Modificación genética de la ruta de glicosilación en células epiteliales de glándula mamaria.
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Date
2021
Authors
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Publisher
Universidad de Concepción
Abstract
En la actualidad existen diversos sistemas para la expresión de proteínas
recombinantes de uso terapéutico, y su elección dependerá del tipo de proteína
que se necesita expresar ya que el sistema debe brindar un correcto
procesamiento post-traduccional de las moléculas, como el plegamiento de la
estructura terciaria y cuaternaria, la glicosilación y sulfatación. Estas
modificaciones garantizarán su funcionalidad biológica, con características
similares a las de la proteína nativa. La transformación in situ de las células
epiteliales de la glándula mamaria de cabras utilizando vectores virales para la
modificación genética de hembras adultas, se presenta como una alternativa
factible para la expresión de proteínas recombinantes con estructura terciaria y
cuaternaria complejas. Además, en este sistema la proteína recombinante se
secreta a la leche, que es un fluido de fácil recolección diaria. Sin embargo, las
proteínas expresadas presentan un patrón de N-glicosilación característico y
definido, que consiste en la presencia mayoritaria de estructuras bi-antenarias y
con presencia de un único enlace de ácido siálico terminal. Si bien este patrón es
funcional para la actividad biológica de algunas proteínas terapéuticas, no es
suficiente para proteínas como la eritropoyetina humana, que presenta un patrón
de glicosilación de tipo complejo, tetra-antenario y tetra-sialilado. Por lo tanto, la
eritropoyetina expresada en células epiteliales de glándula mamaria de cabras
no presenta actividad biológica debido al patrón de N-glicanos que se añade
usando este sistema.
El objetivo de esta tesis fue modificar in vivo la ruta de glicosilación de las células
epiteliales de glándula mamaria de cabra, utilizando la eritropoyetina humana
como proteína modelo. Para esto, se utilizaron vectores adenovirales que
contienen la secuencia de esta hormona fusionada con al fragmento de la
inmunoglobulina G humana Fc (EPOFc). Además, dichos vectores contienen las
secuencias de glicoenzimas claves para la obtención de glicanos ramificados y
terminados en ácido siálico. Las glicosiltransferasas utilizadas fueron las N acetilglucosaminiltransferasas IV y V (GNT-IV, GNT-V), además, de
sialiltransferasa 1 (ST6N). Se transdujeron las glándulas mamarias de cabras con
los vectores EPOFc como control y con la combinación EPOFc+GNT-IV,
EPOFc+ST6N, EPOFc+GNT-V+ST6N. Los análisis de los patrones de
glicosilación de las distintas variantes mostraron diferencias relevantes en
comparación al control. En todas las variantes obtenidas se observan estructuras
con un mayor grado de ramificación. Además, las variantes que fueron
expresadas en conjunto con ST6N presentaron un aumento de estructuras que
contienen ácido siálico en comparación a EPOFc, sin embargo, ninguna de ellas
mostró un incremento significativo de la actividad hematopoyética medida como
porcentaje de hematocrito. Estos resultados preliminares nos permiten demostrar
que es posible modificar la ruta de glicosilación de las células epiteliales en la
glándula mamaria de cabra.
Description
Tesis presentada para optar al grado de Doctora en Ciencias Biológicas Área Biología Celular y Molecular.
Keywords
Células Epiteliales, Glándulas Mamarias, Glicosilación, Monosacáridos, Bienestar y Salud