericida (CMB), curva de muerte, ensayo de la uresa, ensayo de movilidad y microscopía electrónica de transmisión, todos ellos dirigidos a determinar si la planta estaba afectando el crecimiento in vitro, movilidad, ureasa o ultraestructura bacteriana. Para determinar que moléculas podrían estar generando los efectos antibacterianos es que se utilizó cromatografía líquida de alta resolución acoplada a espectrometría de masas. Se determinó que el extracto total y las fracciones de nalca tienen una acción bactericida con la menor CMI y CMB de 32 μg/mL. Además en la curva de muerte la fracción 1 actúa más rápido que el antibiótico control. En el ensayo de ureasa se encontraron IC50 bajas, siendo la menor de 13,5 μg/mL. En cuanto a la movilidad solo una de las cepas bacterianas se vio afectada por dos de las fracciones. Resultados mucho más favorables se obtuvieron con microscopía electrónica, donde se determinó que el extracto total y fracciones de nalca estarían interactuando con la membrana del patógeno, desestabilizándola y lisando y matando finalmente a la bacteria. Los resultados encontrados en esta tesis indican que G. tinctoria ejerce un efecto anti-H. pylori y con estudios posteriores sobre líneas celulares, modelo animal y estudios clínicos, se podría pensar a largo plazo en comercializar los extractos de nalca.
Actividad antibacteriana del vino tinto (cepas pais y cabernet) y de extractos de escobajos y de frutos sobre Helicobacter pylori. efecto antibacteriano del trans-resveratrol.
(Universidad de Concepción, 2002) Daroch Mendoza, Fabiola Macarena; García Cancino, Apolinaria del Rosario
En los últimos años se han estudiado numerosos compuestos del vino tinto y de sus derivados, cómo es el caso de las uvas; involucrados en la quimio prevención de algunos tipos de cáncer. Esto es, debido a las innumerables propiedades antioxidantes que se le han otorgado a algunos compuestos fenólicos encontrados en el vino, especialmente a los denominados vinos “negros” o tintos. Si bien es cierto se conoce bastante sobre la acción antioxidante de los compuestos fenólicos del vino, y escasamente se han explorado otras propiedades beneficiosas para la salud, como es el caso de la actividad antibacteriana de estos compuestos. Este es el caso del resveratrol, un compuesto fenólico sintetizado por la vid, el cual es considerado un metabolito secundario cuya síntesis se ve incrementada cuando la planta se encuentra en condiciones de estrés; es por esa razón que se le considera una fitoalexina. Por lo tanto, considerando que Chile es un País con alto índice de enfermedades gastroduodenales (gastritis tipo B, úlceras y cáncer gástrico), provocadas en un alto porcentaje por Helicobacter pylori, y además por ser un País productor de vinos, es importante encontrar en esta fuente, una terapia alternativa contra la erradicación de H. pylori que disminuya los efectos secundarios de la terapia, evitando de esta manera el aumento de la resistencia frente a los antimicrobianos actualmente en uso. Para este propósito, se analizó la actividad antibacteriana de extractos activos de vinos tintos varietal Pais (nativo) y varietal Cabernet (introducido), y de sus uvas separadas en escobajo, hollejo y pulpa más semilla. Posteriormente se procedió a la identificación y cuantificación de trans-resveratrol mediante Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), con el fin de determinar si la concentración de este compuesto presente en los extractos, es determinante en la actividad anti H. pylori y, además, determinar en que varietal se encuentra la mayor concentración de trans-resveratrol. Por otra parte, se analizó el efecto de trans-resveratrol sobre H. pylori, mediante el estudio morfológico de la célula. Estos estudios fueron realizados por Microscopía de epifluorescencia y por Microscopía de barrido, a distintas concentraciones de trans resveratrol (2, 4, 10, 25 y 50g/ml) y a distintos tiempos (0, 24, 48, 72h).Los resultados presentados por la actividad anti H. pylori de los extractos activos de uvas y vinos varietal Pais y varietal Cabernet fueron diversos, encontrándose una mayor actividad antibacteriana en el varietal Pais que en el varietal Cabernet. Con relación a los resultados presentados por los extractos de uvas (escobajo, hollejo y pulpa más semilla); el escobajo y la pulpa más semilla de ambos varietales presentaron la mayor actividad anti H. pylori, viéndose incrementada esta actividad para el varietal Pais. Esta actividad también se vio incrementada en los extractos de vinos pertenecientes al varietal Pais, cuyos halos de inhibición fueron superiores a los encontrados por el varietal Cabernet (30/20mm de diámetro respectivamente). Los resultados de la actividad antibacteriana, concuerdan con el análisis de cuantificación de trans-resveratrol mediante HPLC, en la cual las concentraciones más altas del compuesto se presentaron en los extractos de vino del varietal Pais, con una concentración de 1,8mg/L para el varietal Pais y de 0,68mg/L para el varietal Cabernet. Por otra parte, el efecto del trans-resveratrol sobre las células de H. pylori, se relaciona estrechamente con la morfología de la bacteria, observándose cambios morfológicos a medida que se incrementan las concentraciones subinhibitorias, cercanas a la CMI. Los cultivos presentaron formas cocoides a concentraciones inferiores a 10g/ml y formas filamentosas a concentraciones superiores a ésta.Los ensayos realizados con el extracto activo del vino Pais, presentaron los mismos resultados mostrados por H. pylori cuando son incubados a 50g/ml del compuesto, observándose claramente la formación de filamentos, sugiriendo que el trans-resveratrol es uno de los principales compuestos activos del vino involucrado en la actividad anti H. pylori. Respecto a los resultados relacionados con la morfología de la bacteria, se observa que H. pylori incubado en un medio libre de transresveratrol, pero previamente expuesto a éste, presenta una reversibilidad morfológica a través del tiempo, volviendo a su morfología inicial. Por lo anterior, los extractos de vinos y uvas presentaron actividad anti H. pylori, la que estaría estrechamente relacionada con el trans-resveratrol y las concentraciones de éste en los extractos activos, aunque se supone que además existen otros compuestos en el vino que estarían incrementando la actividad anti H. pylori. En lo que respecta al efecto del trans-resveratrol como agente antibacteriano, queda de manifiesto que el compuesto en estudio afecta en forma reversible la morfología de la bacteria, sugiriendo que el transresveratrol pudiera estar afectando algún componente celular involucrado en la morfología de H. pylori
Actividad antibacteriana y biocompatibilidad de nanopartículas funcionalizadas como desinfección en neoterapias endodónticas.
(Universidad de Concepción, 2023) Jerez Olate, Christian Andrés; Sánchez Sanhueza, Gabriela
Introducción: En endodoncia, existen múltiples infecciones de origen bacteriano, que provocan una enfermedad común conocida como periodontitis apical. Por consiguiente, el objetivo principal de los tratamientos en endodoncia es tratar o prevenir el desarrollo de lesiones perirradiculares asociadas a esta enfermedad, mediante la erradicación del componente bacteriano durante la preparación quimio-mecánica. Sin embargo, la tasa de éxito de dientes con estas lesiones alcanza un 85%, disminuyendo a un 68% en los retratamientos. En consecuencia, existe una búsqueda constante de nuevos materiales que puedan contribuir a mejorar la tasa de éxito de la terapia endodóntica. Desde esta perspectiva, basándonos en las beneficiosas propiedades y características antibacterianas y de biocompatibilidad de las nanopartículas metálicas, estas pueden ser una alternativa o coadyuvante a los protocolos actuales como nuevas terapias de desinfección. Objetivo: El objetivo de este estudio fue evaluar la actividad antibacteriana y la biocompatibilidad de nanogeles nanoestructurados de cobre y plata combinados con una matriz polimérica de PVA/PVP. Metodología: En primer lugar, se realizó un screening de la actividad antibacteriana de los nanogeles mediante la determinación de la cinética de muerte por el test de contacto directo frente a Enterococcus faecalis, seleccionando los nanogeles con mayor actividad antibacteriana. En segundo lugar, utilizando un modelo de diente ex vivo con una biopelícula bacteriana multiespecie madura de 21 días, se cuantificó la viabilidad bacteriana postratamiento de los nanogeles por medio de microscopia confocal; además, mediante, el uso de células humanas del ligamento periodontal y de la plataforma de célula viva en tiempo real IncuCyte S3 fue posible evaluar la biocompatibilidad de los nanogeles. Resultados y Conclusión: Este es el primer reporte en el cual se evalúan nanopartículas de cobre y plata estabilizadas con matrices poliméricas de PVA/PVP (nanogeles) en biopelículas bacterianas endodónticas multiespecies y la citotoxicidad empleando la plataforma de célula viva en tiempo real IncuCyte S3. Dentro de los resultados obtenidos en este estudio con relación a la actividad antibacteriana y la citotoxicidad de los nanogeles testeados, evidenciaron que el tiempo de utilización óptimo de estos nanomateriales frente a una biopelícula bacteriana endodóntica multiespecie, es a las 168 h. Asimismo, a medida aumentan los tiempos de acción frente a las células humanas del ligamento periodontal disminuye la citotoxicidad de los nanogeles, proporcionando un material alternativo al hidróxido de calcio durante la medicación en los tratamientos de conductos.
Actividad anticancerígena y antioxidante in vitro de polisacáridos ácidos obtenidos desde hongos pertenecientes a la familia Hymenochaetaceae asociados a bosque nativo de Chile.
(Universidad de Concepción, 2022) Albornoz Muñoz, Verónica Agustina; Campos Araneda, Víctor Leandro; Becerra Allende, José Violido
El cáncer es una de las principales causas de muerte a nivel mundial. Su padecimiento puede estar vinculado con factores hereditarios, o verse favorecido por malos hábitos como el consumo excesivo de alcohol, de tabaco, o la exposición prolongada a componentes químicos, entre otros factores. Estas condiciones aumentan la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), desencadenando stress oxidativo, el cual produce daños en el material genético que pueden inducir el desarrollo de cáncer. Los tratamientos convencionales aplicados para esta enfermedad, como la quimioterapia, presentan un alto costo monetario y un gran deterioro al estilo de vida de los pacientes; por lo que la búsqueda de nuevos tratamientos o compuestos, naturales o sintéticos, que puedan emplearse satisfactoriamente en el control del cáncer han despertado un gran interés en los científicos. Los polisacáridos de origen fúngico han demostrado presentar una amplia gama de actividades biológicas, tales como actividad antibacteriana, hipoglucémica, inmunomoduladora, antioxidante y anticancerígena. El nivel de actividad anticancerígena que presentan los polisacáridos fúngicos está relacionado con sus características físicoquímicas, incluyendo su composición monomérica y los grupos funcionales asociados a la cadena principal de glucanos. En este trabajo se evaluará la capacidad antioxidante y citotóxica contra líneas celulares tumorales, de los polisacáridos ácidos de cuatro cepas fúngicas, pertenecientes a la familia Hymenochaetaceae presente en bosques nativos del sur de Chile. Los polisacáridos ácidos serán obtenidos desde las cepas FQ1645 (Nothophellinus andinopatagonicus), FQ1626 y FQ1640 (Phylloporia boldo), y FQ1648 (posible Fomitiporia sp.), por medio de una precipitación selectiva con Cetavlon. Los polisacáridos obtenidos (NAAPs, PBAP26 y PBAP40, y APFQ48, respectivamente) fueron caracterizados por análisis infrarrojo con transformada de Fourier (FT-IR). La actividad anticancerígena in vitro fue determinada por análisis de citotoxicidad con MTT y citometría de flujo. Además, la capacidad antioxidante de los polisacáridos fue 15 evaluada usando los radicales libres sintéticos DPPH y ABTS. El análisis de FT IR permitió identificar la presencia de enlaces α y β-glicosídicos tanto en PBAP40 como en APFQ48; mientras que los picos correspondientes a grupos sulfatos fueron evidenciados en NAAPs y APFQ48. Los ensayos de citotoxicidad contra líneas celulares tumorales mostraron que tres de los polisacáridos estudiados (NAAPs, PBAP40 y APFQ48) presentan un mayor efecto contra la línea celular HL-60, con valores de IC50 de 767.16 µg mL-1 , 127.85 µg mL-1 y 800 µg mL-1 , respectivamente. Por su parte, el polisacárido PBAP26 presenta una mayor actividad citotóxica contra la línea celular tumoral HCT-116, con un valor de IC50 de 535.83 µg mL-1 . La evaluación del efecto citotóxico de los polisacáridos contra una línea celular no tumoral permitió evidenciar que todos los polisacáridos ácidos analizados presentan un efecto proliferante en la línea celular HGF-1, obteniéndose valores de supervivencia mayores al 100% con las mayores concentraciones de polisacáridos usadas. En cuanto al efecto de los polisacáridos sobre el ciclo celular de la línea celular HL-60, se pudo observar que todos los polisacáridos producen un aumento de eventos en la fase Sub G1, suponiendo un efecto de arresto de células en esta fase del ciclo celular. Los ensayos de actividad antioxidante evidenciaron que los polisacáridos ácidos de las cuatro cepas en estudio presentan una mayor capacidad reductora del radical DPPH en comparación con el radical ABTS; y que los polisacáridos PBAP40 y APFQ48 presentan la mayor actividad antioxidante con valores de 24.53% y 27.31% de actividad antioxidante, respectivamente. Los polisacáridos analizados presentan una significativa actividad anticancerígena in vitro contra las líneas celulares empleadas, HCT-116, MCF-7 y HL-60, especialmente contra esta última. La bioactividad presentada por NAAPs, PBAP26, PBAP40 y APFQ48 podría estar dada por la presencia de grupos funcionales como grupos sulfatos, así como la existencia de β-glucanos.
Actividad antitumoral de pigmentos y metabolitos secundarios sintetizados por bacterias antárticas y patagónicas.
(Universidad de Concepción, 2017) Tapia Herrera, Cristian Ramón; Martínez Poblete, Miguel
Los ambientes antárticos y patagónicos chilenos son considerados extremos por sus bajas temperaturas, altos niveles de radiación ultravioleta y características oligotróficas. En la última década la atención en los ambientes extremos se ha incrementado debido a que microorganismos extremófilos son capaces de producir productos como enzimas, metabolitos secundarios y pigmentos con una potencial aplicación industrial y farmacológica. En este contexto, seis bacterias pigmentadas fueron aisladas desde ambientes patagónicos y antárticos, sus pigmentos fueron extraídos desde de la biomasa bacteriana, purificados y analizados por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). La actividad citotóxica de estos fue evaluada mediante ensayos MTT [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio] usando tres líneas celulares de cáncer (Neuro-2a, Saos-2 y MCF-7). Los pigmentos sintetizados por bacterias antárticas y patagónicas corresponden principalmente a Carotenoides y muestran actividad citotóxica a una concentración de 40 μg/ml.
Actividad in vitro de la combinación de colistín con diferentes antibióticos contra cepas de Acinetobacter baumannii resistentes a carbapenémicos y Klebsiella pneumoniae productoras de β-lactamasas de espectro extendido.
(Universidad de Concepción, 2013) Santos Herrera, René Guillermo; Domínguez Yévenes, Maríana
El aumento de cepas bacterianas patógenas resistentes a la mayoría de los antibióticos, incluyendo carbapenémicos, ha generado la necesidad de buscar alternativas de nuevos protocolos de tratamientos. Las bacterias Gram negativas multiresistentes representan un verdadero reto clínico, sobre todo en infecciones de origen intrahospitalario, debido a la alta mortalidad asociada. Entre estos microorganismos multiresistentes se encuentra Acinetobacter baumannii y Klebsiella pneumoniae, de difícil tratamiento por el grado de resistencia mostrado ante los diferentes protocolos terapéuticos establecidos, determinado por diversos mecanismos de resistencia. Debido al surgimiento de resistencia a carbapenémicos en estas bacterias quedan muy pocas opciones terapéuticas, por lo que se ha recurrido al uso de antibióticos antiguos, que mostraron eficacia contra estos patógenos, pero con limitaciones de actividad y toxicidad, descontinuados por la falta de evidencia clínica respecto a sus efectos secundarios y sólo recuperados nuevamente en la actualidad. Uno de estos antibióticos es colistín, un fármaco que surgió en los años cincuenta para ser utilizado contra bacterias Gram negativas y, actualmente, de uso restringido para infecciones intrahospitalarias multiresistentes. En la actualidad, se carece de estudios modernos sobre farmacocinética y farmacodinamia de este agente y la experiencia actual se basa, fundamentalmente, en experiencias clínicas con resultados poco concluyentes respecto a modo de uso, efectividad y toxicidad, lo que genera controversia respecto a la utilidad de la combinación con otros antibióticos para lograr mayor efectividad. Se plantea el objetivo de evaluar la actividad antibacteriana in vitro de colistín, para determinar si se produce o no efecto sinérgico entre las diferentes combinaciones ensayadas. Para esto se estudiaron 44 cepas de A. baumannii resistentes a carbapenémicos y 48 cepas de K. pneumoniae productoras de β-lactamasas de espectro extendido (BLEE), resistentes a diferentes antibióticos y no relacionadas genéticamente, provenientes de hospitales de Chile. Se determinó la concentración mínima inhibitoria (CMI) de colistín, ampicilina/sulbactam, vancomicina, tigeciclina, rifampicina e imipenem, por el método de microdilución; posteriormente, mediante el método de tablero de ajedrez, se estudió el efecto producido al asociar colistín con cada uno de estos antimicrobianos. Además, en cepas seleccionadas de acuerdo a su multiresistencia y sobre las que diferentes combinaciones actuaron en forma sinérgica, se estudió la cinética de muerte en el tiempo, empleando los correspondientes antibióticos combinados con colistín. Se encontraron cepas bacterianas con diferente grado de resistencia a los distintos antibióticos ensayados. Detectándose, mayormente, efecto sinérgico al asociar colistín con los distintos antibacterianos y, además, una muerte bacteriana en menor tiempo al utilizar la asociación. Sin embargo, tanto para K. pneumoniae como para A. baumannii las diferentes combinaciones presentaron recrecimiento a las 24 horas, salvo la combinación de tigeciclina con colistín en A. baumannii, que continuó sin crecimiento después de 24 horas, pero en este caso la cepa era susceptible a tigeciclina. Se concluye que la sinergia es el efecto más frecuente que se produce al combinar colistín con otros antibacterianos, especialmente en A. baumannii, y que lleva a muerte bacteriana antes de las 12 h con un posterior recrecimiento.
Actividad profiláctica in vitro anti-Helicobacter pylori de propóleos de la región del Bio-Bío.
(Universidad de Concepción, 2015) Freire Contreras, José Andrés; González Correa, Carlos
En la actualidad, se estima que más del 60% de la población mundial está infectada por Helicobacter pylori (H. pylori), convirtiéndose en una infección bacteriana crónica de los humanos. Actualmente el tratamiento de erradicación de H. pylori presenta fallas terapéuticas que oscilan entre 20- 60% de los casos y no se dispone de medidas profilácticas efectivas para prevenir la infección. Por lo tanto, se ha sugerido el empleo de compuestos de origen natural como profilácticos; entre ellos, el propóleos. El objetivo de esta tesis fue determinar la actividad in vitro anti-H. pylori de propóleos colectados de distintas áreas geomorfológicas de la región del Bio Bío, con el propósito de establecer si existen variaciones en su actividad. Se analizaron 10 muestras de propóleos, las que se disolvieron en n-hexano, terbutilmetileter, acetonitrilo y agua, seguida de análisis por cromatografía de partición centrífuga (CPC). La actividad anti-H. pylori se determinó por difusión en agar y por dilución seriada en agar usando como cepas indicadoras H. pylori ATCC 43504, J99 y G27. Además, para un extracto seleccionado se determinó su capacidad de inhibir la formación de biopelículas y la adherencia a células AGS. Los resultados mostraron que todos los extractos inhiben in vitro las cepas de H. pylori, no obstante, se observaron variaciones en la intensidad según la cepa empleada. Los propóleos obtenidos de las áreas geomorfológicas Cordillera de la Costa y Cordillera de los Andes demostraron cualitativamente actividad antibacteriana aumentada. Además, el extracto de propóleos seleccionado disminuyó la formación de biopelículas de la cepa de H. pyloriJ99 y disminuyó la adherencia de la cepa de H. pylori ATCC 43504 a células AGS. Todos los compuestos parcialmente purificados a partir del extracto total mostraron actividad anti-H. pylori variable. Los resultados presentados sugieren que la flora presente y el clima en determinadas zonas podrían influir en la composición y actividad antibacteriana de los propóleos. Además, sugieren que todos los compuestos presentes pueden ser utilizados como sustancias anti-H. pylori.
Adaptaciones moleculares del metabolismo de vitamina C en cáncer de próstata.
(Universidad de Concepción, 2012) Sotomayor Mansfield, Kirsty Jane; Rivas Rocco, Coralia
El siguiente estudio está enfocado en dilucidar los mecanismos de transporte,acumulación y reciclaje de vitamina C en cáncer de próstata, y establecer una relación entre las variaciones en éstos procesos y el progreso tumoral. Para ello, se utilizaron diversas líneas celulares que fueron obtenidos de próstata normal, y diferentes etapas de metástasis de cáncer de próstata. Adicionalmente, se complementó el estudio con análisis histológicos. Los resultados de los experimentos de transporte revelaron que las células de origen prostáticas transportan ambos estados redox de la vitamina C, con excepción de la línea LNCaP que solo transporta ácido deshidroascórbico. El análisis de las constantes cinéticas para el transporte de ácido ascórbico y ensayos de RT-PCR utilizando partidores específicos permitieron establecer que el transporte de ácido ascórbico en las líneas RWPE-1 y PC-3 es mediado por SVCT1 y SVCT2, en tanto que en las células DU-145 el transporte de ácido ascórbico es mediado principalmente por SVCT1. A excepción de la línea LNCaP, la capacidad para transportar ácido ascórbico es mayor en células tumorales y correlaciona con el grado del tumor primario de la cual se derivó cada línea. Adicionalmente, ensayos de inmunocitoquímica en las líneas celulares mostraron una localización principalmente intracelular para SVCT2. Este resultado fue confirmado por ensayos de inmunocitoquímica doble con el marcador COX IV donde se estableció una localización mitocondrial para SVCT2. El análisis de las constantes cinéticas para el transporte de ácido deshidroascórbico y desoxiglucosa, además de ensayos por RT-PCR, permitieron establecer que el transporte de ácido deshidroascórbico es mediado por mas de un transportador, entre las cuales se encuentra GLUT1. La capacidad para transportar ácido deshidroascórbico y desoxiglucosa es menor en células tumorales que en células RWPE-1. Los ensayos de acumulación revelaron que las células benignas y tumorales de próstata acumulan elevadas concentraciones intracelulares de vitamina C. La acumulación de ácido ascórbico es llevada a cabo en las líneas celulares mediante enzimas dependientes de glutatión y enzimas dependientes de NADPH, con excepción de las células LNCaP que acumulan de manera independiente de glutatión. Los ensayos de RT-PCR y de western blot sugieren que la acumulación de ácido ascórbico es mediado por un gran número de reductasas, no obstante el análisis de las constantes cinéticas sugieren la participación principalmente de Grx1 y TrxR1. Ensayos de acumulación y reciclaje en células HEK-293 sobreexpresadas con DHA reductasas dependientes de glutatión y dependientes de NADPH revelaron un efecto positivo de los niveles de reductasas sobre la velocidad de reducción intracelular de DHA, especialmente de TrxR1. Por otra parte, análisis inmunohistoquímicos en tumores de próstata permitieron establecer la expresión de SVCT1 y SVCT2, y observar una correlación entre la expresión de SVCT2 y el grado Gleason. Mas aún, ensayos de doble inmunocitoquímica con anticuerpos para COX IV y SVCT2 permitieron establecer la localización mitocondrial de SVCT2 en estos tejidos tumorales. Análisis inmunohistoquímicos realizados para determinar la presencia de GLUT1 revelaron una expresión moderada en tejidos benignos y una expresión de moderada a alta en un 10 % de las muestras, la mayoría de grados VIII Gleason 4 y 5. Finalmente el análisis de la expresión de TrxR1 reveló una baja expresión de TrxR1 en tejido benigno y una alta expresión en un 20% de los tejidos tumorales. Concluimos que las variaciones en el transporte, acumulación y reciclaje de la vitamina C asociados al progreso tumoral reflejan la adaptación de la célula tumoral para protegerse de los efectos del proceso fisiopatológico del cual forman parte y que se caracteriza por un alto nivel de estrés oxidativo.
La administración del simbiótico Lactobacillus bulgaricus 6C3, inulina y fructooligosacárido reduce la progresión de la enfermedad renal crónica en el modelo murino.
(Universidad de Concepción, 2020) Jerez Morales, Alonso Leandro; García Cancino, Apolinaria del Rosario
La enfermedad renal crónica (ERC) corresponde a una patología de diversos orígenes que afecta la función renal. Una de las estrategias para evitar la progresión de la ERC es la disminución de las moléculas de retención urémica (MRUs) mediante probióticos, prebióticos y simbióticos. El objetivo de este trabajo fue evaluar si la administración de un simbióticos es capaz de disminuir la progresión de la ERC. Para esto, se evaluó la capacidad de disminuir IS y pCr in vitro por las cepas L. bulgaricus 6c3, L. acidophilus VIIIc2 y el cocultivo de ambas. Luego, se desarrolló un simbiótico el cual fue administrado en ratas Sprague-Dawley nefrectomizadas por 16 semana (Lac), en paralelo se trabajó con un grupo nefrectomizado sin tratamiento (Nef) y un grupo control (C). Se midieron las concentraciones de creatinina, IS y pCr en sangre mediante HPLCDAD al inicio y final del experimento, además, se extrajo el riñón para análisis histológicos. La cepa L. bulgaricus 6c3 fue la que obtuvo mayor capacidad de disminuir IS in vitro. La administración del simbiótico no afecto la concentración de creatinina sérica, por el contrario, el grupo Lac disminuyó un 0.8% los valores de IS séricos, en contraste, el grupo Nef aumento significativamente las concentraciones de IS (38.8%). Las concentraciones de pCr no lograron medirse. El análisis histológico del riñón demostró que el grupo Lac presentó un aumento menor del área fibrótica (12%) en comparación con el grupo Nef (25%). Los resultados obtenidos demuestran que el simbiótico es capaz de disminuir IS en modelo murino y disminuir la progresión de la ERC.
Aislamiento de un consorcio bacteriano anaeróbico, capaz de transformar roxarsona y producir biogás , utilizando estiércol de pollo broiler.
(Universidad de Concepción, 2015) Riquelme Espinoza, Rodrigo Andrés; Campos Araneda, Víctor Leandro
En la industria avícola es común la utilización de compuestos organoarsenicales para la producción de pollos Broiler. El Ácido 3-Nitro 4hidroxilfenilarsénico (roxarsona), es suministrado como suplemento alimenticio, fomentando el crecimiento, pigmentación de la carne y previniendo la aparición de parasitos intestinales (coccidiosis). La roxarsona al ser excretada provoca un aumento de arsénico en el ambiente, mediante la biotransformación de arsénico orgánico a especies de arsénico inorgánico (Arsenito y Arseniato). El objetivo del trabajo fue aislar e identificar un consorcio bacteriano proveniente de estiércol de pollo Broiler, capaz de biotransformar roxarsona bajo condiciones anaeróbicas y además producir biogás, como producto de la actividad metabólica. Las muestras fueron obtenidas de una industria avícola de la región del Bío-Bío y enriquecidas en un medio químicamente definido bajo condiciones anaeróbicas, con agitación constante. Se determinó la capacidad de biotransformar roxarsona bajo condiciones anaeróbicas mediante espectrofotometría y cromatografía de alta resolución. El consorcio fue caracterizado molecularmente mediante la amplificación del gen ADNr 16S, posterior análisis por DGGE, re amplificando los productos obtenidos y se alinearon con la base de datos de genbank. La determinación de biogás se analizó por cromatografía de gases. Los resultados obtenidos demostraron que el consorcio fue capaz de degradar el 95.6% de roxarsona presente en el medio, luego de 48 horas de incubación, bajo condiciones anaeróbicas. El análisis molecular demostró que el consorcio presenta heterogeneicidad y que la roxarsona provoca un cambio en la estructura de la comunidad bacteriana, evidenciando 13 grupos bacterianos diferentes, siendo el más predominante Firmicutes, las cuales son mayoritariamente anaeróbicas y fermentadores. Se determinó que la actividad metabólica del consorcio produce biogás lo que generaría una fuente de energía alternativa.
Aislamiento y caracterización del gen arsenito oxidasa de Pseudomonas sp.FN-41.
(Universidad de Concepción, 2009) Badilla Pino, Consuelo Pía; Mondaca Jara, María Angélica
El arsénico es un metaloide altamente tóxico especialmente en estado inorgánico como arsenito [As (III)] y arseniato [As (V)]. Se encuentra ampliamente distribuido en numerosos ambientes, en algunos de ellos puede alcanzar concentraciones peligrosas para los humanos, produciendo diversas afecciones a la salud como problemas vasculares en la piel hasta el desarrollo de cáncer. Numerosos estudios muestran que existen bacterias, que cumplen un rol fundamental en el ciclo biogeoquímico del metaloide, cambiando los estados de oxidación, como por ejemplo, transformándolo desde un estado tóxico de arsenito a un estado menos tóxico de arseniato. Dichos microorganismos, presentan diversos mecanismos de resistencia para contrarrestar la toxicidad del metaloide. Los principales mecanismos de resistencia bacteriana se encuentran asociados a determinantes genéticos, los que otorgan la capacidad de realizar dichas transformaciones del metaloide. La facultad para oxidar el arsénico se debe fundamentalmente a la presencia de una enzima, arsenito-oxidasa, la cual oxida As (III) a As (V). Se ha informado que en bacterias heterotróficas la enzima se ubica a nivel del periplasma bacteriano, y en bacterias quimiolitoautotróficas se encuentra en la membrana citoplasmática asociada a la cadena transportadora de electrones. Ésta enzima, es un heterodímero que consta de una subunidad catalítica mayor, que contiene un centro de molibdeno y un centro HiPIP [3Fe-4S] y una subunidad menor, formada por un centro Rieske [2Fe-2S]. Los genes que codifican para la subunidad menor y mayor de la enzima son los asoBA, aroBA y aoxAB, respectivamente. Estos genes se han detectado en una amplia gama de bacterias y Archae, no obstante, no se habian descrito genes involucrados en la oxidación de arsenito en el género Pseudomonas, pero recientemente dos Pseudomonas se informo la presencia del gen. El objetivo del presente trabajo fue caracterizar el gen de la enzima arsenitooxidasa de Pseudomonas FN-41, bacteria arsenito-oxidante, aislada de sedimentos del río Camarones, XV región Chile. Se estudió la ubicación celular de la enzima arsenito oxidasa, mediante la 2 formación de esferoplastos, ultracentrifugación y ruptura celular por prensa French. Se investigó la presencia del gen arsenito oxidasa de la cepa en estudio mediante PCR utilizando partidores degenerados (69F y 1374R). El producto de PCR obtenido fue clonado y secuenciado. Posteriormente se realizaron análisis comparativos con secuencias descritas para los genes asoA, aroA y aoxB mediante Blast y ClustalW, determinando la similitud de aminoácidos, análisis filogenéticos y análisis evolutivos. Los resultados muestran que la arsenito oxidasa de Pseudomonas FN-41 tiene ubicación periplasmática. Un 74.8 % de actividad enzimática respecto a la actividad total, fue encontrada en la fracción periplasmática (0.158 μmoles de DCIP/mgproteína/min). Mediante ultra-centrifugación, la región soluble correspondiente al contenido periplásmico, presentó una mayor actividad enzimática, alcanzando un 87.1% (0.203 μmoles de DCIP/mg proteína/min), respecto a la actividad total. Mediante PCR, se obtuvo un producto de 1200 pb aproximadamente, los que corresponden a la amplificación de la primera mitad de la subunidad mayor de la arsenito oxidasa. El alineamiento de las secuencia aminoacidica de la cepa en estudio con otras secuencias de arsenito oxidasas, permitió determinar los aminoácidos implicados en el sitio de unión del sustrato de la enzima, los cuales corresponden a los residuos H195 y E203. Se identificaron los residuos S98 y A199, que pertenecen a la subunidad catalítica de la enzima. También se identificó el motivo HNRPAYNSE que es altamente conservado en bacterias arsenito oxidante. Los análisis de similitud aminoacídica de la secuencia en estudio respecto al gen aoxB de Cenibacterium arsenoxidans reveló ser un 45.1%, con el gen asoA de Alcaligenes feacalis un 49.6% y con el gen aroA de Rhizobium sp. NT-26 un 45.1%. Estos resultados permiten concluir que en Pseudomonas. sp. FN-41 se encuentra una arsenito oxidasa que se ubica en el espacio periplásmico. Presenta el gen que codifica para la arsenito oxidasa y probablemente es distinto a los ya descritos.
Ambiente genético del gen bla CTX-M2 en cepas de klebsiella pneumoniae subsp. pneumonieae aisladas en hospitales chilenos.
(Universidad de Concepción, 2007) Díaz Quezada, Patricia María; Bello Toledo, Helia Magaly
Las enzimas del grupo CTX-M forman una familia de - β de espectro extendido (BLEE) de rápido crecimiento, distribuidas en diversas áreas geográficas y en un amplio rango de bacterias clínicas, en particular, miembros de la familia Enterobacteriaceae como Klebsiella pneumoniae. Estas enzimas hidrolizan preferentemente cefotaxima, y su prevalencia en Chile es de 40,2%, en cepas de K pneumoniae subsp pneumoniae productoras de BLEE. Según lo indicado por diversos estudios, en la movilización de genes blaCTX-M estarían involucrados elementos genéticos, como por ejemplo la secuencia ISCR1 e integrones de clase 1. Estos últimos elementos han sido los más estudiados y caracterizados, principalmente por su alta diseminación y, además, porque han sido encontrados en cepas aisladas en hospitales. La organización general de los integrones clase 1 consiste de un extremo 5’ conservado (5’CS), donde se encuentra el gen intI1, el que codifica para una proteína denominada integrasa y que corresponde a una recombinasa sitio específica. Además, posee un extremo 3’ conservado (3’CS) con los genes qacEΔ1, sul1 y orf5 que codifican resistencia a compuestos de amonio cuaternario, bromuro de etidio, sulfonamidas y a una proteína de función desconocida, respectivamente. Entre los extremos 5’CS y 3’CS se encuentra una zona variable con presencia o ausencia de cassettes genéticos de resistencia. Recientemente se informó la presencia de integrones clase 1 complejos(ejemplos, In35 e InS21, descritos en Argentina), los cuales presentan una duplicación parcial o completa del extremo 3’CS. En este caso los cassettes genéticos se ubican entre el 5’-CS y la primera copia del 3’CS, tal como en un integrón clase 1 tradicional. Entre el segundo 3’CS se halla una región conservada de 2.100 pb, que incluye la secuencia ISCR1 y una segunda región variable adyacente, donde se han encontrado insertos genes blaCTX-M. La secuencia ISCR1 contiene un únic marco de lectura, orf513, que codifica para una recombinasa putativa.vi Hasta el momento no existen publicaciones en Chile que asocien la presencia del gen blaCTX-M-2 a este tipo de estructuras genéticas, por lo cual, el Objetivo General de esta Tesis fue caracterizar el ambiente genético del gen blaCTX-M-2 presente en cepas de K. pneumoniae subsp. pneumoniae aisladas en hospitales chilenos. En este estudio se incluyeron 6 cepas de K. pneumoniae subsp. pneumoniae (K143, K283, K288, K291, K292, y K296) multirresistentes productoras de la BLEE CTX-M2, y también la cepa transconjugante K283tr. Se caracterizó, mediante PCR, la zona variable del integrón clase 1 presente en estas cepas, como también la duplicación del extremo 3’ CS del integrón clase 1 complejo, utilizando combinaciones de partidores específicos descritos en la literatura internacional, y se comparó los resultados con los obtenidos en la cepa control UC244 (In35+). De acuerdo a los resultados de los experimentos anteriores, y de un estudio de clonalidad de las cepas, se secuenció losproductos de amplificación del ambiente genético del gen blaCTX-M2 de la cepa K283. Para el ensamblaje y análisis comparativo de las secuencias nucleotídicas se utilizaron diversos programas computacionales.Los resultados revelaron que, en todas las cepas estudiadas, incluyendo la cepa K283tr , el gen blaCTX-M2 se encuentra inserto en un integrón clase 1 complejo, asociado a la presencia de la secuencia ISCR1. La arquitectura de este integrón es similar a los integrones clase 1 complejos detectados en Argentina y Uruguay. Se determinó que la zona variable del integrón clase 1 contiene el siguiente ordenamiento de cassettes genéticos: aac(6’)-Ib, blaOXA2 y orfD.Corriente abajo del primer extremo 3’CS, se encontró una zona de 2.985 pb que posee un 95% de identidad con los primeros integrones clase 1 complejos descritos, In6 e In7, e incluye la secuencia ISCR1. Al hacer el alineamiento múltiple de la secuencia codificante de orf513, se determinó que comparte 100% de identidad con aquella descritas para los integrones In35 e InK13, descritos en Argentina y Uruguay, respectivamente. Corriente abajo de esta secuencia, se vii encontró ubicado el gen blaCTX-M2, que comparte un 98% de identidad con blaKLUA-1 de Kluyvera ascorbata. La secuencia corriente abajo del gen blaCTX-M2 se puede dividir en dos partes: una región homóloga a blakluA-1, la secuencia ORF3 (88% homóloga con la de K. ascorbata) y el gen posee un qacEΔ1, el cual es el primer componente de la duplicación del extremo 3’ del integrón clase 1 complejo.Se concluye que el gen blaCTX-M2 presente en cepas hospitalarias de K. pneumoniae subsp. pneumoniae se encuentra en un integrón clase 1 complejo, denominado InK283, adyacente a la secuencia ISCR1, y de igual arquitectura que aquellos integrones descritos en Argentina y Uruguay. Este integrón clase 1 complejo se encuentra ubicado en un plásmido conjugativo, que podría estar movilizándose entre las cepas chilenas
Análisis de estructura-función del co-transportador de Na/ácido ascórbico SVCT2: mecanismo de transporte y aspectos regulatorios.
(Universidad de Concepción, 2004) Godoy Sánchez, Alejandro Samuel; Vera Cárcamo, Juan Carlos
Hasta el momento se han identificado dos sistemas que median el transporte de vitamina C en células de mamíferos. La forma oxidada de esta vitamina (ácido deshidroascórbico) ingresa a la célula por los transportadores facilitativos de hexosas (GLUTs), en tanto que la forma reducida (ácido ascórbico) lo hace a través de una familia de proteínas denominadas SVCTs, de los cuales se han descrito dos miembros hasta el momento, SVCT1 y SVCT2. Estos últimos transportadores se caracterizan por ser activados por sodio, electrogénicos y altamente selectivos para L-ascorbato. Estudios preliminares de caracterización funcional de SVCT1 y SVCT2, clonados y expresados en ovocitos de X. laevis, han producido resultados contradictorios respecto de los parámetros cinéticos asociados al transporte de ácido ascórbico. Por otro lado, no se han caracterizado las propiedades funcionales de los SVCTs expresados endógenamente y en forma aislada, debido a que la mayoría de las células parecen expresar ambas isoformas simultáneamente. En esta tesis, caracterizamos la expresión de SVCTs en un modelo de células de melanoma humano (SK-MEL), y desarrollamos un completo análisis cinético y de estructura-función del transportador de Na+/ácido ascórbico SVCT2 expresado en estas células. Los estudios de inmunodetección, RT-PCR y secuenciación permitieron confirmar la presencia de la isoforma SVCT2 en este modelo celular, y ausencia de expresión de SVCT1. Los estudios cinéticos demostraron la existencia de un sistema de transporte de ácido ascórbico que presentó una Km de 17±3 μM. La dependencia de la dosis para la activación por sodio demostró una relación sigmoidal entre la velocidad de XI captación de ascorbato y la concentración de sodio, con un coeficiente de Hill de 1,9 y un Na50 de 35 mM. Estos resultados fueron compatibles con una estequiometría de transporte Na+:ácido ascórbico de 2:1, estimada a partir de ensayos de transporte en paralelo de 22Na+ y [1-14C] ácido ascórbico. La Km de transporte para ácido ascórbico fue afectada por la concentración de sodio en el medio extracelular, observándose una disminución de más de 100 veces el valor de la Km cuando el sodio aumentó de 5 a 135 mM, sin afectar la Vmax de transporte. A la inversa, el ácido ascórbico modificó la cooperatividad para el sodio con un comportamiento de tipo bimodal, observándose un aumento progresivo en el grado de cooperatividad a concentraciones crecientes de ácido ascórbico entre 5 y 100 μM, y posteriormente, una pérdida abrupta de la cooperatividad a concentraciones de ácido ascórbico igual o superiores a 200 μM. Este efecto recíproco de ambos sustratos sugiere una secuencia de unión al transportador del tipo sodio:ácido ascórbico:sodio. La función de SVCT2 requiere la presencia de cationes bivalentes (Ca2+ y Mg2+) en el medio extracelular. El mecanismo de acción de estos cationes involucra la estabilización de una conformación activa del transportador, que muestra un aumento en la velocidad máxima de transporte, sin afectar la Km asociada al transporte de ácido ascórbico, ni el efecto del activador sodio (nH y Na50). Estos resultados permiten concluir que SVCT2 es un transportador de alta afinidad, es activado por sodio en forma cooperativa, requiere Ca2+ o Mg2+ para su función, transporta Na+ y ácido ascórbico con una estequiometría 2:1 (Na+:ácido ascórbico), y el ciclo de transporte se caracteriza por un orden de unión de los sustratos del tipo Na+:ácido ascórbico:Na+. Variaciones en el pH extracelular afectaron la función de SVCT2 tanto a pH ácido como a pH básico, observándose una caída en la velocidad de transporte y una pérdida de XII la cooperatividad para el sodio (nH), sin afectar la Km de transporte. Dietilpirocarbonato, un reactivo que a pH 6 muestra especificidad por residuos de histidina, afecta la funciónen la velocidad de transporte, sin afectar la Km de transporte, y sin que se observe un efecto protector del sustrato. Por otro lado, el análisis de la cinética de inhibición en función de la concentración de dietilpirocarbonato sugiere que al menos dos residuos de histidina pudieran estar participando en la pérdida de la cooperatividad por el sodio y la caída en la actividad del transportador como producto de la modificación. En conjunto con la información previa de la caracterización de las propiedades funcionales de SVCT2, los resultados de modificación química con dietilpirocarbonato sugieren que ambas funciones, cooperatividad y actividad, serían propiedades determinadas por motivos estructurales que son diferenciables desde el punto de vista de su accesibilidad a modificadores químicos. de SVCT2 en forma similar al efecto del pH, con pérdida de cooperatividad y una caída en la actividad del transportador como producto de la modificación. En conjunto con la información previa de la caracterización de las propiedades funcionales de SVCT2, los resultados de modificación química con dietilpirocarbonato sugieren que ambas funciones, cooperatividad y actividad, serían propiedades determinadas por motivos estructurales que son diferenciables desde el punto de vista de su accesibilidad a modificadores químicos.
Análisis de la dinámica transcripcional asociada al desarrollo y regeneración del hueso craneal de Xenopus tropicalis.
(Universidad de Concepción, 2024) Castillo Córdova, Héctor Benjamín; Marcellini Liotaud, Sylvain Guy Andre
Hasta la fecha, se desconoce si el programa de regulación génica involucrado en el desarrollo del hueso craneal de los anfibios se reactiva durante la regeneración ósea. Tras una lesión craneal, los renacuajos de Xenopus tropicalis reparan el daño formando un tejido mesenquimatoso no mineralizado a los 5 días post-lesión (5dpl), y posteriormente lo cubren con una capa delgada de hueso (15dpl). Para explorar la relación entre los mecanismos transcripcionales de la osificación craneal durante el desarrollo y la regeneración, realizamos experimentos duplicados de RNA-Seq y ATAC-Seq utilizando tres tipos de muestras: i) región regenerativa temprana (5dpl) y tardía (15dpl), ii) precursores osteogénicos no diferenciados (del mesénquima de larvas NF50) y osteoblastos diferenciados (de cráneos de larvas NF58), y iii) hígado, corazón y pulmón como controles no mineralizados. Determinamos que los osteoblastos en desarrollo poseen una lógica regulatoria bien conservada con los mamíferos, identificando 35 enhancers conservados que, en humano, contienen SNPs, asociados a fenotipos esqueléticos. Los análisis PCA del perfil transcriptómico y del paisaje de cromatina abierta revelan que la regeneración temprana es más similar a los osteoblastos que al mesénquima. Diseñamos un método novedoso para integrar datos de ATAC-seq y RNA-seq, definiendo siete clústeres que permitieron identificar genes sobreexpresados y sus regiones regulatorias específicas. Basados en ontología génica y enriquecimiento de TFBS, determinamos que la red transcripcional de la regeneración temprana está relacionada con la remodelación de la matriz (mmp13), el sistema inmune (spi1) y los precursores osteogénicos (sox2). Sin embargo, carece de los marcadores de patrón embrionario presentes en el mesénquima (nog). En los osteoblastos recién diferenciados de la regeneración tardía, dlx5 cumple un rol clave en la regulación, mientras que el programa genético de los osteoblastos maduros del desarrollo requiere del heterodímero Jun/Fos. En resumen, identificamos un conjunto de enhancers putativos y sus genes diana que se activan en pasos precisos durante el desarrollo y la regeneración del hueso craneal. Nuestros resultados sugieren que los osteoblastos se desdiferencian en un estado celular intermedio mediante la reactivación de genes de pluripotencia como sox2. Este estudio proporciona datos relevantes para entender los mecanismos moleculares que permiten al hueso de los anfibios formarse y regenerarse eficientemente tras un daño crítico.
Análisis de la estructura cuaternaria del transportador de ácido ascórbico SVCT2
(Universidad de Concepción, 2016) Gatica Miranda, Marcell Alejandra; Rivas Rocco, Coralia
La forma reducida de la vitamina C, el ácido ascórbico (AA), es transportado al interior de las células por la familia de cotransportadores de sodio-ascorbato SVCT, con 2 formas funcionalmente activas, SVCT1 y SVCT2. Se ha propuesto un modelo funcional para el ciclo de transporte de ambos SVCTs, en el cual el transportador presenta un sitio de unión para el sustrato AA, al menos dos sitios de unión para Na+ y un sitio de unión Ca2+ y Mg2+. Durante el ciclo de transporte ambos sitios de unión a sodio interactúan entre ellos y además interaccionan con el sitio de unión a AA, el cual a su vez afectaría recíprocamente la interacción entre ambos sitios de unión a sodio. De igual manera el sitio de unión a cationes divalentes interacciona con el sitio de unión a AA ya que se ha visto que en ausencia de cationes divalentes el transportador es inactivo. Aunque existen numerosos estudios acerca de los aspectos cinéticos y funcionales de SVCT2, no existe información estructural disponible para este transportador. Análisis de hidrofobicidad revelaron que los SVCTs son altamente hidrofóbicos y están compuestas por 12 hélices de transmembrana unidas entre sí por lazos ricos en aminoácidos hidrofílicos y con los extremos amino y carboxilo-terminal orientados hacia la cara citoplasmática de la célula. Sin embargo hasta la fecha, no se tienen antecedentes acerca de la estructura 3D de SVCT2 ni del estado de oligomerización de este transportador en la membrana celular. Por otro lado, existe evidencia que indica que la oligomerización es una característica esencial para la estructura y función de los transportadores de membrana. Cristalización de diferentes transportadores de membrana bacterianos junto a diversos estudios utilizando técnicas alternativas a la cristalización, como ensayos de entrecruzamiento, transferencia de energía de resonancia de Föster (FRET), coinmunoprecipitación, entre otras, han llevado a proponer que aproximadamente el 70% de los transportadores están formando oligómeros en la membrana plasmática, por ejemplo, transportadores que usan el gradiente electroquímico como energía para catalizar la translocación de su sustrato, existen como oligómeros de alto orden, dímeros (vSGLT y LeuTA), trímeros (AcrB, GltpH y BetP) o tetrámeros (GLUT1)), aunque evidencia de monómeros (Mhp1) también fue reportada. Recientes estudios de microscopía electrónica en hSVCT1 expresado en ovocito, reveló la presencia de dos poblaciones de partículas con distinta forma y estructura a baja resolución lo que sugiere la presencia de monómeros y dímeros del transportador. Por otro lado, ensayos de entrecruzamiento químico confirmaron la presencia de dímeros en membranas aisladas de estos ovocitos, aunque a concentraciones menores comparadas con el monómero de hSVCT1. La información estructural es importante para comprender el mecanismo de estos transportadores a nivel molecular. Por lo que el propósito de esta tesis fue determinar la estructura cuaternaria de hSVCT2. Ensayos de entrecruzamiento químico de hSVCT2 seguido de inmunomarcaje con anticuerpos específicos sugieren que hSVCT2 existe como dímero. Además, realizamos ensayos de transporte de AA para comprender la significancia funcional de la oligomerización de hSVCT2 y así poder determinar la unidad mínima funcional de este transportador de membrana. Dentro de estos ensayos realizamos estudios funcionales de co-expresión del transportador activo (nativo) y una mutante inactiva de hSVCT2 (H109Q), que revelaron que hSVCT2 nativo no restauró la capacidad de transporte de la mutante inactiva, ni esta última suprimió la capacidad de transporte del transportador nativo. Por otro lado, al coexpresar el transportador nativo junto a una mutante (C113S o C160S) que presenta características cinéticas alteradas (Km aparente de transporte, al menos 5 veces superior a la del transportador nativo), revelaron que a todas las razones moleculares ensayadas se detectó un único componente cinético que corresponde a la proteína que se expresa en mayor proporción. A partir de estos resultados, podemos proponer que hSVCT2 forma dímeros en membrana celular, que la unidad mínima de transporte dentro del dímero de hSVCT2 podría ser el monómero y que los monómeros dentro del dímero son capaces de interactuar entre ellos modulando sus propiedades cinéticas.
Análisis de la formación de biopelículas de acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 53993 sobre soportes inorgánicos y orgánicos y evaluación de su potencial biotecnológico en el tratamiento de aguas contaminadas con arsénico inorgánico.
(Universidad de Concepción, 2024) Castro Piña, Matías Sebastián; Martínez Poblete, Miguel; Castro González, Matías
El arsénico (As) es un metaloide altamente tóxico para todas las formas de vida, el cual es liberado al ambiente por fuentes naturales y actividades antrópicas. El consumo de agua contaminada con As es un problema a nivel mundial, lo que representa un problema a la salud pública. Para remediar esta situación, existen tecnologías como la adsorción, método basado en la capacidad de retención de contaminantes en la superficie de adsorbentes. En la búsqueda de nuevos adsorbentes, los óxidos de hierro como Schwertmannita (Sch) y Jarosita (Jt), presentan buenas propiedades de adsorción de As, compuestos que pueden ser biomineralizados por bacterias acidófilas oxidantes de hierro como Acidithiobacillus ferrooxidans. La biomineralización de óxidos de hierro es un proceso mediado por factores como la formación de biopelículas y las interacciones del Fe(III) con diferentes estructuras de la matriz extracelular (ECM, del inglés extracelular matrix), por lo que es necesario caracterizar las biopelículas formadas por Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 53993, incluyendo componentes de su matriz extracelular, y evaluar su utilidad en el tratamiento de aguas contaminadas con As inorgánico mediante biomineralización de óxidos de hierro. Así, se evaluó la viabilidad de A. ferrooxidans ATCC 53993 a diferentes concentraciones de As inorgánico, mediante análisis espectrofotométricos midiendo la densidad óptica a 430 nm. Se analizó la formación de biopelículas sobre soportes inorgánicos y orgánicos mediante ensayos de adherencia evaluados por microscopia de epifluorescencia y con microscopia electrónica de barrido. La caracterización de las estructuras presentes en la ECM se realizó mediante análisis de distribución de tamaño, microscopia electrónica de transmisión y análisis proteómico. Además, se analizaron los óxidos de hierro biomineralizados por biopelículas de A. ferrooxidans ATCC 53993 sobre un soporte orgánico inerte, los cuales fueron caracterizados mediante microscopia electrónica de barrido asociado a espectroscopia de rayos X de energía dispersiva y difracción de rayos X, junto también con una evaluación de su capacidad de adsorción de As mediante Espectrometría de Masas con Plasma Acoplado Inductivamente. Los resultados indicaron que A. ferrooxidans ATCC 53993 fue capaz tolerar hasta 2 mM de As(III) y 32 mM de As(V). Además, de adherirse a sustratos inorgánicos (pirita y azufre elemental) y a un soporte orgánico inerte (bioball), formando biopelículas. En cuanto a la caracterización de su ECM, esta cepa es capaz de producir vesículas de membrana, las cuales presentan capacidad de adherencia a pirita y azufre elemental como también una capacidad oxidativa de hierro reducida con respecto a las células. Por último, las biopelículas de A. ferrooxidans ATCC 53993 son capaces de biomineralizar óxidos de hierro, principalmente Sch y Jt. Los cuales presentaron una capacidad para adsorber As(III) de 23.2 mg·g-1. Valores que sugieren la posibilidad de desarrollar un sistema de tratamiento de aguas contaminadas con As basado en la inmovilización de Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 53993 sobre bioballs y que permiten la biomineralización de óxidos de hierro y éstos pueden capturar el As inorgánico. Como proyecciones a este proyecto quedan estudiar el desarrollo de un sistema de tratamiento a mayor escala para evaluar los rendimientos de biomineralización de óxidos de hierro como de la adsorción de As. Por otra parte, surge la necesidad de esclarecer las funciones de las MVs dentro del contexto de la formación de biopelículas de esta bacteria, junto con la interacción con minerales que puede influir en la biomineralización de óxidos de hierro.
Análisis de la localización subcelular de XtRic-8A y de su participación en la polarización celular en embriones de X. tropicalis.
(Universidad de Concepción, 2012) Arriagada Momberg, Cecilia Lorena; Torrejón Quezada, Marcela Eliana
Inicialmente Ric-8 fue identificada promoviendo la vía de liberación de vesículas sinápticas en C.elegans y participando durante la división asimétrica en la embriogénesis de Drosophila. Por otro lado, en nuestro laboratorio hemos observado que ensayos de pérdida de función de Ric-8A en X. tropicalis, generan un fenotipo con células que presentan un retardo en la división celular y defectos en la pigmentación en las primeras etapas del desarrollo embrionario, un fenotipo que previamente fue descrito en embriones que presentan problemas en polarización celular. Por esta razón nos hemos planteado como hipótesis para este trabajo de tesis, que “XtRic-8A participa en polarización celular, etapa previa a procesos como la división asimétrica y migración celular, eventos importantes durante el desarrollo embrionario de un organismo.” Por lo tanto, con el objetivo de entender el rol que podría estar cumpliendo Ric-8 durante la división y polarización celular, en este trabajo de tesis se analizó la localización subcelular de XtRic-8A durante el ciclo celular en células HeLa y en cortes de embriones tempranos en X. tropicalis. Nuestros resultados indican que XtRic-8A se localiza en la membrana citoplasmática, en la región perinuclear, y en el citosol durante la interfase, mientras que en metafase se localiza alrededor de la placa metafásica. Por otra parte, ensayos de pérdida de función, utilizando un morfolino contra XtRic- 8A, muestran un cambio en la distribución de proteínas cuya localización se encuentra polarizada durante etapas tempranas de la embriogénesis. Este resultado sugiere que XtRic-8A podría ser requerido durante eventos de polarización celular, paso importante durante procesos como la división celular asimétrica y migración celular. Finalmente, este fenotipo pudo ser rescatado al sobreexpresar la subunidad XtGαi, proteína que participa en la división asimétrica, sugiriéndonos que ambas proteínas podrían estar participando juntas durante polarización celular. Por último, ensayos de co-inmunoprecipitación y docking demostraron que ambas proteínas son capaces de interaccionar, localizándose en la región basolateral de las células del animal cap del embrión de X. tropicalis.
Análisis de la microbiota y parasitofauna de ejemplares de Dissostichus eleginoides smitt, 1898, capturados en la zona centro-sur de Chile.
(Universidad de Concepción, 2021) Fernández Fonseca, Italo Antonio; Campos Araneda, Víctor Leandro
La carne de pescado presenta propiedades nutricionales que son relevantes en el ámbito de la alimentación humana, que los convierten en alimentos fundamentales dentro de lo considerado como alimentación equilibrada y cardiosaludable. Por su geografía, Chile es uno de los principales países que basan parte de su economía en la industria pesquera industrial y artesanal. Sin embargo, al igual que el resto del mundo, el país se enfrenta a la sobreexplotación de sus recursos pesqueros, ya sea por su exceso de capturas, así como la carencia de información respecto del estatus sanitario de éstas. De hecho, a mediados de la década pasada se reconoce que las principales pesquerías que operan en Chile se encuentran sobre explotadas o agotadas. Es en este contexto que surge, como una pesquería relativamente emergente y valiosa, la explotación sobre el bacalao de profundidad Dissostichus eleginoides, pez de profundidad conocido internacionalmente como Patagonian Toothfish o Chilean Seabass. Esta especie, a pesar de encontrarse presente a lo largo de casi todo el dominio marítimo de Chile, es un recurso poco conocido desde el punto de vista biológico. Diversas investigaciones, efectuadas desde hace dos décadas, han dado cuenta de información respecto de la ecología, alimentación, reproducción, estructura poblacional, etc. de D. eleginoides. Sin embargo, existen escasos antecedentes respecto de la parasitología y, sobre todo, de la microbiología de esta especie. Desde el punto de vista parasitario, se han efectuado investigaciones principalmente en poblaciones de D. eleginoides localizadas en el Océano Atlántico y en algunas islas subantárticas. Solo dos trabajos se han realizado en ejemplares capturados en Chile, pero datan de, a lo menos, una década. En ellos puede apreciarse que la parasitofauna de esta especie es particularmente distinta de lo reportado en estudios similares en otras localizaciones. Por el contrario, desde el punto de vista microbiológico no existen antecedentes en esta especie, al menos en ejemplares salvajes. Solo se cuenta, a la fecha, con antecedentes provistos por una investigación efectuada en un ejemplar de D. eleginoides capturado en aguas australes de Chile, pero que fue mantenido en condiciones de cautiverio de seis meses. Investigaciones respecto de la parasitofauna y de la comunidad bacteriana de D. eleginoides son relevantes dado que para comprender su funcionamiento es necesaria su identificación y/o cuantificación, lo que a su vez permite inferir respecto de la diversidad poblacional de la muestra analizada, así como del estado de salud del hospedero en particular. Por lo mencionado anteriormente, el objetivo del presente trabajo fue caracterizar la comunidad bacteriana y parasitaria del tracto gastrointestinal de ejemplares de D. eleginoides, capturados en aguas de la zona centro sur de Chile. Los resultados obtenidos demuestran, en primer lugar, que la parasitofauna de D. eleginoides que habitan aguas de Chile parece ser singular, tributando a su rol de carnívoro de tope, pero correspondiendo a una población particular de la especie. Así mismo, dan cuenta del primer reporte del parasitismo por Rocinela aff. australis en D. eleginoides y del hallazgo de larvas de Pseudoterranova sp., cuya presencia solo había sido informada en ejemplares capturados en otras latitudes. Por el contrario, los resultados a nivel microbiológico no coinciden con lo previamente reportado debido a, probablemente, limitaciones metodológicas. Finalmente, tanto en los resultados del ámbito parasitario como microbiológico, las extensas migraciones y las condiciones batimétricas en las cuales habita D. eleginoides en la costa de Chile, parecieran seleccionar una comunidad bacteriana y parasitofauna particular, lo que sería característico y correspondiente con la población o stock pesquero de esta especie en aguas chilenas. Por lo tanto, y debido a la escasez de antecedentes con que se cuenta a la fecha, los resultados obtenidos en esta investigación son pioneros en la especie y pueden servir como línea de base para estudios posteriores.