Tesis Doctorado
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Browsing Tesis Doctorado by Author "Castro Rebolledo, Fidel Ovidio"
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Item Identificación de vesículas extracelulares y su carga proteica, secretadas por los túbulos de almacenamiento espermático del oviducto de hembras de pavo criollo (Meleagris gallopavo), y su efecto sobre espermatozoides conservados in vitro.(Universidad de Concepción, 2024) Rubilar Quezada, Makarena Aurora; Castro Rebolledo, Fidel OvidioLas hembras aviares, como las pavas, poseen la particularidad de presentar una “fertilización sostenida” en el tiempo, dependiente de la capacidad de la hembra para almacenar y liberar esperma en el transcurso de los ciclos ovulatorios, capacidad que es conferida por estructuras especializadas, llamadas “túbulos de almacenamiento espermático” (TAE), localizadas en la unión útero vaginal (UUV). Los TAE permiten asegurar la viabilidad de los espermatozoides tras la conservación por períodos prolongados de hasta 70 días en pavas. Sin embargo, a pesar del gran interés práctico que tendría para su conservación in vitro, las condiciones bioquímicas, mecanismos fisiológicos y la base genética que permiten la conservación y supervivencia de los espermatozoides aviares son prácticamente desconocidas. El líquido oviductal ha sido indicado como el principal responsable para que espermatozoides presenten un entorno óptimo durante los eventos reproductivos, identificándose a las vesículas extracelulares (EVs) como su principal constituyente. Las EVs son definidas como mediadores en la comunicación intercelular mediante el transporte de múltiples componentes moleculares bioactivos desde la célula de origen hacia la célula receptora, transportando proteínas, lípidos, ARN y ADN. De éste modo se postula que el contenido de las EVs de la UUV, donde están los TAE, del oviducto de hembras de pavo criollo (Meleagris gallopavo), inhibe la movilidad sin afectar la viabilidad espermática. Frente a lo cual se buscó establecer la relación entre el fotoperiodo estacional y las temporadas reproductivas, para determinar la concentración y contenido proteico de las EVs procedentes de la UUV del oviducto de hembras de pavo criollo, en diversas condiciones estacionales y reproductivas, probando la influencia de las EVs sobre la movilidad y viabilidad espermática in vitro. Para ello se efectuaron análisis de perfiles séricos de hormonas sexuales en hembras (estrógeno y progesterona) y machos (testosterona), mediante la técnica de radioinmunoensayo (RIA), a partir de lo cual se determinaron las temporadas de muestreo, de acuerdo al fotoperiodo y estado ovulatorio de las hembras. Se extrajeron EVs, mediante la técnica de ultracentrifugación, a partir del fluido oviductal (in vivo) y el sobrenadante de cultivos celulares (in vitro) de las regiones oviductales del M (sin TAE) y la UUV (con TAE), de acuerdo a las etapas reproductivas de fotoperiodo negativo (FN), fotoperiodo positivo (FP) y FP en estado ovulatorio (FP en O). Se efectuó una caracterización biométrica por medio de las técnicas de NTA y TEM, y se efectuó una caracterización molecular mediante espectometría de masas. Una vez determinadas las muestras de EVs con mejores resultados bioactivos, correspondiente a las muestras in vivo de M y la UUV en FP en O, se efectuaron pruebas de interacción, movilidad y viabilidad espermática mediante la co-incubación de EVs con espermatozoides, a partir de tres concentraciones de EVs (4 x 107, 4 x 108 y 4 x 1010 partículas/mL) y 4 puntos en el tiempo (2, 4, 6 y 10 horas de co-incubación). Empleando las técnicas de visualización con PKH para interacción, microscopía para evaluación de movilidad, y la tinción de eosina y visualización por microscopía para viabilidad. Los resultados permitieron señalar que los picos de hormonas sexuales se desarrollan entre fines de invierno e inicios de primavera, correspondiendo al período de mayor interés reproductivo para la especie. Se pudo establecer que el tamaño de las EVs in vivo (en FN, FP y FP en O) dependiente del estado ovulatorio y es independiente del fotoperiodo y el tejido, mientras que la concentración es dependiente del fotoperiodo y el tejido. Respecto al tamaño de las EVs de muestras in vivo e in vitro (en FP con y sin O), es dependiente del estado ovulatorio y el origen de la muestra, mientras que la concentración sólo depende del origen de la muestra. En cuanto al contenido proteico de las EVs, depende principalmente del origen de las muestras, validándose el método de lavado oviductal (in vivo) por sobre el método in vitro, observándose un diferencial de expresión (ANXA5, STX2, LZTFL1, STXBP1, ATP2B4, RAB34, APOB, TTLL3) respecto a las funciones biológicas de movilidad espermática y reacción acrosomal. En relación a la coincubación de EVs de la UUV con espermatozoides, se pudo establecer la internalización a partir de las 2 hrs, con conservación de la viabilidad y reducción de la movilidad en función del tiempo. De éste modo se puede establecer que existen ciclos reproductivos definidos de acuerdo al fotoperiodo estacional, con EVs secretadas en función del estado reproductivo, origen de la muestra y tejido oviductal, con mayor fidelidad de la realidad secretora a partir de muestras de lavado oviductal, con EVs que transportan proteínas importantes para la función espermática, colaborando positivamente en su viabilidad y movilidad.