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Desarrollo de modelos quimiométricos para determinar la correlación entre bio-actividad y características químicas y espectroscópicas de propóleos provenientes de distintas zonas apícolas del Sur de Chile
(Universidad de Concepción, 2016) Venegas Sepúlveda, Yovani Alexis; Contreras Pérez, David Rodrigo; Pastene Navarrete, Edgar Rafael
Se abordó la problemática de la estandarización del propóleos, desde un enfoque basado en el estudio quimiométrico de la correlación entre la composición química y la actividad biológica de muestras recolectadas en diferentes zonas geográfica de la región del Biobío y Araucanía. Se implementó un método espectroscópico de bajo costo para caracterizar muestras crudas de propóleos en función de su composición química. Fueron desarrollados modelos predictivos de actividad biológica para ser utilizados en el control de la producción de productos apícolas. Para desarrollar estos modelos se utilizó la espectroscopia de infrarrojo cercano (NIR) con muestras de propóleos crudas, sin ningún tipo de procesamiento. Los espectros NIR fueron calibrados con los resultados obtenidos por diferentes métodos de referencia, (espectroscópicos y cromatográficos) para algunos compuestos de interés biológico relevante, tal como son el contenido de polifenoles totales, el contenido de flavonoides totales y el contenido de equivalentes de fenetil éster de ácido cafeico (CAPE). Simultáneamente, a partir de los mismos espectros NIR, se desarrollaron modelos predictivos PLS de la bio-actividad “in vitro” que pudieran tener 26 muestras de propóleos determinadas por los métodos tradicionales de inhibición enzimática, como fueron la actividad antioxidante y la actividad antidiabética. La capacidad de predicción simultánea de marcadores químicos responsables de alguna actividad biológica relevante mediante el uso de herramientas quimiométricas permite inferir que es posible abordar la problemática de la estandarización de propóleos de manera rápida, eficiente, automatizable y de bajo costo, siendo esta información útil para la industria apícola y que puede ser extrapolado a otro tipo de investigación de productos naturales.
Desarrollo de técnicas preparativas de separación cromatográficas para confirmar la actividad biológica de las plantas chilenas Peumus boldus y Buddleja globosa mediante la sustracción química de sus compuestos bioactivos.
(Universidad de Concepción, 2020) Torres Vega, Jeniffer Paulina; Vergara Rosales, Carola Andrea
Las plantas medicinales Peumus boldus (boldo) y Buddleja globosa (matico) son ampliamente utilizadas en medicina popular, debido a que producen metabolitos secundarios que serían los responsables de sus actividades biológicas. Los solventes naturales eutécticos profundos (NADES) tuvieron una buena eficiencia para extraer polifenoles desde el matico (verbascosido y 7-O-glucósido de luteolina) siendo el NADES L-prolina: acido cítrico y cloruro de colina: 1.2-propanodiol los solventes más efectivos. Así también para el boldo se obtuvieron buenos resultados para la extracción de alcaloides siendo el NADES Prolina: ácido oxálico el que mostró mayor aumento en la extracción de boldina superando 8 veces a la extracción con metanol. Por otro lado, debido a que no está 100% comprobado la actividad de boldo y matico, es que se decide sustraer selectivamente sus compuestos bioactivos utilizando CPC y refinamento zona de pH-CPC, pudiendo de esta forma aislar los alcaloides (knock-out polifenoles) y los polifenoles (knock-out alcaloides). Un total de 9 alcaloides fueron identificados y 22 polifenoles para el boldo y para el matico se pudo sustraer 3 fracciones denominadas knock-out 1 (extracto que contiene verbascósido como compuesto mayoritario), knock-out 2 (extracto que contiene forsitósido como compuesto mayoritario) y knockdown (extracto reducido en fenilpropanoides) y también se identificaron 17 compuestos, de los cuales 13 es primera vez que han sido reportados. La identidad de estos compuestos se confirmó a través de HPLC-Q-TOF. De los extractos diseñados para el matico se comprobó que el compuesto forsithoside B, tiene un gran poder antioxidante al igual que el verbascosido, por lo que esté compuesto también contribuye a está actividad, con respecto a los ensayos celulares (migración celular) no permitieron evidenciar efectos claros para ninguno de los extractos. Por otro lado, los extractos diseñados de boldo permitieron comprobar que el extracto alcaloideo presenta una citotoxicidad y genotoxicidad moderada y también para la actividad inhibitoria en el ensayo inhibición de la acetilcolinesterasa. Por otro lado, se pudo corroborar que los polifenoles presentes en el boldo serían los responsables de su actividad antioxidante, esto se comprobó en el ensayo cometa en donde estos no tuvieron una genotoxicidad significativa, sino que tienen efectos citoprotectores.
Desarrollo de un sistema Fenton heterogéneo soportado en tanino insoluble de corteza de pinus radiata y su evaluación como proceso de oxidación avanzada en sistema modelo
(Universidad de Concepción, 2016) Romero Carrillo, Romina Patricia; Contreras Pérez, David Rodrigo; Segura Castillo, Cristina del Carmen
En las últimas décadas, la presencia de contaminantes orgánicos en efluentes municipales e industriales ha sido un problema de creciente consideración lo que ha llevado a la búsqueda de métodos eficientes para el tratamiento de la contaminación ambiental abriendo el campo a la investigación de nuevas tecnologías. Entre éstas, los llamados Procesos de Oxidación Avanzada (AOPs) son particularmente importantes, ya que son capaces de degradar completamente y convertir en productos inocuos y/o biodegradables un amplio espectro de compuestos orgánicos e inorgánicos. El proceso Fenton heterogéneo es un AOP, que emplea peróxido de hidrógeno y un sólido contenedor/portador de hierro, se basa en la generación in situ de radicales hidroxilo, los cuales reaccionan rápidamente y en forma no selectiva con cualquier compuesto, debido a su gran capacidad oxidante (E°(∙OH/H2O)= 2.8 V/SHE). En la presente tesis se realizó la modificación de la convencional reacción de Fenton, en un sistema heterogéneo que emplea peróxido de hidrógeno, hierro y un sólido contenedor de dihidroxibencenos, que como señala la literatura conducen y amplifican esta reacción, sin embargo, al ser sistemas en fase homogénea no presentan aplicación en limpieza de contaminantes. De este modo, la ventaja consiste en la utilización de un sólido insoluble en agua, lo que evita la contaminación del efluente con compuestos fenólicos, además de presentar también, un importante valor ambiental al ser obtenido desde un residuo forestal, específicamente de corteza de Pinus radiata. Como resultado de esta investigación se caracterizó el tanino proveniente de la corteza de Pinus radiata con metodologías analíticas desarrolladas y otras rutinarias en el estudio de matrices sólidas. Posteriormente, se evaluó su efectividad como soporte y catalizador de reacción para Fenton heterogéneo con el cual se degradó atrazina en un sistema modelo optimizado, de forma más rápida y efectiva que la reacción de Fenton convencional.
Desarrollo de una plataforma analítica para el estudio de compuestos (poli)fenólicos en frutos de uva, calafate y para metabolómica en plasma de animales de experimentación sometidos a la ingesta aguda de un extracto de fruto
(Universidad de Concepción, 2017) Bustamante Salazar, Luis Alejandro; Mardones Peña, Claudia; Baer von Lochow, Dietrich von; Pastene Navarrete, Edgar Rafael
Se desarrolló un conjunto de métodos de análisis con un enfoque metabolómico dirigido y no dirigido, junto a ensayos de capacidad antioxidante como plataforma analítica para estudios de intervención nutricional. De acuerdo a la estrategia analítica planteada, se caracterizaron frutos de uva de mesa (Vitis vinífera L.) Red Globe, Pink Globe y de calafate (Berberis microphylla), 3 frutos con elevadas concentraciones de polifenoles. Los resultados obtenidos por HPLC-DAD-ESI-MS/MS indican que el fruto de calafate contiene entre 60 a 400 veces más antocianos que en las uvas estudiadas, seguido por ácidos hidroxicinámicos y flavonoles (45 y 15 veces, respectivamente), por lo que se diseñó un ensayo de ingesta aguda usando calafate. Con el fin de elaborar un extracto liofilizado de Calafate enriquecido en polifenoles, se modificó la extracción usando etanol potable y ácido fórmico, produciendo un extracto seco de calafate que contiene 265.26 μmol de polifenoles por gramo. Una vez producido un lote homogéneo de extracto liofilizado, se administraron 300 mg/kg de éste a 5 grupos de gerbos (n=3). Transcurridas 1, 2, 4, 8 y 12 horas, se extrajo entre 600 y 1000 μL de sangre mediante punción del plexo retroorbital. Un grupo control (n=3) usado como tiempo 0 se incluyó en el diseño. Se logró obtener plasma sin hemólisis y los animales no fueron sacrificados. A partir de los plasmas obtenidos, se cuantificaron mediante un método GC-MS/MS validado más de 40 productos de metabolización de polifenoles presentes en calafate, análisis metabolómico no dirigido mediante UPLC-QTOF y ensayos de capacidad antioxidante en microplaca. Los resultados cuantitativos obtenidos por GC-MS/MS muestran aumentos de 9 compuestos asociados al consumo del extracto de calafate. Luego de 1 y 2 horas los compuestos 1,4-dihidroxibenceno, ácidos 3,4-dihidroxifenilacético, 4-hidroxicinámico, 3,5-dimetoxi-4-hidroxibenzoico y 3-metoxi-4-hidroxibenzoico muestran una tendencia al alza, mientras que se observó un aumento significativo de los ácidos 3-hidroxicinámico y 3-metoxi-4-hidroxifenilacético. Además, los ácidos 3-hidroxifenilacético y fenilacético muestran aumentos significativos luego de 4 y 8 horas de administrado el extracto. El análisis metabolómico no dirigido de las mismas muestras de plasma revela un cambio significativo de 20 compuestos durante los tiempos ensayados. De estos, uno se identificó como adenosina monofosfato y 6 como metabolitos derivados del consumo del extracto de calafate. Los compuestos cumaroil-quinolactona y derivados sulfatados de ácido (iso)vaníllico y un isómero de ácido cafeico aumentan significativamente luego de 1 y 2 horas de administrado el extracto de calafate. Los derivados sulfatados de un segundo isómero de ácido cafeico y ácido (iso)ferúlico aumentan significativamente solo luego de 1 hora y un metoxicatecol-sulfato aumenta luego de 2 horas. Además, el mismo ácido (iso)ferúlico aumenta nuevamente luego de 12 horas de administrado el extracto. El ensayo ORAC-FL revela un aumento significativo luego de 1 hora, mientras que el ensayo CUPRAC lo alcanza a las 4 horas de administrado el extracto de calafate. Los resultados de Fenoles totales exhiben un aumento significativo a las 1, 4 y 12 horas, relacionándose con los incrementos de los resultados anteriores
Desarrollo de una plataforma científica tecnológica para la identificación de compuestos bioactivos desde arrayán (luma apiculata) y evaluación del efecto de la nanoencapsulación sobre su bioaccesibilidad.
(Universidad de Concepción, 2020) Carrasco Sandoval, Jonathan; Baer von Lochow, Dietrich von; Aranda Bustos, Mario Antonio
Las Enfermedades Crónicas No Transmisibles (ECNT) son la principal causa de morbimortalidad del país y representan un problema nacional e internacional de salud pública. Como resultado, muchas especies nativas/autóctonas han sido estudiadas por su potencial fuente de compuestos fenólicos, los cuales pueden contribuir a la prevención y/o tr7atamiento de dichas enfermedades. Dentro de las especies nativas reconocidas por sus propiedades medicinales se encuentra el arrayán (Luma apiculata), cuyos compuestos bioactivos presentes en el fruto y la hoja podrían ser un aporte relevante para disminuir el riesgo de padecer ECNT. Sin embargo, los estudios reportados de esta especie son muy escasos. En consecuencia, el presente trabajo de investigación tuvo como objetivo principal desarrollar metodologías químico-analíticas para obtener datos científicos que sustenten la característica funcional del fruto y hoja del arrayán y preservar los compuestos bioactivos identificados mediante el empleo de la nanotecnología. Como paso previo al trabajo con arrayán, se desarrolló y optimizó un proceso de extracción asistida de ultrasonido de compuestos fenólicos desde semilla de quinoa. Basándose en este procedimiento, fue establecido y optimizado el proceso de extracción de dichos compuestos desde frutos y hojas de arrayán mediante extracción asistida por ultrasonido en baño ultrasónico. Esta optimización contempló un diseño factorial completo y un diseño central compuesto. Con las condiciones de extracción optimizadas, se evaluó la capacidad antioxidante de los extractos crudos y extractos ricos en compuestos fenólicos obtenidos por adsorción selectiva sobre la resina polimérica Amberlita XAD-7. La capacidad antioxidante se evaluó mediante dos metodologías: 2,2- Difenil-1- picrilhidrazilo (DPPH) y capacidad antioxidante reductor del hierro (FRAP). Además, se determinó el contenido de fenoles totales mediante la metodología de Folin-Ciocalteu (TPC). De acuerdo con los ensayos realizados, quedó en evidencia que los extractos de fruto y hoja de arrayán presentan una elevada concentración de compuestos fenólicos y una alta capacidad antioxidante, en especial, los extractos ricos en compuestos fenólicos. Para establecer el perfil fenólico de los extractos crudos, se implementó un método por cromatografía líquida de ultra-alta eficiencia (UHPLC) acoplada a espectrometría de masas (MS). El análisis cromatográfico, reveló la presencia de siete compuestos fenólicos en el extracto crudo de fruto de arrayán (quercetin 3-β-D glucósido, miricetina, quercetina, ácido p-cumárico, kaempferol glucósido, ácido gálico y kaempferol) y cinco compuestos fenólicos en el extracto crudo de hoja (quercetina 3-ß-D-glucósido, kaempferol 3-glucósido, miricetina, quercetina y ácido gálico). Considerando el perfil fenólico y el efecto antimicrobiano reportado para algunos de los compuestos fenólicos identificados, se determinó la actividad antiviral de extractos crudos (30% etanol) sobre el virus de la hepatitis A y norovirus murino, principales virus entéricos asociados a contaminación alimentaria. El extracto de hoja presentó un efecto antiviral significativo sobre ambos virus, mientras que el extracto de fruto tuvo un efecto moderado sobre el virus de la hepatitis A. Luego de establecer el perfil fenólico, estándares de los compuestos fenólicos puros fueron sometidos a un proceso de digestión gastrointestinal in vitro para estudiar la bioaccesibilidad de dichos compuestos. Paralelamente, se evaluó la potencialidad de tres sistemas nanoparticulados (nanopartículas de zeina, zeína recubierta de alginato y zeína recubierta de complejo alginato/quitosano), los cuales fueron obtenidos mediante los métodos de nanoprecipitación y deposición electrostática. La fracción bioaccesible de los compuestos bioactivos fue determinada mediante cromatografía líquida de alta eficiencia asociada a detección UV (HPLC/UV). Los compuestos fenólicos presentaron una limitada bioaccesibilidad, que varió entre un 3.4 y 16.1%, mientras que los tres sistemas nanoparticulados incrementaron significativamente la bioaccesibilidad de todos los compuestos fenólicos, en especial, las nanoparticulas de zeina recubiertas con complejo de alginato/quitosano, la cual varió entre un 65.8 y 84.0%. Finalmente, se implementó una plataforma científica-tecnológica por HPTLC/(bio)autografía/MS para detectar e identificar en los extractos crudos de fruto y hoja de arrayán compuestos con actividad antioxidante e inhibitoria sobre las enzimas α-glucosidasa y acetilcolinesterasa, consideradas como blancos terapéuticos para tratar la diabetes mellitus tipo 2 y enfermedades neurodegenerativas, respectivamente. El extracto de hoja sólo presentó bandas con actividad antioxidante, mientras que el extracto de fruto presentó un compuesto con marcada actividad antioxidante e inhibitoria sobre ambas enzimas, el cual fue identificado tentativamente mediante la interfaz TLC-MS como fraxetina (hidroxicumarina). Estos resultados permiten sustentar la característica funcional del fruto y hoja de arrayán, además de demostrar el potencial de la nanotecnología (sistemas nanoparticulados) en la preservación de los compuestos responsables de dicha funcionalidad.
Efecto benéfico del fruto de calafate sobre factores de riesgo asociados a enfermedad cardiovascular, mediante un ensayo de intervención nutricional y una estrategia metabolómica basada en UHPLC-QTOF/MS.
(Universidad de Concepción, 2022) Olivares Caro, Lia Paz; Mardones Peña, Claudia; Radojkovic Navarro, Claudia Pamela
La enfermedad cardiovascular corresponde a una de las primeras causas de muerte en Chile y en el mundo, siendo un problema de salud pública. Se ha descrito que los polifenoles podrían participar en la prevención de las enfermedades crónicas a través de una disminución del estrés oxidativo. En esta tesis, desarrollando un estudio metabolómico basado en UHPLC QTOF-MS complementado con ensayos in vitro e in vivo y la determinación de marcadores proteicos de estrés oxidativo e inflamación, se construyó una plataforma para el estudio holístico del efecto del consumo de calafate, en el contexto de la patología cardiovascular, siendo este fruto rico en polifenoles. Como resultado hemos demostrado que el extracto de calafate es capaz de disminuir el estrés oxidativo en un modelo de células endoteliales y en LDL humana, así como también provocar un cambio en el metaboloma de ratones alimentados con una dieta alta en grasa, cambios que son asociados al efecto protector de la ingesta de calafate frente a factores de riesgo de la patología cardiovascular. El estudio metabolómico incluyó el análisis de muestras de plasma y de tejido cardiaco, encontrando que el efecto es a nivel de parámetros asociados a estrés oxidativo, disfunción endotelial y peroxidación lipídica, activando el ciclo de Krebs y la oxidación de ácidos grasos.
Perfiles de derivados de ácidos hidroxicinámicos y alcaloides en frutos de calafate (Berberis ssp.) y otros frutos de la Patagonia mediante HPLC-DAD-MS/MS en relación a su diversidad genética y distribución geográfica.
(Universidad de Concepción, 2013) Ruiz Muñoz, María Antonieta; Mardones Peña, Claudia
La promoción de una vida saludable es una estrategia que ha cobrado gran importancia en la actualidad, enfocada en la prevención de la obesidad y sobrepeso que afecta a altos porcentajes de la población, debido a las enfermedades crónicas no transmisibles que pueden producirse como consecuencia de dichos desordenes alimentarios. Dentro de este punto, se ha promovido el consumo de alimentos saludables, donde juegan un rol importante los berries, debido a su alto contenido de compuestos fenólicos, a los cuales se les ha atribuido efectos beneficiosos para la salud. El calafate (Berberis microphylla) es un berry nativo de la Patagonia Chilena y Argentina, el cual se caracteriza por ser una baya ovalada de color rojizo-azulado oscuro debido a su alto contenido de antocianos, y con altos niveles de capacidad antioxidante. Es una planta silvestre que no se cultiva, pero que ha sido utilizada desde tiempos remotos para la preparación de bebidas y mermeladas con su fruto y de colorantes con su raíz. Estudios previos han revelado que el fruto es una fuente importante de compuestos fenólicos, específicamente antocianos, sin embargo no se ha estudiado la diversidad de sus concentraciones ni la distribución de estos compuestos fenólicos en frutos obtenidos en diferentes latitudes. Tampoco existe información sobre la variabilidad genética de las poblaciones que conforman la especie. No se ha reportado en literatura el estudio de los perfiles y el contenido de derivados de ácidos hidroxicinámicos presentes en su fruto, compuestos responsables de interesantes efectos biológicos. Por otro lado, si bien se reportó la presencia de alcaloides en otras estructuras de la planta, no se ha encontrado información que indique niveles de dichos alcaloides en su fruto. En esta investigación se aborda el estudio de estos compuestos y su distribución de acuerdo a la zona de obtención de la muestra. Junto con ello, se estudian los perfiles de antocianos y flavonoles en un número alto de muestras obtenidas en distintas regiones de la Patagonia sur del país, con el objetivo de dar una explicación a las posibles diferencias en los perfiles de compuestos fenólicos observados. Con este objetivo, fue necesario desarrollar una estrategia analítica que permitiese la extracción, separación cromatográfica y detección adecuada de cada uno de los compuestos de interés. Para ello se usó columnas de fase mixta en el caso de los derivados hidroxicinámicos y columnas Extrelut en el caso de los alcaloides. Los gradientes de separación cromatográfica fueron optimizados utilizando como fases móviles, sistemas de solventes compatibles con detección mediante espectrometría de masas (MS/MS), para lo cual las condiciones también debieron ser optimizadas. También fue necesaria la caracterización mediante RMN de moléculas que no lograron serlo por espctrometría de masas. En forma paralela, fueron estudiados los perfiles de antocianos, flavonoles y derivados de ácidos hidroxicinámicos de otros berries magallánicos pertenecientes a familias Grossulariaceae, Ericaceae, Rosaceae, Myrtaceae y Onagraceae. Los resultados cuantitativos de los perfiles de compuestos fenólicos y actividad antioxidante de frutos de calafate de diferente origen geográfico y diferentes años de recolección, fueron abordados mediante herramientas quimiométricas. Dichos resultados fueron contrastados con datos de diversidad genética obtenida para las mismas muestras, siendo ambos concordantes, pudiendo concluir que las diferencias observadas serían mejor explicadas por factores ambientales y no genéticos. Por otro lado, los resultados comparativos con otros frutos magallánicos muestran que los niveles de compuestos fenólicos en calafate fueron mayores que los observados para frutos que crecen en las mismas zonas que éste, pudiendo clasificar al calafate como un “super fruto” por su alto potencial nutracéutico.

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