Valoración de las propiedades biológicas de las MSCs equinas aisladas de diferentes tejidos y su potencial uso terapéutico en endometritis en yeguas.
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Date
2020
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Publisher
Universidad de Concepción.
Abstract
El uso de terapias en base a células madre mesenquiales (MSC), está
ampliamente descrito en equino, sin embargo, la mayoría de estas terapias se
basan en el tratamiento de lesiones musculo esqueléticas, y en menor medida
como uso potencial en afecciones reproductivas. En este estudio se evaluó el
efecto de dos fuentes diferentes MSC obtenidas a partir del mismo donante sobre
sus principales características biológicas in vitro y sus propiedades anti
inflamatorias y anidamiento in vivo en yeguas con endometritis inducida post
monta (PMIE).
Se aislaron MSC equinas desde endometrio y tejido adiposo (ET-MSC y AT-MSC
respectivamente) a partir de los mismos donantes. Las células mostraron rasgos
característicos de MSC incluyendo la adherencia al plástico, marcadores de
superficie, potencial de migración, así como la diferenciación mesodérmica
clásica, además de lograr diferenciaciones neurogénica y cardiomiogénica. Se
evaluó la influencia del origen celular en su perfil trascriptómico. Para esto se
aisló y secuenció el ARN celular y se obtuvieron vesículas extracelulares (VE) a
partir de un medio de cultivo celular libre de VE, y se analizó su carga de
microARN (miARN) mediante secuenciación. Se analizó y comparó la expresión
diferencial de ARNm y miARN-EV, así como las vías y procesos más
representados en cada origen celular. Se identificaron un total de 125 genes
regulados positivamente, 51 regulados negativamente y 31 miARN expresados diferencialmente entre células de ambas fuentes. Sobre la base de la
secuenciación del ARNm, las ET-MSC mostraron una mayor expresión de genes
involucrados en las vías de señalización Hippo, TGF-β y pluripotencia. Junto con
esto, las vías involucradas en la reorganización de la matriz extracelular fueron
las más representadas en la carga de miARN de las VE secretadas por ET-MSC.
El nicho desde el que se originó la MSC definió el perfil transcriptómico de las
células, incluida la secreción de VE específica de linaje para garantizar una
comunicación y homeostasis adecuada.
Posteriormente se evaluó y comparó el potencial uso de MSC de ambas fuentes
como herramientas antiinflamatorias para PMIE, para esto se infundieron
intrauterinamente (IU) MSC marcadas en yeguas con PMIE para evaluar su
acción antiinflamatoria y anidamiento. Se indujo PMIE en nueve yeguas
ginecológicamente sanas mediante la infusión IU de 500 millones de
espermatozoides muertos en solución salina. Se analizaron marcadores de
inflamación en lavados uterinos y biopsias antes (fase I) y 3 h después de la
infusión de espermatozoides (fase II). Las mediciones llevadas a cabo fueron:
conteo de células polimorfonucleres (PMN), proteínas IL-6 y TNF-α (ELISA en los
lavados) e inmunotinción en biopsias, transcritos de IL-1α, 6, 8, 10, TNF-α y COX
2 (RT-qPCR de lavados). A las 24 h después de la deposición de
espermatozoides (fase III), se infundio a las yeguas 20 ml IU de solución salina
que contenía 2× 107 AT-MSC (n = 3, grupo 1) o ET-MSC (n = 3, grupo 2). Las
células se marcaron previamente con el éster succinimidíl diacetato de carboxifluoresceína (CFDA SE). Un tercer grupo (n = 3) recibió solo 20 ml de
solución salina estéril. Después de 48 h se realizó otra biopsia / lavado y se
analizaron los mismos parámetros descritos anteriormente. Para evaluar el
anidamiento, se tomaron biopsias adicionales en los días 10 y 30 post inoculación
de MSC y se analizaron mediante microscopía confocal. Los espermatozoides
muertos en solución salina aumentaron notablemente los recuentos de PMN, la
expresión de IL-6 y TNF-α en el ELISA (p <0,05) y la inmunotinción. En la fase III
se encontró una reducción significativa (p <0,0001) de PMN en todas las
muestras, incluidas las yeguas control. Mediante ELISA se detectó una
disminución (p <0,05) de IL-6 y TNF-α, en los grupos que recibieron MSC, pero
no en el grupo control. En el grupo tratado con AT-MSC, se encontró una
disminución significativa en la expresión de (IL-1α, p = 0,0003; IL-6 p 0.04; IL-8,
p = 0.006, TNF-α p = 0.004). La expresión de IL-10 y COX-2 se mantuvo sin
cambios (p = 0,08). En las yeguas que recibieron ET-MSC, IL-6, IL-8 y TNF-α
disminuyeron significativamente (p = 0.01), IL-10 aumentó (p = 0.009), mientras
que COX-2 e IL-1α no cambiaron significativamente su expresión. Mientras que
el análisis de anidamiento, el marcaje con CFDA se encontró con moderación en
todas las muestras analizadas hasta el día 30, principalmente en el
compartimento estromal del endometrio. No se encontraron diferencias en el
patrón de anidamiento entre los orígenes celulares. La inoculación de MSC
redujo significativamente la inflamación independientemente del origen de las
células y que las células realizan un recorrido limitado detectable después de un mes de infusión. Estos hallazgos pueden ser de ayuda para el diseño de nuevas
terapias antiinflamatorias de enfermedades uterinas en yeguas.
Description
Tesis para optar al grado de Doctor en Ciencias Veterinarias.
Keywords
Caballos - Enfermedades - Chile, Caballos - Chile, Endometritis