Determinación de la estructura del complejo Octarrelina V.1-αRep mediante cristalización por contradifusión y el efecto de mutantes de prolina en su formación.
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Date
2019
Authors
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Publisher
Universidad de Concepción.
Abstract
Octarrelinas son proteínas artificiales de más de 200 aminoácidos,
diseñadas de novo con el fin de adoptar una estructura repetitiva (βα)8 conocida
como TIM-barrel. Gracias a la técnica de evolución dirigida, una versión de la
proteína diseñada in silico, Octarrelina V, incremento su solubilidad y estabilidad
sin ver modificada su estructura. Esta nueva versión de la proteína artificial,
Octarrelina V.1, presenta dentro de las 16 mutaciones introducidas, 4 residuos
de prolina en su cadena aminoacídica. La estructura parcialmente resuelta
mediante cristalización por difusión de vapor muestra que la proteína diseñada
no se plegaba de acuerdo a lo esperado. Sin embargo, la presencia inesperada
de los residuos de prolina, despertó el interés para estudiar este residuo y la
relación que puede tener con las características finales obtenidas en Octarrelina
V.1. Por ello la obtención de un modelo más detallado de Octarrelina V.1 en
conjunto con experimentos en mutante de prolinas puede entregar información
sobre la influencia de este residuo en las características obtenidas. Para lograr
esto, se buscó obtener una estructura más completa del Octarrelina V.1 utilizando
el ayudante de cristalización αRep mediante el método de contradifusión.
Además, mutantes de Octarrelina V.1 y V con ausencia y presencia de prolinas,
respectivamente, se estudiaron mediante su interacción con αRep para obtener
una mayor información de este residuo. Las proteínas Octarrelina V.1 y αRep lograron ser purificadas con altos
rendimientos y grados de pureza aceptables para la posterior formación de
complejos in vitro. La correcta purificación del complejo permitió establecer
experimentos de cristalización por contradifusión en capilares. Los cristales
obtenidos por esta técnica fueron difractados por rayos X y la data obtenida
permitió resolver la estructura a través de reemplazo molecular. Gracias a estos
datos, la estructura alcanzada reveló un 90% de los aminoácidos de la secuencia
de Octarrelina V.1, aumentando lo anteriormente resuelto mediante cristalización
por difusión de vapor.
Description
Tesis para optar al grado de Magíster en Bioquímica y Bioinformática.
Keywords
Prolina, Cromatografía, Proteínas, Análisis